专利名称：一种用于发酵生产环磷酸腺苷的节杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及一种高产环磷酸腺苷节杆菌及其应用。
背景技术：
环磷酸腺苷是人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，作为细胞内的第二信使，它对糖、脂肪、核酸、蛋白质等的代谢以及合成调节起着重要的作用。临床上用于治疗心绞痛、心肌梗死、心肌炎及心源性休克；对改善风湿性心脏病的心悸、气急、胸闷等症状也有一定的作用；可提高急性白血病结合化疗的疗效，亦可用于急性白血病的诱导缓解； 此外，对老年慢性支气管炎、各种肝炎和银屑病也有一定疗效。环磷酸腺苷也可作为药物中间体制备二丁酰环磷酸腺苷和环磷酸腺苷葡甲胺，提高脂溶性，从而更有效地发挥生理及药理作用。环磷酸腺苷亦可用于畜禽食品添加剂，在离体条件下模拟生长激素的作用，促进畜禽生长，增加优质禽产品产量。环磷酸腺苷的生产方法有化学合成法、酶法和发酵法三种。国内外产业化生产全部采用化学合成法，以一磷酸腺苷为原料，采用高效分离柱进行中间体分离，该方法溶剂损耗量大，收率低，成本高，产量小，且环境污染严重。利用酶法可以高效地催化三磷酸腺苷生成环磷酸腺苷，但是此方法仅仅局限于实验室阶段，离产业化还有一定的距离。目前，国内还没有发酵法制备环磷酸腺苷的报道。在国外，1963年马克曼等在大肠杆菌Crookes株细胞中最早检出了 1. 1纳克/毫升的环磷酸腺苷。1971年，石山等分离筛选了某种小杆菌No. 205 ATCC21376以及数株属于榜状杆菌科的细菌，通过化学诱变成抗药性突变株后，可从葡萄糖直接发酵生成2g/L以上的环磷酸腺苷。1973年，铃木报道，利用烃同化菌玫瑰色石蜡节杆菌ATCC15584菌株，能以正十四烷为碳源，发酵积累1. 4g/L环磷酸腺苷。离子注入技术作为一种生物品种改良的新技术已在诱变育种、植物转基因、生命起源和进化以及环境辐射与人类健康等方面取得了一些重要研究成果。其中，在微生物诱变育种的研究中，离子注入已广泛用于对微生物菌种的诱变育种，并取得了良好效果。离子注入与传统诱变源相比，除了具有能量沉积效应外，还有动量传递、质量沉积及电荷中和与交换效应，是一种将物理诱变和化学诱变特性集于一身的综合诱变方法，能够在低剂量注入、细胞损伤较轻的情况下，强烈地影响生物细胞的生理、生化性能，造成遗传物质的基本单位-碱基的改变，诱发染色体结构变异(余增亮，物理，1997，沈(6) :333-338)。赵洪英 (天津理工学院学报，2001，17(1) :14-17)等用矿离子注入庆大霉素产生菌的成熟孢子，经筛选得到的菌株产抗生素能力提高27. 39%。王纪(微生物学杂志，1998，18 ) :25-28)等通过离子注入诱变筛选得到一株遗传性能稳定的高产菌，得率较出发菌提高55% 60%。 姚建铭(生物工程学报，2000 (16) =478-481)等应用离子注入诱变筛选得到高产花生四烯酸的一株菌株，并应用于大规模生产，其产量比国外专利报道高1倍
发明内容
因此，本发明所要解决的技术问题是提供一株环磷酸腺苷的高产发酵。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种用于发酵生产环磷酸腺苷的节杆菌，该节杆菌的保藏编号为CGMCC No. 3584。这种作为生产菌株的高产环磷酸腺苷的节杆菌的分类命名为节杆菌 (Arthrobacter sp.)A302,目前该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 3584，保藏日期为2010年1月18日。该菌株是通过对土壤筛选到的节杆菌进行低能离子束注入，然后将诱变后的菌株转接于平板培养基中培养，挑选单菌落转接于牛肉膏斜面培养，后经含碳源、氮源、无机盐和水的液体种子培养基和发酵培养基培养从而筛选出的环磷酸腺苷高产菌。CGMCC No. 3584菌株具有下述性质1、菌落形态学特征在固体培养基上菌落呈圆形，湿润，低凸起，表面光滑，直径为约1.5-2mm;有光泽，菌落呈黄色，幼龄菌为浅黄色，随着菌龄增加，菌落呈深黄色2、生理与生化特性菌株为专性好氧菌，厌氧条件不生长；氧化酶反应为阴性，接触酶反应为阳性，硝酸盐还原反应为阳性；该菌的最佳生长温度为30°C，最适pH值为7. 0，可在pH 10. 0下生长；最适的NaCl浓度为(质量比)，在NaCl浓度为5% (质量比)时也能生长；有耐热性(55°〇，加热20分钟)。3、16S rDNA 序列分析CGMCC No. 3584菌株的16S rDNA序列已在GenBank数据库登记，登记号为 GQ141738。将所测序列与GenBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础系统的发育树。结果表明菌株A302与节杆菌(Arthrobacter)的同源性达到99%，因此认定本发明得到的菌株为节杆菌，即节杆菌A302 (CGMCC No. 3584)。4、营养特征该菌能利用葡萄糖、肌醇、山梨醇、木糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、乳糖、鼠李糖；水解尿素，不产生H2S ；喷哚反应为阴性；可水解淀粉，不水解明胶。本发明还提供了上述节杆菌在提高发酵生产环磷酸腺苷的产量中的应用。本发明又提供了一种生产环磷酸腺苷的发酵方法，该方法包括采用上述节杆菌在液体发酵培养基中发酵。在上述发酵方法中，液体种子培养基可以包含碳源1 100g/L，优选为10 30g/L ；氮源1 100g/L,优选为10 30g/L ；无机盐0. 01 100g/L, 1 10g/L ；其余为水。液体发酵培养基可以包含碳源1 100g/L，优选为30 50g/L ；氮源1 100g/L，优选为10 30g/L ；无机盐0. 01 100g/L，10 20g/L ；其余为水。其中，碳源可以选自葡萄糖、木糖、果糖和甘油中的一种或多种；氮源可以选自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、尿素和硫酸铵中的一种或多种；无机盐可以选自钾盐、钠盐、磷酸盐、盐酸盐和硫酸盐中的一种或多种。液体发酵培养基的初始PH可以为4. 5 9. 5，优选为6 8。在上述发酵方法中，发酵温度可以为25 37°C，优选为30 35°C;发酵时间可以为对 120小时，优选为60 100小时。其中，发酵前按照体积比为1 30 100，优选为8 12 100的接种量接种。本发明的有益效果包括1.与传统的辐射法及化学诱变剂相比，离子束诱变具有损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传稳定、易于获得理想新品种等特点。2.本发明的环磷酸腺苷高产菌节杆菌A302 (CGMCC No. 3584)，具有高产性状稳定的特点，该菌株经过10代以上传代，生产环磷酸酸的性能保持稳定。3.本发明的环磷酸腺苷高产菌节杆菌A302(CGMCC No. 3584)能够利用多种碳源和氮源发酵生产环磷酸腺苷，操作方便简单。牛物材料的保藏节杆菌(ArthrcAacter sp. )A302已经于2010年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 3584。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，实施例所描述的具体物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所涵盖的本发明的范围。实施例1以从土壤中分离得到的产环磷酸腺苷的菌株为出发菌株，将经N+离子束诱变(低能离子注入机靶室内真空度为2X 10_4，注入能量为20kev，剂量为5X 1013ions ^nT2. s—1)后的孢子悬浮液经无菌水稀释100倍后，取0. Iml涂布于牛肉膏平板培养基上30°C下培养3 天，从中挑选单菌落在牛肉膏斜面培养2天。转接一环于装有30mL液体种子培养基(葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 3g/L)的500mL摇瓶中，于30°C 下250rpm摇床培养20小时。再转接4mL于装有40mL液体发酵培养基(葡萄糖50g/L， K2HP0410g/L, KH2P0410g/L, MgS04lg/L，尿素 5g/L，蛋白胨 5g/L)的 500mL 摇瓶中，于 30°C下 ^Orpm摇床发酵培养72小时。经过初筛，得到88株比出发菌株产量高的突变株。用同样的条件下进行复筛，最终得到产量最高的菌株A302，环磷酸苷产量最高产量达到2. 4g/L， 比原始菌株的1. 2g/L提高2倍。实施例2将菌株A302从牛肉膏斜面转接一环于装有30mL液体种子培养基(葡萄糖20g/ L，蛋白胨8g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏15g/L，NaCl 3g/L)的500mL摇瓶中，于30°C下250rpm 摇床培养20小时。转接4mL于装有40mL液体发酵培养基(葡萄糖40g/L，K2HP0410g/L, KH2P045g/L，MgS044g/L，尿素 8g/L，蛋白胨 5g/L)的 500mL 摇瓶中，于 32°C下 ^Orpm摇床发酵培养72小时。环磷酸苷产量达到2. Og/L。实施例3将菌株A302从牛肉膏斜面转接一环于装有30mL液体种子培养基(葡萄糖IOg/ L，蛋白胨3g/L，酵母膏4g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 3g/L)的500mL摇瓶中，于30°C下250rpm 摇床培养20小时。转接4mL于装有40mL液体发酵培养基(葡萄糖45g/L，K2HP045g/L,KH2P0410g/L, MgSO4O. 5g/L，尿素 3g/L，蛋白胨 5g/L)的 500mL 摇瓶中，于 30°CT 300rpm 摇床发酵培养72小时。环磷酸苷产量达到3. 6g/L。实施例4将菌株A302连续传10代，在实施例3的培养条件下进行发酵培养，生产环磷酸腺苷。结果表明(见表1和幻，连续10代遗传培养，菌株A302生产环磷酸腺苷的性能稳定。表1连续传1 5代的菌株A302的生产环磷酸腺苷性能
权利要求
1.一种用于发酵生产环磷酸腺苷的节杆菌，该节杆菌的保藏编号为CGMCC No. 3584。
2.根据权利要求1所述的节杆菌在提高发酵生产环磷酸腺苷的产量中的应用。
3.—种生产环磷酸腺苷的发酵方法，该方法包括采用根据权利要求1所述的节杆菌在液体发酵培养基中发酵。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵的液体种子培养基包含碳源 1 100g/L，优选为10 30g/L ；氮源1 100g/L，优选为10 30g/L ；无机盐0. 01 100g/L，优选为1 10g/L ；其余为水。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵的液体发酵培养基包含碳源 1 100g/L，优选为30 50g/L ；氮源1 100g/L，优选为10 30g/L ；无机盐0. 01 100g/L，10 20g/L ；其余为水。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述碳源选自葡萄糖、木糖、果糖和甘油中的一种或多种
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述氮源选自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、尿素和硫酸铵中的一种或多种。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述无机盐选自钾盐、钠盐、 磷酸盐、盐酸盐和硫酸盐中的一种或多种。
9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基的初始 pH为4. 5 9. 5，优选为6 8。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵温度为25 37°C，优选为30 35°C ；发酵时间为M 120小时，优选为60 100小时。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵前按照体积比为 1 30 100，优选为8 12 100的接种量接种。
全文摘要
本发明提供一种用于发酵生产环磷酸腺苷的节杆菌及其应用，该节杆菌的保藏编号为CGMCC No.3584。保藏编号为CGMCC No.3584的本发明的节杆菌A302菌株比出发菌株的环磷酸腺苷产量提高了3倍，该菌株经过10代以上传代，生产环磷酸腺苷的性能保持稳定。
文档编号C12P19/32GK102268385SQ20101019151
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者应汉杰, 柏建新, 熊健, 陈勇, 陈晓春 申请人:南京工业大学