一种合成西那普肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成西那普肽的方法。
【背景技术】
[0002] 西那普肽是一种人工设计的21肽，于2012年3月被美国FDA批准上市，临床用于 治疗新生儿呼吸窘迫综合征，其氨基酸肽序如下：
[0003]H-Lys1-Leu2-Leu3-Leu4-Leu5-Lys6-Leu7-Leu8-Leu9-Leu10-Lys11-Leu12-Leu13-Leu14-Leu15-Lys16-Leu17-Leu18-Leu19-Leu20-Lys21-〇H
[0004] 新生儿呼吸窘迫综合征，又称新生儿肺透明膜病，指新生儿出生后不久即出现进 行性呼吸困难和呼吸衰竭等症状，主要是由于缺乏肺泡表面活性物质所引起，导致肺泡进 行性萎陷，患儿于生后4~12小时内出现进行性呼吸困难、呻吟、发绀、吸气三凹征，严重者 发生呼吸衰竭。发病率与胎龄有关，胎龄越小，发病率越高，体重越轻病死率越高。
[0005] 现有关于西那普肽的合成方法国内外均有报道。美国专利US5260273采用基因工 程进行制备，该方法工艺成本较高且繁琐。限制了西那普肽的生产效率。为此，我国专利 CN102850440A以及CN104098656A均公开了一种西那普肽的合成方法，以此降低成本和工 艺繁琐程度。其中CN104098656A公开的是按照西那普肽C端到N端的肽序逐一合成的技 术方案，但是这种合成策略一方面周期长，另一方面总收率较低，为47. 9% ;CN102850440A 公开了一种片段合成策略，但是根据其记载的技术方案合成的多肽和最终的西那普肽并不 一致，而且其总收率更低，仅为40%。
[0006] 不同的合成策略对最终产品的纯度、杂质含量和收率有很大影响，如何在保证纯 度和收率的前提下，尽可能的降低合成工艺的复杂程度、杂质以及缩短合成周期，是当下技 术人员的研宄重点。
【发明内容】
[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成西那普肽的方法，使得本发明所述方 法能够显著提高西那普肽合成的总收率，并保证西那普肽具有较高纯度和较低的单一杂质 含量，同时缩短合成周期。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0009] 一种合成西那普肽的方法，包括以下步骤：
[0010] 步骤1、将保护的LyS与树脂偶联，获得在Lys的N端及其侧链上偶联有保护基、在 其C端偶联有树脂的肽树脂1 ;
[0011] 步骤2、将在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C 端与肽树脂1的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQID NO: 2所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的肽树脂2 ;
[0012] 步骤3、将在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C 端与肽树脂2的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQID NO: 3所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的肽树脂3 ;
[0013] 步骤4、将在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C 端与肽树脂3的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQID NO: 4所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的肽树脂4 ;
[0014] 步骤5、将在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列N端偶联有保护基的多肽片段1的C 端与肽树脂4的N端进行偶联，而后将保护的Lys再与片段1的N端偶联，获得在SEQID NO: 5所示氨基酸序列N端、Lys侧链上偶联有保护基，在C端偶联有树脂的西那普肽树脂；
[0015] 步骤6、西那普肽树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到西那普肽粗品，粗品纯 化转醋酸盐，获得西那普肽成品。
[0016] 西那普肽主链氨基酸有21个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有合 适的片段方法才能保证较高的西那普肽的总收率以及纯度，同时又能降低杂质的产生。为 此，申请人根据长期的试验研宄，提出了本发明所述方法来制备西那普肽，在保证纯度的前 提下，进一步提高总收率以及降低合成方法的杂质的产生。
[0017] 在本发明所述方法中，按照西那普肽主链C端至N端的氨基酸顺序交替合成Lys 和（Leu) 4，以西那普肽主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
[0018] H-Lys1-Leu2-Leu3-Leu4-Leu5-Lys6-Leu7-Leu8-Leu9-Leu10-Lys11-Leu12-Leu13-Leu14-Leu15-Lys16-Leu17-Leu18-Leu19-Leu20-Lys21-〇H
[0019] SEQIDN0:1所示氨基酸序列即为上式中编号2-5、7-10、12-15、17-20的多肽序 列，SEQIDN0:2所示氨基酸序列即为上式中编号16-21的多肽序列，SEQIDN0:3所示氨 基酸序列即为上式中编号11-21的多肽序列，SEQIDN0:4所示氨基酸序列即为上式中编 号6-21的多肽序列，SEQIDN0:5所示氨基酸序列即为上式中编号1-21的多肽序列。
[0020] 本发明合成的肽树脂2是在SEQIDNO: 2所示氨基酸序列基础上，在其N端、Lys 侧链上分别偶联有保护基，在其C端偶联有树脂；合成的肽树脂3是在SEQIDNO: 3所示氨 基酸序列基础上，在其N端、Lys侧链上分别偶联有保护基，在其C端偶联有树脂；合成的肽 树脂4是在SEQIDNO:4所示氨基酸序列基础上，在在其N端、Lys侧链上分别偶联有保护 基，在其C端偶联有树脂；合成的西那普肽树脂是在SEQIDNO: 5所示氨基酸序列基础上， 在其N端、Lys侧链上分别偶联有保护基，在其C端偶联有树脂；
[0021] 本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、 羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生 成杂质，而被保护基保护的氨基酸称为保护氨基酸，如保护的Lys。对于本发明中需要保护 侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及知晓采用常用保护基来保护氨基 酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明以Fmoc保护基保护Lys以及（1^11)4的N 端，以Boc保护基保护Lys的侧链。
[0022] 在合成肽树脂1中，保护的Lys与树脂偶联所形成的肽树脂取代值优选为0. 2~ 1. 0mmol/g肽树脂，更优选的取代值为0. 3~0. 5mmol/g肽树脂。
[0023] 本发明偶联时，每个保护氨基酸或多肽片段用量优选为肽树脂摩尔数的1-6倍， 更优选为2. 5-3. 5倍；所述偶联反应时间优选为60~300分钟，更优选为100~140分钟。
[0024] 在偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联， 这对本领域技术人员来说是公知常识。本发明优选用PIP/DMF(哌啶/N，N-二甲基甲酰胺） 混合溶液脱除N端保护基，混合溶液中含哌啶为10~30% (V)，其余为DMF。去N端保护基 试剂的用量为每克肽树脂5~15mL，更优选的为每克肽树脂8~12mL;去N端保护基时间 为10~60分钟，优选的为15~25分钟。
[0025] 需要说明的是，本发明所述肽树脂指任意个数保护氨基酸或氨基酸按照西那普肽 氨基酸顺序和树脂相连接形成的肽树脂，这其中不仅包括独立权利要求中的肽树脂1-4、西 那普肽树脂，还包括在合成肽树脂1-4、西那普肽树脂过程中形成的肽树脂。
[0026] 作为优选，所述树脂为Trityl-Cl(三苯甲基氯）类树脂或羟基类树脂。更优选地， 所述Trityl-Cl类树脂为Trityl-Cl树脂、4-Methyltrityl-Cl(4-甲基三苯甲基氯）树脂、 4-Methoxytrityl-Cl(4-甲氧基三苯甲基氯）树脂或2-C1Trity-Cl(2-氯三苯甲基氯）树 月旨；所述羧基类树脂为Wang(王）树脂或HMP(对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯）树脂。
[0027] 作为优选，步骤1所述偶联采用偶联试剂偶联，所述偶联试剂为N，N-二异丙基乙 胺（DIPEA)、N，N-二异丙基碳二亚胺/I-羟基苯并三唑/4-N，N-二甲基吡啶（DIC/HOBt/ DMAP)两种之一。其中，进一步优选地，当树脂载体为Trityl-Cl类树脂时，保护氨基酸 Fmoc-Lys(Boc)-〇H与载体树脂的偶联方法为：保护氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-〇H的羧基与树 脂中的C1-代烷基在DIPEA的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸；当载体树脂为羟基 类型树脂时，Fmoc-Lys(Boc) -0H与载体树脂的偶联方法为：Fmoc-Lys(Boc) -0H的羧基与树 脂中的羟基在DIC/HOBt/DMAP的作用下发生酯化反应而接入保护氨基酸。
[0028] 作为优选，步骤2至步骤5所述偶联均采用缩合试剂和活化试剂偶联，所述缩 合试剂优选为N，N-二异丙基碳二亚胺（DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺（DCC)，六氟磷酸 苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱（PyBOP/有机碱）、2-(7_氮杂-1H-苯 并三氮唑-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱（HATU/有机碱）、苯并 三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱（HBTU/有机碱）、0-苯并三氮 唑-N，N，N'，N'_四甲基脲四氟硼酸酯/有机碱（TBTU/有机碱）中的一种。所述缩合试剂 的摩尔用量优选为肽树脂中总摩尔数的1~6倍，更优选为2. 5~3. 5倍。所述活化试剂 为1-羟基苯并三唑（