专利名称：一种从枣中提取环磷酸腺苷的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物有效成分提取工艺，具体是一种从枣中提取环磷酸腺苷的工艺。
背景技术：
大枣是鼠李科(Rhamnacene)枣属植物枣树的成熟果实，原产于中国。传统中医理论和现代研究表明，大枣有补中益气、养血安神的作用。大枣营养十分丰富，除含有大量的糖外，还含有环磷酸腺苷和枣黄酮精华素等药用成分，其中环磷酸腺苷是已知植物中含量中最高的。环磷酸腺苷(cAMP)是细胞内的第二信使，通过激活依赖于cAMP的蛋白激酶，把各种调节信息带到细胞内特定的靶部位，发挥调节酶的活性、基因表达、细胞分裂和分化等重要的生理作用，可以抗癌和治疗心血管疾病等。当今分子生物学深入研究表明，作为蛋白激酶激活剂，通过放大激素的作用信号和控制遗传信息的作用，环磷酸腺苷可以在舒张平滑肌、扩张血管、改善肝功能、激活蛋白和对心肌梗塞、冠心病、心源性休克、牛皮癣等的疾病疗效显示出显著的作用，因此其在医疗和保健品等领域显示出极大的应用前景。
目前环磷酸腺苷主要通过化学合成法获得，化学合成法生产的环磷酸腺苷存在成本高和安全性低等问题，从天然植物大枣中提取环磷酸腺苷可以很好解决此类问题。虽然相比其它植物来说，大枣含有较多的环磷酸腺苷，但从其中把环磷酸腺苷提取出来仍然是一件困难的事情，这主要是因为大枣中的环磷酸腺苷含量极微量(含量在万分之五左右)。已经有一些关于分析级测定和小规模的层析提取等报道出现，但由于技术要求苛刻和成本高等因素存在，其大规模工业化生产仍然难于进行。
目前从枣提取纯化环磷酸腺苷的技术基本上都是采用了溶剂浸提和柱层析技术。K Hanabusa等报道了从中国大枣中提取cAMP的方法，是将枣粉5℃溶于水搅拌1h，均化，离心，沉淀溶于水，离心，上清液合并后连续上两次Dowex 1x4型甲酸盐柱，0.05N甲酸洗脱，洗脱液上氧化铝柱后，再上一次Dowex 1x4型甲酸盐型柱，所得组分冻干，最后得到纯度为34％的cAMP，TLC薄层纯化后可得高纯度环磷酸腺苷产品。李明润等在中国申请专利“从枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的工艺”中报道，通过浸泡，匀浆，离心，浓缩和三次阴离子交换柱层析和一次氧化铝柱层析方法，得到冻干粉。综合看来，上述方法比化学合成法是具有成本低和无毒副作用的优点，但仍然有一些缺点第一是对枣原料的破碎处理工艺不当。提取一种有效物质是需要对原料进行充分破碎的，但由于枣中含有大量的糖分，吸水后特别容易糊化，如果大部分糖分没有提取出来前对原料破碎太细比如采用均化、匀浆等工艺手段取汁，就会加重提取汁的混浊，使得用水取汁工艺复杂，工业化困难，因此选择水作浸提剂，枣原料不能破碎的太细，必须有一个合适的破碎程度，才能保证既有效地提取了环磷酸腺苷又不会造成后续的交换柱堵塞；另外若要求对枣进行去核破碎，这一点也会使工业化难度加大。第二，对破碎太细的枣原料，水作为浸提剂在对环磷酸腺苷提取的同时，还会提取过多杂质(如糖分)等，造成后续的柱层析及纯化操作繁杂，效率不高，产品纯度低。如果对水浸提剂或枣原料破碎处理工艺进行适当改进，则会大大提高产品的质量。第三，现有的工艺中对温度要求较苛刻，如操作温度要求在4℃左右，这会增大提取设备的制冷投资。第四，在层析中都使用了氧化铝柱，而洗脱液又选择含强酸液体。由于氧化铝容易与酸特别是强酸(如盐酸)反应，混入洗脱液中，同样会增加后续分离纯化的困难。第五，冻干设备耗资大，生产成本高。第六，生产中没有进行产品的综合利用，对人体有益的以枣黄酮为特征的枣精华素没有提取利用，造成产品单一，生产成本高。因此从提取效率和质量及工业化生产等方面来看，现有的工艺都急需大力改进提高。
发明内容
本发明为了解决现有环磷酸腺苷提取工艺工业化难度大、提取过程繁杂、效率不高、产品纯度低等问题，提供一种提取效率高、纯度高、工艺要求简单、生产成本低能适合工业化的从枣中提取环磷酸腺苷的工艺。
本发明是采用如下技术方案实现的一种从枣中提取环磷酸腺苷的工艺，具体步骤如下(1)、取红枣破碎，加入浸提溶剂浸泡提取至少一次，过滤得浸泡提取枣汁和滤渣，滤渣打浆，加入蒸馏水进行超声提取，过滤得超声提取枣汁和枣渣，合并所有提取枣汁，浓缩，静置得澄清枣汁；(2)、澄清枣汁通过阴离子交换柱，甲酸水溶液洗脱，收集得含环磷酸腺苷的溶液；(3)、含环磷酸腺苷的溶液通过层析柱，加洗脱液洗脱，收集含环磷酸腺苷的溶液，浓缩后加入无水乙醇，静置，结晶，过滤，真空干燥后粉碎得高纯度环磷酸腺苷粉。
所述步骤(1)中红枣破碎成2-10目，加入浸提溶剂的重量为红枣重量的1-3倍，浸泡次数3-6次，每次浸泡提取时间为4-8小时，浸泡提取温度为6-21℃。
所述步骤(1)中的浸提溶剂为蒸馏水或醇水溶液，醇水溶液为甲醇水溶液，或者乙醇水溶液，其醇含量为0.5-10％(wt/wt)。
所述步骤(1)中超声提取时间为10-40min，加入蒸馏水的重量为滤渣重量的1-2倍。
所述步骤(1)中将合并提取枣汁浓缩到可溶性固形物含量为6-15％。
所述步骤(2)中的含环磷酸腺苷的溶液可用2-10％(wt/wt)的氨水溶液调节PH到中性，再次通过阴离子交换柱，用甲酸溶液洗脱，再次得含环磷酸腺苷的溶液。洗脱用甲酸水溶液浓度为3-10％(wt/wt)。
所述步骤(3)中的层析柱为硅胶型，或者大孔树脂型，或者聚酰胺型；真空干燥温度为25-85℃；所述步骤(3)中的洗脱液为蒸馏水，或乙醇含量为0.1-5％(wt/wt)的乙醇水溶液。
采用液相色谱仪对本工艺提取的天然cAMP样品与cAMP标准样品进行测定，测定结果见附图1、2与表1、2表1cAMP标准样品测定结果数据表累计峰个数3累计面积总和2820265累计面积百分比总和100.000％
表2本工艺提取得天然cAMP样品的测定结果数据表累计峰个数7累计面积总和2137960累计面积百分比总和100.000％
另外，步骤2中通过交换柱后的枣汁可以浓缩得浓缩枣汁；步骤1中提取环磷酸腺苷过滤后产生的枣渣可以提取枣精华素，提取枣精华素可采用以下步骤在枣渣中加入乙醇含量为60-95％(wt/wt)的乙醇水溶液，其加入量为枣滤渣重量的1-3倍，加热回流1-2小时，过滤得滤液，滤渣再重复如前加热回流提取一次，合并前后两次提取液，浓缩到原液的5-30％(wt/wt)，收集富含枣黄酮的浸膏得枣精华素。
本发明与现有环磷酸腺苷提取工艺相比具有如下优点1、提取效率高，环磷酸腺苷含量大于90％(wt/wt)，且不含任何化学催化剂残留，性质稳定，是纯天然、无污染的优质产品；2、操作温度温和，工艺简单，本工艺无需苛刻低温(如4℃左右)浸提；3、本发明采用枣原料适当破碎蒸馏水或醇水溶液浸泡提取，含环磷酸腺苷成分的大部分枣汁提取出来前无需打浆，大大地提高了提取的选择性并有利于渣液分离；4、本发明采用超声提取手段，使残留在枣渣中环磷酸腺苷的提取效率得到提高；5、本发明的后期层析使用非氧化铝柱，减少了由于柱解离等带来的新污染，同时进一步采用了溶剂结晶处理，这都有利于提高环磷酸腺苷纯度；6、在干燥阶段，本发明采用真空干燥，要比冷冻干燥成本低，有利于工业化生产；7、本工艺副产枣精华素和浓缩枣汁，既进行了深加工综合利用，提高了生产效益，又减少了生产中的排放污染。
图1为标准品cAMP的液相色谱图；图2为采用本发明所述工艺提取的天然cAMP样品的液相色谱图。
具体实施例方式
实施例1红枣1000g精选清洗除杂后，去枣核破碎成2目，加入3000g蒸馏水，16℃浸泡提取6小时，压滤得浸泡提取枣汁，滤渣再加入相同重量的蒸馏水重复浸泡提取，共进行3次，最后一次所得枣渣打浆后加入1倍蒸馏水超声提取30min，过滤得超声提取枣汁；合并所有提取枣汁并浓缩到可溶性固形物含量为8％，静置澄清1小时后得澄清枣汁6300ml。
澄清枣汁通过阴离子交换柱，过柱后枣汁浓缩得浓缩枣汁；离子交换柱用8％(wt/wt)甲酸水溶液洗脱，得第一次洗脱液2400ml，用5％氨水调节到中性后再通过此离子交换柱，如上法再洗脱得洗脱溶液1100ml，此液通过硅胶柱，用蒸馏水洗脱，得到含环磷酸腺苷溶液500ml，浓缩后加入无水乙醇，静置，结晶，过滤，55℃0.1pa真空干燥后粉碎得高纯环磷酸腺苷粉55mg，含量93％。
500g枣滤渣中加入乙醇含量为80％(wt/wt)的乙醇水溶液1000g，加热回流1小时，过滤得滤液，滤渣再如前重复加热回流提取一次，合并前后两次提取液共得1500g，浓缩到原液的10％(wt/wt)，收集浸膏，得副产枣精华素。
实施例2红枣1000g精选清洗除杂后，去枣核破碎成10目，加入2000g乙醇含量为5％(wt/wt)乙醇水溶液，6℃浸泡提取6小时，压滤得浸泡提取枣汁，滤渣再加入相同浓度的醇水溶液重复浸泡提取，共进行5次，最后一次所得枣渣打浆后加入1倍蒸馏水超声提取30min，过滤得超声提取枣汁；合并所有提取枣汁并浓缩到可溶性固形物含量为6％，静置澄清1小时后得澄清枣汁6000ml。
澄清枣汁通过阴离子交换柱，过柱后枣汁浓缩得浓缩枣汁；离子交换柱用8％(wt/wt)甲酸水溶液洗脱，得第一次洗脱液2200ml，用5％氨水调节到中性后再通过此离子交换柱，如上法再洗脱得洗脱溶液1000ml，此液通过硅胶柱，用乙醇含量为5％乙醇水溶液洗脱，得到含环磷酸腺苷溶液500ml，浓缩后加入无水乙醇，静置，结晶，过滤，25℃0.1pa真空干燥后粉碎得高纯环磷酸腺苷粉50mg，含量92％。
500g枣滤渣中加入乙醇含量为60％(wt/wt)的乙醇水溶液1000g，加热回流1小时，过滤得滤液，滤渣再如前重复加热回流提取一次，合并前后两次提取液共得1600g，浓缩到原液的5％(wt/wt)，收集浸膏，得枣精华素。
实施例3红枣1000g精选清洗除杂后，不去枣核破碎成2目，加入1000g乙醇含量为5％(wt/wt)乙醇水溶液，15℃浸泡提取4小时，抽滤得浸泡提取枣汁，滤渣如上重复浸泡提取，共进行3次，最后一次所得枣渣打浆后加入1.5倍蒸馏水超声提取40min，过滤得超声提取枣汁；合并所有提取枣汁并浓缩到可溶性固形物含量为12％，静置澄清1小时后得澄清枣汁2800ml。
澄清枣汁通过阴离子交换柱，过柱后枣汁浓缩得浓缩枣汁；离子交换柱用5％(wt/wt)甲酸水溶液洗脱，得第一次洗脱液2100ml，用10％氨水调节到中性后再通过此离子交换柱，如上法再洗脱得洗脱溶液1000ml，此液通过聚酰胺柱，用乙醇含量为0.1％乙醇水溶液洗脱，得到含环磷酸腺苷溶液500ml，浓缩后加入无水乙醇，静置，结晶，过滤，45℃0.1pa真空干燥后粉碎得高纯环磷酸腺苷粉20mg，含量95％。
500g枣滤渣中加入乙醇含量为95％(wt/wt)的乙醇水溶液1500g，加热回流2小时，过滤得滤液，滤渣再如前重复加热回流提取一次，合并前后两次提取液共得2300g，浓缩到原液的10％(wt/wt)，收集浸膏得枣黄酮精华素。
实施例4红枣1000g精选清洗除杂后，去核破碎成8目，加入1500g乙醇含量为0.5％(wt/wt)乙醇水溶液，21℃浸泡提取8小时，渗漏过滤得浸泡提取枣汁，滤渣如上重复浸泡提取，共进行4次，最后一次所得枣渣打浆后加入2倍蒸馏水超声提取40min，过滤得超声提取枣汁；合并所有提取枣汁并浓缩到可溶性固形物含量为10％，静置澄清1小时后得澄清枣汁5000ml。
澄清枣汁通过阴离子交换柱，过柱后枣汁浓缩得浓缩枣汁；离子交换柱用10％(wt/wt)甲酸水溶液洗脱，得第一次洗脱液2100ml，用2％氨水调节到中性后再通过此离子交换柱，如上法再洗脱得洗脱溶液1100ml，此液通过大孔树脂柱，用乙醇含量为0.5％乙醇水溶液洗脱，得到含环磷酸腺苷溶液600ml，浓缩后加入无水乙醇，静置，结晶，过滤，85℃0.1pa真空干燥后粉碎得高纯环磷酸腺苷粉30mg，含量95％。
500g枣滤渣中加入乙醇含量为75％(wt/wt)的乙醇水溶液500g，加热回流1.5小时，过滤得滤液，滤渣再如前重复加热回流提取一次，合并前后两次提取液共得700g，浓缩到原液的15％(wt/wt)，收集浸膏得含枣黄酮的枣精华素。
实施例5红枣1000g精选清洗除杂后，带有枣核破碎成5目，加入1500g乙醇含量为10％(wt/wt)乙醇水溶液，15℃浸泡提取5小时，过滤得浸泡提取枣汁，滤渣如上重复浸泡提取，共进行5次，最后一次所得枣渣打浆后加入1.5倍蒸馏水超声提取10min，过滤得超声提取枣汁；合并所有提取枣汁并浓缩到可溶性固形物含量为11％，静置澄清1小时后得澄清枣汁5000ml。
澄清枣汁通过阴离子交换柱，过柱后枣汁浓缩得浓缩枣汁；离子交换柱用10％(wt/wt)甲酸水溶液洗脱，得第一次洗脱液2000ml，用5％氨水调节到中性后再通过此离子交换柱，如上法再洗脱得洗脱溶液900ml，此液通过聚酰胺柱，用乙醇含量为1％乙醇水溶液洗脱，得到含环磷酸腺苷溶液500ml，浓缩后加入无水乙醇，静置，结晶，过滤，65℃0.1pa真空干燥后粉碎得高纯环磷酸腺苷粉30mg，含量97％。
500g枣滤渣中加入乙醇含量为95％(wt/wt)的乙醇水溶液1000g，加热回流1.5小时，过滤得滤液，滤渣再如前重复加热回流提取一次，合并前后两次提取液共得1500g，浓缩到原液的30％(wt/wt)，收集浸膏得枣黄酮精华素。
实施例6红枣1000g精选清洗除杂后，去核后破碎成2目，加入1000g甲醇含量为1％(wt/wt)甲醇水溶液，20℃浸泡提取6小时，抽滤得浸泡提取枣汁，滤渣如上重复浸泡提取，共进行6次，最后一次所得枣渣打浆后加入1.5倍蒸馏水超声提取20min，过滤得超声提取枣汁；合并所有提取枣汁并浓缩到可溶性固形物含量为15％，静置澄清1小时后得澄清枣汁4200ml。
澄清枣汁通过阴离子交换柱，过柱后枣汁浓缩得浓缩枣汁；离子交换柱用3％(wt/wt)甲酸水溶液洗脱，得第一次洗脱液2000ml，用5％氨水调节到中性后再通过此离子交换柱，如上法再洗脱得洗脱溶液1000ml，此液通过大孔树脂柱，用乙醇含量为0.5％乙醇水溶液洗脱，得到含环磷酸腺苷溶液500ml，浓缩后加入无水乙醇，静置，结晶，过滤，45℃0.1pa真空干燥后粉碎得高纯环磷酸腺苷粉20mg，含量95％。
500g枣滤渣中加入乙醇含量为70％(wt/wt)的乙醇水溶液750g，加热回流2小时，过滤得滤液，滤渣再如前重复加热回流提取一次，合并前后两次提取液共得900g，浓缩到原液20％(wt/wt)，收集浸膏得含枣黄酮的枣精华素。
权利要求
1.一种从枣中提取环磷酸腺苷的工艺，其特征在于具体步骤如下(1)、取红枣破碎，加入浸提溶剂浸泡提取至少一次，过滤得浸泡提取枣汁和滤渣，滤渣打浆，加入蒸馏水进行超声提取，过滤得超声提取枣汁和枣渣，合并所有提取枣汁，浓缩，静置得澄清枣汁；(2)、澄清枣汁通过阴离子交换柱，甲酸水溶液洗脱，收集得含环磷酸腺苷的溶液；(3)、含环磷酸腺苷的溶液通过层析柱，加洗脱液洗脱，收集含环磷酸腺苷的溶液，浓缩后加入无水乙醇，静置，结晶，过滤，真空干燥后粉碎得高纯度环磷酸腺苷粉。
2.根据权利要求1所述从枣中提取环磷酸腺苷工艺，其特征在于所述步骤(1)中红枣破碎成2-10目，加入浸提溶剂的重量为红枣重量的1-3倍，浸泡次数3-6次，每次浸泡提取时间为4-8小时，浸泡提取温度为6-21℃。
3.根据权利要求1或2所述从枣中提取环磷酸腺苷工艺，其特征在于所述步骤(1)中的浸提溶剂为蒸馏水或醇水溶液，醇水溶液为甲醇水溶液，或者乙醇水溶液，其醇含量为0.5-10％(wt/wt)。
4.根据权利要求1所述从枣中提取环磷酸腺苷的工艺，其特征在于所述步骤(1)中超声提取时间为10-40min，加入蒸馏水的重量为滤渣重量的1-2倍。
5.根据权利要求1所述从枣中提取环磷酸腺苷的工艺，其特征在于所述步骤(3)中的层析柱为硅胶型，或者大孔树脂型，或者聚酰胺型。
6.根据权利要求1所述从枣中提取环磷酸腺苷的工艺，其特征在于所述步骤(1)中将合并提取枣汁浓缩到可溶性固形物含量为6-15％。
7.根据权利要求1所述从枣中提取环磷酸腺苷的工艺，其特征在于将所述步骤(2)中含环磷酸腺苷的溶液可用2-10％(wt/wt)的氨水溶液调节PH到中性，再次通过阴离子交换柱，用甲酸水溶液洗脱，再次得含环磷酸腺苷的溶液。
8.根据权利要求1或7所述从枣中提取环磷酸腺苷的工艺，其特征在于洗脱用甲酸水溶液浓度为3-10％(wt/wt)。
9.根据权利要求1所述从枣中提取环磷酸腺苷的工艺，其特征在于所述步骤(3)中的真空干燥温度为25-85℃；所述步骤(3)中的洗脱液为蒸馏水，或乙醇含量为0.1-5％(wt/wt)的乙醇水溶液。
10.根据权利要求1所述从枣中提取环磷酸腺苷的工艺，其特征在于所述步骤(1)中过滤后产生的枣渣中加入乙醇含量为60-95％(wt/wt)的乙醇水溶液，其加入量为枣滤渣重量的1-3倍，加热回流1-2小时，过滤得滤液，滤渣再重复如前加热回流提取一次，合并前后两次提取液，浓缩到原液的5-30％(wt/wt)，收集浸膏得富含枣黄酮的枣精华素。
全文摘要
本发明涉及植物有效成分提取工艺，具体是一种从枣中提取环磷酸腺苷的工艺。解决了现有环磷酸腺苷提取工艺工业化难度大、提取过程繁杂、效率不高、产品纯度低等问题，该工艺是以红枣为原料，先适当破碎，然后分次加入浸提溶剂浸泡提取，浸泡液过滤后所得滤渣再超声提取，合并提取汁得澄清枣汁；澄清枣汁通过离子交换柱后，洗脱液再次通过离子交换柱，所得的二次洗脱液再通过层析柱，收集含环磷酸腺苷溶液，浓缩后，在乙醇中结晶得高纯度环磷酸腺苷。本工艺具有处理量大、环磷酸腺苷提取效率高，产品纯度含量高，纯天然、无化学污染的优点，同时副产枣黄酮精华素和浓缩枣汁，是进行红枣深加工综合开发的有效途径。
文档编号A61K36/725GK1948329SQ20061010214
公开日2007年4月18日 申请日期2006年11月9日 优先权日2006年11月9日
发明者常月梅, 杜俊杰 申请人:常月梅