物物质的纯度。用纯化的rhPTH1—34的药物物质材料观察到rhPTH1—34的主峰大于99%的纯度。
【具体实施方式】
[0043 ] 本发明提供了 PTH、优选重组PTH (rhPTH1—34)的3 _PLC纯化方法。
[0044]在一个实施方式中，本发明提供了PTH的纯化方法，包括首先使用阴离子交换色谱，接着是随后使用其他柱从粗混合物纯化PTH。粗混合物可以包括污染的蛋白、内原性蛋白、产物相关物质及除了所期望的蛋白之外的其他杂质。
[0045]在一个实施方式中，本发明提供了用于纯化PTH的非HPLC方法，包括多重离子交换柱色谱步骤。
[0046]在一个优选的实施方式中，本发明提供了从可溶的融合-伴侣-蛋白-PTH复合体中的PTH纯化方法，其中PTH经由特异性切割位点与融合伴侣连接。然而，本发明设想从细胞中纯化PTH，所述细胞使用包含对通过本领域已知的任何常规发酵方法合成的融合-伴侣蛋白-切割位点-PTH复合体特定的基因的载体基因转化。
[0047]在优选的实施方式中，从融合-伴侣-蛋白-PTH复合体中纯化PTH使用以下步骤进行:
[0048]1.酶促反应以从存在于粗混合物中的可溶融合伴侣-PTH复合体中切割PTH
[0049]2.阴离子交换色谱
[0050]3.阳离子交换色谱[0051 ]4.阳离子交换色谱
[0052]5.超滤和渗滤
[0053]6.阴离子交换色谱。
[0054]在一个实施方式中，可以在第一阴离子交换色谱步骤之后进行酶促切割。
[0055]在另一个实施方式中，可以按任何顺序进行三至六的步骤。
[0056]在优选的实施方式中，使用以下步骤进行从包含融合-伴侣-蛋白-PTH复合体的粗混合物中纯化PTH:
[0057]1.酶促切割
[0058]2.弱阴离子交换色谱
[0059]3.弱阳离子交换色谱
[0060]4.强阳离子交换色谱[0061 ]5.超滤和渗滤
[0062]6.弱阴离子交换色谱。
[0063]用于纯化PTiKrhPTH1—34)产物的下游过程包括以下步骤-
[0064]-细胞破裂
[0065]-从细胞裂解物中分离包涵体团块(内含体团块，inclus1nbody mass)
[0066]-溶解包涵体
[0067]-通过酶促切割从融合-伴侣-蛋白PTH复合体中分离rhPTH1—34
[0068]-重新调节(重建，重调节，Recondit1ning)
[0069]-通过弱阴离子交换色谱去除融合-伴侣蛋白
[0070]-通过弱阳离子交换色谱纯化[0071 ]-通过强阳离子交换色谱纯化
[0072]-超滤/ 渗滤(UF/DF)
[0073]-通过弱阴离子交换色谱纯化
[0074]-通过超滤/渗滤的缓冲剂交换
[0075]-0.22μηι的终端过滤(最终过滤，terminal filtrat1n)
[0076]-在-20°C或以下存储药物物质。
[0077]在优选的实施方式中，如下进行上游过程:
[0078]在收获发酵批量(fermentat1nbatch)之后，通过离心收集大肠杆菌细胞并且将其再悬浮在裂解缓冲剂中。通过使用高压细胞匀化器将细胞破裂从而从裂解物中以颗粒形式分离不可溶的包涵体团块。将分离的包涵体团块溶解并且经受酶促反应。在适合的条件下，发生从融合-伴侣-蛋白-PTH复合体中期望的PTH多肽链的酶促切割5-6h的时间。在反应结束时，使反应混合物经受重新调节步骤接着进行柱纯化。
[0079]用于本发明中的色谱方法:
[0080]阴离子交换色谱-在阴离子交换色谱中，固定相携带正电荷，带负电的蛋白与所述正电荷结合，同时穿过柱基质(column matrix)。为了进行根据本发明的阴离子交换色谱，还可以使用的其它阴离子交换剂选自DEAE琼脂糖(DEAE sepharose)、Mono Q、Q琼脂糖(Qsepharose)、Q琼脂糖XL(Q sepharose XL)、Capto Q等。已经在本发明中使用阴离子交换剂DEAE琼脂糖。
[0081]阳离子交换色谱-在阳离子交换色谱中，固定相携带负电荷，带正电的多肽分子与所述负电荷结合，同时穿过柱基质。在阳离子交换色谱中，阳离子交换剂可以选自SP-5PW、SP琼脂糖(SP sepharose)、MonoS、B1_rex70、CM琼脂糖(CM sepharose)等。在本发明中，在指定的步骤中CM琼脂糖已经用作弱阳离子交换剂并且SP-5PW已经用作强阳离子交换剂。
[0082]RP-HPLC-通过使用利用流动相A中的0.1%TFA饱和的反相C18柱进行分析RP-HPLC。在lmL/min的流动速率、40°C下使用在TFA(流动相B)中的乙腈进行rhPTH1—34药物物质的分离。
[0083]在本发明中，没有HPLC柱步骤用于纯化PTH产物。
[0084]在以下示出了根据本发明的纯化rhPTH1—34的优选方式，其不应解释为以任何方式限制本发明的范围。
[0085]步骤1:细胞破裂
[0086]在通过离心作用从13±2L的发酵液(工作体积)中收获细胞团块(cell mass)之后，将细胞颗粒悬浮在pH 8.0的Tr i s (三羟甲基氨基甲烷)缓冲剂中。在低温条件(2°C_15°C)下通过使用具有单一通道的在900-1100巴压力之间的高压细胞匀化器将细胞破裂。
[0087]步骤2:从细胞裂解物中分离包涵体团块
[0088]在10，500gXlh在低温条件下通过离心作用从细胞裂解物中分离包涵体团块。在还原条件下在低浓度的脲、优选具有0.5-1M的脲存在的情况下，通过离心作用再悬浮颗粒状的包涵体团块并且以pH 8.0的Tris缓冲剂将其洗涤。
[0089]步骤3:包涵体团块的溶解
[0090]在洗涤之后，在环境温度下、在还原条件下通过在pH8.0的Tris缓冲剂中的8M的脲溶解包涵体团块1小时。在10，500g X lh下在2°C_8°C下将溶解的包涵体团块离心。使包含可溶的融合-伴侣-蛋白-rhPTH1—34复合体的澄清的上清液部分与其他污染物一起经受来自融合-伴侣复合体的PTH的酶促切割。
[0091 ]步骤4:通过酶促切割从融合-伴侣-蛋白复合体中分离rhPTH1—34
[0092]在还原条件下、在环境温度下用r-肠激酶处理以l-2mg/mL(总蛋白)的包含融合-伴侣-蛋白-rhPTH1—34复合体和其他污染物的上清液部分5-6h，用于酶促切割。肠激酶在特异性位点处切割融合-伴侣-rhPTH1—34复合体以从蛋白复合体中释放rhPTH1—34。肠激酶在存在于融合-伴侣-蛋白与rhPTH1—34分子之间的特征序列(Asp)4Lys的C-端Lys残基处切割。在指定时间通过添加乙酸的酸化使酶促反应终止。使混合物通过深度过滤器以从在酸化期间产生的不溶解物质或沉淀物中分离可溶部分。在酸化之后，使混合物通过深度过滤器以恢复在渗透液中主要包含rhPTH1—34的可溶蛋白部分。
[0093]步骤5:在切割之后可溶的PTH1—34的重新调节
[0094]在深度过滤之后，使包含rhPTH1—34和其他次要污染物的可溶蛋白部分在pH调整方面经受重新调节步骤，以便匹配下次的柱步骤平衡条件。用Tris或NaOH溶液将溶液的pH调整至8.2。
[0095]步骤6:弱阴离子交换柱色谱
[0096]在重新调节之后，使蛋白溶液通过弱阴离子交换柱以从柱流过-和-洗涤部分(column f low-through-and-wash fract1n)中的混合物中恢复大部分rhPTH1—34产物。未切割的融合-伴侣蛋白及其他蛋白污染物保持结合于阴离子交换柱基质，在更高的导电性下将其从柱中剥离。在这个步骤，观察到在流过-和-洗涤部分中恢复的rhPTH1—34产物表现出如由分析RP-HPLC评估的大于90 %的纯度。
[0097]阴离子交换柱条件的详情:
[0098]柱尺寸_13cm(h)X 20cm(内径(i.d.))
[0099]柱床体积-4L
[0100]平衡缓冲剂:Tris-Cl，pH8.2
[0101]流动速率-28至47cm/h
[0102]柱洗涤-Tris-Cl、pH8.2，含有500禮 NaCl
[0103]柱清洗-0.5NNaOH
[0104]在图1中示出了弱阴离子交换柱步骤的色谱曲线。
[0105]步骤7:通过弱阳离子交换色谱纯化
[0106]在弱阴离子交换柱色谱步骤之后，通过以结合-洗脱模式在pH5.0使用弱阳离子交换柱进一步纯化rhPTH1—34产物。主要实施这个柱步骤以除去源自宿主细胞的