专利名称：一种含有yc-1或il-21的用于将造血干细胞分化为自然杀伤细胞的药剂以及利用该药剂 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于将造血干细胞分化成自然杀伤细胞的药剂及其方法，更具 体地是涉及一种将造血干细胞分化成自然杀伤细胞含有YC-l[3-(5'-羟甲基-2'-呋 喃)-1_苄基吲唑]或IL_21(白细胞介素-21)作为活性成分的药剂以及利用该药剂将造 血干细胞分化成自然杀伤细胞的方法。
背景技术：
造血干细胞是一种成体干细胞，具有分化成几乎一切造血细胞(包括红细胞、白 细胞、血小板和淋巴细胞)的潜能，并作为免疫细胞能够不断地从骨髓造血干细胞中自动 再生。形成免疫系统的细胞，特别是自然杀伤细胞(以下被称为“NK细胞”)，具有非特异性 地杀死肿瘤细胞的能力。NK细胞的肿瘤杀伤活性已被用于利用淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)以及肿瘤 浸润淋巴细胞(TIL)治疗实体瘤或用于通过供体淋巴细胞回输的免疫疗法(Itoh K等， J.Immunol.，136 :3910_3915，1986 ；Bordignon C 等，Hematologia,84 :1110_1149，1999)， 其作为一种防止骨髓移植或器官移植排斥反应的先进的细胞疗法引起了我们的注意。另据 报道，NK细胞分化或活性的缺陷关系到包括乳腺癌(Konjevic G，等，Breast Cancer Res. Treat. ,66 :255_263，2001)、黑色素瘤(Ryuke Y，等，Melanoma Res.，13 :349_356，2003)以 及肺癌(Villegas FR，等，Lung Cancer, 35 =23-28,2002)在内的多种疾病。因此，修正NK 细胞的功能似乎是治疗这些疾病的途径。NK细胞来源于骨髓中的造血干细胞。从造血干细胞中分化成NK细胞包含许多步 骤，但是尚未完全清楚。IL-21(白细胞介素-21)是一种由活化的⑶4+T细胞分泌的细胞因子(Warren J.，等，Nature Review Immunol, 5 :688_697，2005)。IL-21 受体(IL-21R)在诸如树突状细 胞、NK、T 和 B 细胞的淋巴细胞中表达(Takaki R.，等，J Immunol.，175 :2167_2173，2005)。 IL-21的结构与IL-2和IL-15极其相似，并且IL-21R与IL-2R、IL-15或IL-4R共用Y -链 (Ensminger SM，等，J Immunol. 167(1) :532_541，2001)。据先前报道，IL-21诱导骨髓中NK细胞前体的成熟((Parrish-Novak J.等， Nature, 408 =57-63,2000)，并能特异性增加NK的效应功能诸如细胞因子生成能力和杀伤 活性(Strengell M，等，JImmunol.，170 :5464_5469，2003 ；Brady J，等，J Immunol.，172 2048-2058，2004)。IL-21还增加CD8+T细胞的效应功能，能促进先天性或获得性免疫系统 的抗癌反应(Takaki R.，等，J Immunol.，175 :2167_2173，2005 ；Moroz A.，等，J Immunol, 173 =900-909,2004) 此外，IL-21激活分离自人外周血的NK细胞(Parrish-Novak J.，等， Nature, 408 =57-63,2000)并在分离自脐带血的造血干细胞向NK细胞的分化中发挥重要作 用(Sonia A. P 等，Int. immunol.，18 :49_58，2006)。
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YC-l[3-(5'-羟甲基-2'-呋喃)苄基吲唑]在被证实能抑制血小板的凝 血并激活可溶性的GC(鸟苷酸环化酶)以抑制血管的收缩后，最初被用作治疗循环系统疾 病的药剂(Ko FN，等，Blood 84. No. 12 :4226_4233 1994 ；Teng CM，等，Eur J Pharmacol, 320 161-6,1997 ；Galle J.，等，Br J Pharmacol，127 :195-203，1999)。最近的研究还发 现其抑制缺氧诱导的HIF-la蓄积，减少HIF-1靶基因(VEGF，促红细胞生成素，等。)的 表达(Chun YS，等，Biochem Pharmacol, 61 :947_954，2001)，并抑制动物肿瘤的生长和血管 生成(Yeo EJ，等，J Natl Cancer Inst, 95 516-525, 2003 ；Pan SL，等，J Pharmacol Exp Ther，314 :35-42，2005)。因此，YC_1成为用于研发靶向HIF-1 a的抗癌药剂的先导化合 物(Yeo EJ，等，Cancer Res，66 :6345_6352，2006)。尽管 YC-1 对于研究 HIF-1 a 非常有用 (Moeller BJ，等，Cancer cell 5 429-441, 2004 ；Funasaka T，等，FASEB J，19 1422-1430， 2005 ；Sun. H. L.，等，Oncogene 26 :3941_3951，2007)，但是关于 YC-1 抗癌活性的机制仍未 被披露(Sun. H. L.，等，Oncogene 1-11，2006)。本发明人通过确定IL_21(白细胞介素-21)和YC-1[3_(5'-羟甲基-呋 喃)-1_苄基吲唑]能促进造血干细胞分化为自然杀伤细胞并增加自然杀伤细胞的杀伤活 性而完成了本发明。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种用于将造血干细胞分化为自然杀伤细胞的药剂以及分 化的方法。技术方案为了实现上述目的，本发明提供了一种用于将造血干细胞分化为自然杀伤细胞的 含有YC-l[3-(5'-羟甲基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]作为活性成分的药剂。本发明还提供一种含有IL-21 (白细胞介素-21)作为活性成分的抗癌药剂。本发明还提供一种用于将造血干细胞分化为自然杀伤细胞的含有 YC-l[3-(5'-羟甲基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]和IL-21(白细胞介素-21)作为活性成 分的药剂。本发明还提供一种含有YC-1[3_(5'-羟甲基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]和 IL_21(白细胞介素-21)作为活性成分的抗癌药剂。本发明还提供一种利用IL-21和/或YC-1将造血干细胞分化为自然杀伤细胞的方法。本发明还提供一种用于治疗癌症的细胞疗法，其含有将通过上述方法分化的自然 杀伤细胞施予肿瘤细胞的步骤。本发明还提供一种用于增加NK细胞杀伤活性的方法，其含有给药造血干细胞 IL-21(白细胞介素-21)的步骤。本发明还提供一种用于增加NK细胞杀伤活性的方法，其含有将YC-1 [3-(5'-羟 甲基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]施予造血干细胞的步骤。本发明还提供一种用于增加NK细胞杀伤活性的方法，其含有将YC-1 [3-(5'-羟 甲基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]和IL-21(白细胞介素-21)施予造血干细胞的步骤。
本发明还提供一种用于治疗癌症的细胞疗法，其含有将具有改善肿瘤细胞杀伤活 性的自然杀伤细胞给予肿瘤细胞的步骤。本发明还提供YC-1在用于制备将造血干细胞分化为自然杀伤细胞的药剂或抗癌 药剂中的应用。本发明还提供IL-21在制备抗癌药剂中的应用。此外，本发明提供YC-1和IL-21在制备使造血干细胞分化成自然杀伤细胞的药剂 或抗癌药剂的应用。有益效果YC-1和IL-21参与NK细胞的分化并增加了 NK细胞的杀伤活性。因此，用于将造 血干细胞分化为自然杀伤细胞的含有YC-1或IL-21作为活性成分的药剂以及含有IL-21 作为活性成分的抗癌药剂能够有效地用于癌症细胞疗法新方法的研发和NK细胞分化的调 控。
参照以下附图能够易于理解本发明的优选实施方案图1是通过流式细胞仪测定的CD34+造血干细胞纯度的图(象限中的数字表示纯 度)。图2是分离自人脐带血的造血干细胞通过NK前体(pNK)分化成成熟NK (mNK)过 程的示意图HSC 造血干细胞；SCF:干细胞因子；以及Flt3L :FMS样酪氨酸激酶3配体。图3是各个NK细胞分化时期表面分子表达示意图(象限中的数字表示纯度)。图4是FACS结果示意图。在NK细胞的分化中，用IL-21处理pNKs (NK前体细胞)， 在IL-15存在下进行培养直到它们分化成成熟的NK细胞，然后用FACS检测。图5是在整个分化时间内⑶56+NK细胞数的示意图，其用％表示。具体而言，在NK 分化中，用IL-21处理pNKs，在IL-15存在下进行培养并对培养时间内的⑶56+NK细胞进行 统计。图6是51Cr释放试验结果示意图。在NK细胞的分化中，用IL-21处理pNKs，在 IL-15存在下进行培养直到它们分化成成熟的NK(mNK)细胞，接着进行51Cr释放试验。E T 效应细胞靶细胞。图7是FACS分析结果的示意图。在NK细胞的分化中，用YC-1处理pNKs，在培养 中添加IL-15直到它们分化成成熟的NK(mNK)细胞，接着用FACS分析。图8是⑶56+NK群的示意图。也就是，在NK细胞的分化中，用YC-1处理pNKs，在 IL-15存在下进行培养。统计整个培养时间内的⑶56+NK细胞，并用％表示。图9是51Cr释放试验结果示意图。在NK细胞的分化中，用YC-1处理pNKs，在IL-15 存在下进行培养直到它们分化成成熟的NK (mNK)细胞，接着用51Cr释放试验分析。E T 效应细胞靶细胞。图10是FACS分析结果的示意图。在NK细胞的分化中，用IL-21和YC-1处理pNKs，在IL-15存在下进行培养直到它们分化成成熟的NK(mNK)细胞，接着用FACS分析。图11是在整个分化时间内⑶56+NK细胞数的示意图。在NK分化中，用IL-21和 YC-I处理pNKs，在IL-15存在下进行培养，接着测定培养时间内的⑶56+NK细胞数。
具体实施例方式下文将详细描述本发明。本发明提供一种用于将造血干细胞分化为自然杀伤细胞的含有YC-I [3-(5'-羟 甲基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]作为活性成分的药剂。YC-I (C19H16N2O2)如式 1 所示。式1<formula>formula see original document page 7</formula>本发明还提供一种含有IL-21 (白细胞介素-21)作为活性成分的抗癌药剂。IL_21(白细胞介素-21)优选自(a)具有SEQ. ID. NO 1所示的氨基酸序列的蛋 白；(b)具有SEQ. ID. NO 2所示核苷酸序列编码区的DNA编码的蛋白；(c)具有SEQ. ID. NO 1所示氨基酸序列经取代、缺失、插入和/或增加单个或多个氨基酸的氨基酸序列且与含有 SEQ. ID. NO :1所示氨基酸的蛋白具有同等功能的蛋白；以及(d)用SEQ. ID. NO :2所示的核 苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交的DNA编码，并且与含有SEQ. ID. NO 1所示的氨基酸序 列的蛋白质具有同等功能的蛋白。严谨条件下的杂交使得选择的DNA具有高同源性的核苷酸序列。因此，由此分离 的蛋白功能上等同于IL-21的机会较高。高同源性的核苷酸序列是指，例如，核苷酸序列 与SEQ. ID. NO 2所示的核苷酸序列至少有70%的同源性，优选是具有至少80%的同源性， 更优选是至少90%的同源性，最优选是至少95%的同源性。相应的氨基酸序列可以选择与 SEQ. ID. NO 1所示氨基酸序列的同源性至少是70%，优选至少是80%同源性，更优选是至 少90%，最优选是至少50%的同源性的氨基酸序列。同源性的百分数可以用本领域常规方 法确定。杂交可以通过本技术领域技术人员所知的DNA-DNA杂交在严谨条件(Hames and Higgins，Eds. (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, U. K.)下进行，并可通过杂 交后的洗脱过程确定杂交条件。本发明还提供一种用于将造血干细胞分化为自然杀伤细胞含有YC-I [3-(5'-羟 甲基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]和IL-21(白细胞介素-21)作为活性成分的药剂。本发明人从脐带血中分离获得了纯度为92%的⑶34+造血干细胞(以下称作"HSC细胞”)(见图1)。HSC细胞经由pNKs分化为成熟的NK细胞(见图2)，并检测了各个 NK细胞分化阶段的表面分子的表达(见图3)。结果显示⑶56细胞增加。在NK细胞分化中，添加IL-21处理pNKs，在IL-15存在的条件下培养将pNKs分 化成mNK。进行FACS分析。结果显示，与IL-21未处理对照组(只用IL-15处理)相比， ⑶56+NK细胞种群在IL-21处理组中增加(见图4和5)，表明IL-21参与了 NK分化。从 51Cr释放试验的结果可以确定与IL-21非处理组(只用IL-15处理)相比，IL-21处理组 具有增强的杀伤活性(见图6)，表明IL-21 参与了 NK细胞杀伤活性的激活。用YC-I处理NK前体细胞(pNK)并在IL-15存在下进行培养以分化为成熟的 NK (mNK)细胞，接着进行FACS分析。结果显示，与YC-I未处理对照组(只用IL-15处理) 相比，⑶56+NK细胞在YC-I处理组中增加(见图7和8)，表明YC-I参与了 NK细胞分化。 从51Cr释放试验的结果，可以确定与IL-21未处理组(只用IL-15处理)相比，YC-I处理 组杀伤活性增强(见图9)，表明YC-I参与了 NK细胞杀伤活性的激活。同时用IL-21和YC-I处理NK前体细胞(pNK)并分析NK细胞分化情况。结果显 示，NK细胞分化显著增加(见图10和11)。如前所述，IL-21和YC-I促进了造血干细胞分化成自然杀伤细胞并增加了 NK细 胞的杀伤活性，因此它们用作药剂能够有效地用于造血干细胞向NK细胞的分化。本发明还提供一种含有YC-1[3_(5'-羟甲基-2'-呋喃)苄基吲唑]和 IL_21(白细胞介素-21)作为活性成分的抗癌药剂。本发明的用于分化成NK细胞的药剂和抗癌药剂可以用于治疗癌症的细胞疗法。这里的癌症可以选自乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、肝癌、血癌、结肠癌，以及肺癌，但是 常常不仅限于此。如果NK细胞的分化以及活性存在缺陷，可能发展成各种癌症，例如前面报道的乳 腺癌(Konjevic G，等，Breast Cancer Res. Treat.，66 :255_263，2001)、黑色素瘤(Ryuke Y,等，Melanoma Res. , 13 :349_356，2003)和肺癌(Villegas FR,等，Lung Cancer, 35 23-28,2002)等。因此，期望通过利用本发明的NK细胞分化的药剂以及抗癌药剂来调控NK 细胞的分化进而治疗诸如上述的癌症。本发明用于NK细胞分化的药剂以及抗癌药剂可以通过口服或肠道外给药，并以 一般药物制剂的形式使用。本发明的用于NK细胞分化的药剂以及抗癌药剂可以通过与常 用的填料、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、诸如表面活性剂的稀释剂，或辅料混合制备成 口服或肠道外给药形式。用于口服给药的固体制剂有片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊。固体 制剂是通过混合一种或多种适宜的辅料诸如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等等而制备的。 除简单辅料外，可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉等。用于口服给药的液体制剂是悬 浮液、溶液、乳液和糖浆，并且上述制剂除了一般常用的简单辅料诸如水和液体石蜡外可以 含有各种辅料诸如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。肠道外给药的制剂有无菌水溶液、水不 溶辅料、悬浮液、乳液和栓剂。水不溶辅料和悬浮液除活性化合物外还可以含有丙二醇、聚 乙二醇、植物油如橄榄油、可注射的酯如油酸乙酯，等。栓剂除活性化合物外，还可以含有半 合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可黄油、劳林黄油、甘油、明胶等。本发明的用于NK细胞分化的药剂或抗癌药剂的有效剂量是0. 1 0. 2mg/kg，更优 选是0. 15mg/kg，给药次数优选每天1 3次。
本发明还提供一种用IL-21和/或YC-I将造血干细胞分化成自然杀伤细胞的方法。具体而言，用于将造血干细胞分化成NK细胞的方法包括下列步骤1)通过向造血干细胞中添加NK前体诱导物来诱导NK前体细胞的增殖；以及2)通过向1)步的NK前体细胞中添加IL-21和/或YC-lJf NK前体细胞分化为成熟的NK细胞。在步骤1)中，“NK前体诱导物”是指能够诱导造血干细胞分化成NK前体细胞的任 何物质，优选为SCF或Flt3L，但是常常不仅限于此。在步骤2)中，IL-21优选处理量是lOng/ml 50ng/ml，YC-I的优选处理量为 0. 5uM 5uM。在YC-I和IL-21联合处理的情况下，YC-I和IL-21的优选用量分别为0. 5uM 和lOng/ml，但是常常不仅限于此。在步骤2)中，NK前体细胞优选用IL_15(白细胞介素_15)进行培养，但是常常不 仅限于此。按照常规方法，同时用IL-15和IL-21处理分离自脐带血的造血干细胞在同一时 间内诱导增殖和分化。因此，分化速度非常慢，要花较长时间(30天)。然而，根据本发明的 方法，首先通过添加SCF和Flt3L诱导造血干细胞分化成NK前体细胞，接着通过添加IL-15 和IL-21和/或YC-I将其诱导分化为成熟NK细胞，使得该方法更有效并且减少了分化时 间(14天)。本发明还提供一种用于治疗癌症的细胞疗法，其含有将通过上述方法获得的自然 杀伤细胞给予肿瘤细胞的步骤。上述造血干细胞向NK细胞的分化是在体外进行诱导的。本文中的癌症优选选自乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、肝癌、血癌、结肠癌，以及肺癌，但 是常常不仅限于此。可以通过给予YC-I或IL-21，但是优选联合给予YC-I和IL-21来诱导造血干细胞 向NK细胞的分化。本发明还提供一种增加NK细胞杀伤活性的方法，其含有给予造血干细胞 IL-21(白细胞介素-21)的步骤。IL-21的有效剂量是lOng/ml 50ng/ml，并且优选同IL_15(白细胞介素-15) — 起给予用于培养，但是常常不仅限于此。本发明还提供一种用于增加NK细胞杀伤活性的方法，其含有向造血干细胞施予 YC-I [3-(5‘-羟甲基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]的步骤。YC-I的优选剂量是0. 5uM 5uM，并且优选同IL-15 (白细胞介素-15) —起给药 用于培养，但是常常不仅限于此。本发明还提供一种用于增加NK细胞杀伤活性的方法，其含有给药造血干细胞 YC-I [3-(5‘-羟甲基-2'-呋喃)-1-苄基吲唑]和IL-21(白细胞介素-21)的步骤。本发明优选的造血干细胞是那些正在向NK细胞分化的细胞。YC-I和IL-21的优选剂量分别是0. 5uM和lOng/ml，其优选与IL_15(白细胞介 素-15)共处理用于造血干细胞的培养，但是常常不仅限于此。本发明还提供一种用于治疗癌症的细胞疗法，其含有给予肿瘤细胞具有改进细胞杀伤活性的自然杀伤细胞的步骤。
NK细胞的杀伤活性在体外增加。本文的癌症优选选自乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、肝癌、血癌、结肠癌，以及肺癌，但是 常常不仅限于此。通过YC-I或IL-21处理可以增加NK细胞的杀伤活性，但是优选用YC-1和IL-21 共处理。此外，本发明提供YC-I或IL-21在制备分化造血干细胞成自然杀伤细胞的药剂或 抗癌药剂中的应用。以下实施例将说明本发明实用的和目前优选的实施方案。然而，本领域技术人员根据本发明公开的内容，可以在本发明的精神和范围内作 出修改和改进。实施例1 从脐带血中分离造血干细胞脐带血由韩国大田Konyang大学医院妇产科提供，由于仅用于研究，只 用RPMI 1640 (GIBCO-BRL, USA)按照2 1的比例稀释。将制备的脐带血上样于 Ficoll-Paque (Sigma, USA)的上部，接着离心(20，OOOrpm，30分钟)分离单核细胞(MNC)。 从获得的细胞中去除红细胞并将获得的单核细胞用造血干细胞标记‘CD34磁珠’标记。接 着，利用MS/RS柱和MACS (磁激活细胞分选)分离⑶34+细胞。测定获得的⑶34+造血干 细胞(下文称作“HSC 细胞”)通过 FACS(BD Bioscience, Mountainview, CA)纯度，为 92% (图 1)。实施例2 脐带血造血干细胞向NK细胞的分化将实施例1从脐带血分离得到的HSC细胞接种到12孔板中(Falcon，USA)，孔中 含有添加有30ng/ml人因子(P印roTech，USA)、50ng/ml人Flt3L(FMS样酪氨酸激酶3配 体，P印roTech，USA)，5ng/ml 人 IL-7 (PeproTech, USA)，以及 ICT6M 水性(hydro) SCF (干细胞 氢化可的松，Stem cell Technology，CA)Myelocult 完全培养基(Stem cell Technology, CA)，每孔IX IO6个细胞，接着在37°C，5% CO2的恒温箱中培养14天。3天后，将一半上清 液用含有细胞因子的具有上述相同组分的新鲜培养基替换。为了分化为成熟的NK细胞(以 下称为“NK细胞”)，14天后将HSC细胞回收，在人11^-15(30叫/1111，？印1~(^6(^，旧4)存在下 再培养14天。3天后，将一半培养基用含有细胞因子的具有上述相同组分的新鲜培养基替 换(图2)。培养至第28天，用抗⑶56抗体测定NK细胞纯度，用流式细胞仪(FACS)测定 NK细胞受体的表达(图3)。实施例3 :IL_21对NK细胞分化的作用为了考察已知的具有促进分化和增加活性作用的IL-21对NK细胞分化的作用， 在脐带血造血肝细胞经由NK前体细胞(pNK)分化为成熟NK细胞(mNK)的分化过程中用 IL-21 (20ng/Ml,PeproTech,USA)进行处理。将细胞在IL-15存在的情况下进行培养，接着 进行FACS分析和51Cr释放分析。IL-21具有SEQ. ID. NO 1所示的氨基酸序列，核苷酸序列如SEQ. ID. NO 2所示。从FACS分析结果可以确定，IL-21处理组的⑶56+NK细胞数量增加了(图4和5)。从51Cr释放分析结果可以确定，经IL-21处理NK细胞的杀伤活性增加了(图6)。 E T (效应细胞靶细胞)为2.5 1。
以上结果表明，IL-21参与了 NK细胞分化并直接影响NK细胞的杀伤活性。 实施例4 =YC-I对NK细胞分化的作用为了考察已知的具有通过抑制HIF-I α活性来抑制肿瘤细胞生长作用而作为抗 癌药剂的YC-I [3-(5 ‘-羟甲基-2'-呋喃)-1-苄基吲唑，式1]对NK细胞分化的作用， 在脐带血造血肝细胞经由NK前体细胞(ρΝΚ)分化为成熟NK细胞(mNK)的分化过程中用 YC-KluM, Sigma)进行处理。将细胞在IL-15存在的情况下进行培养，接着进行FACS分析 和51Cr释放分析。从FACS分析结果可以确定，YC-I处理组的⑶56+NK细胞数量增加了(图7和8)。从51Cr释放分析结果可以确定，经YC-I处理NK细胞的杀伤活性增加了(图9)。 E T (效应细胞靶细胞)为5 1。以上结果表明，YC-I参与了 NK细胞分化并直接影响NK细胞的杀伤活性。〈式 1><image>image see original document page 11</image>实施例5 :IL-21和YC-I对NK细胞分化的协同作用为了考察IL-21和YC-I对NK细胞分化的协同作用，在脐带血造血肝细胞经由NK 前体细胞(PNK)分化为成熟NK细胞(mNK)的分化过程中用IL-21 (10ng/ml)和YC-I (0. 5uM) 进行处理。将细胞在IL-15存在的情况下进行培养，接着进行FACS分析。同时，调低IL-21 和YC-I的浓度(10ng/ml IL-21,0. 5uM YC-1)，以使其不影响NK细胞分化。从FACS分析结果来看，当分别用这两者处理时NK细胞略有增加，但同时用这两者 处理时NK细胞显著增加，这表明IL-21和YC-I的共处理具有协同作用。工业实用性如前所述，YC-I和IL-21调节造血肝细胞向自然杀伤细胞分化并增加NK细胞 的杀伤活性。因此，一种用于将造血肝细胞分化为自然杀伤细胞含有YC-l[3-(5'-羟甲 基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]或IL-21作为活性成分的药剂以及用该药剂将造血干细胞 分化为自然杀伤细胞的方法可以有效用于癌症的细胞疗法。本领域技术人员应当理解，以上说明书中公开的内容和具体的实施方案可以容易 地用作修改或设计其它实施方案以实现本发明相同的目的的基础。本领域技术人员还应当 理解，这种同等实施方式并没有背离本发明权利要求书的精神和范围。
权利要求
一种含有YC-1[3-(5′-羟甲基-2′-呋喃)-1-苄基吲唑]作为活性成分的用于NK细胞分化的药剂。
2.根据权利要求1所述的用于NK细胞分化的药剂，其中所述YC-1能够促进造血干细 胞分化为自然杀伤细胞或增加NK细胞的杀伤活性。
3. 一种含有IL-21(白细胞介素21)作为活性成分的抗癌药剂。
4.根据权利要求3所述的抗癌药剂，其中所述癌症选自乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、肝癌、 血癌、结肠癌和肺癌。
5. —种含有YC-l[3-(5'-羟甲基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]和IL-21(白细胞介 素-21)作为活性成分的用于NK细胞分化的药剂。
6. —种含有YC-l[3-(5'-羟甲基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]和IL-21(白细胞介 素-21)作为活性成分的抗癌药剂。
7. —种将造血干细胞分化成NK细胞的方法，其包括如下步骤1)通过向造血干细胞中添加NK前体诱导物来诱导NK前体细胞的增殖；和2)通过向步骤1)的NK前体细胞中添加IL-21和/或YC-1，将NK前体细胞分化为成 熟的NK细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤1)所述NK细胞前体诱导物是SCF和Flt3L。
9.根据权利要求7所述的方法，其中步骤2)的IL-21是一种选自下述的蛋白(a)具有SEQ.ID. NO 1所示的氨基酸序列的蛋白；(b)由具有SEQ.ID. NO 2所示核苷酸序列编码区的DNA编码的蛋白；(c)具有SEQ.ID. NO :1所示氨基酸序列经取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基 酸的氨基酸序列且与具有SEQ. ID. NO 1所示氨基酸的蛋白具有同等功能的蛋白；以及(d)用含有SEQ.ID. NO 2所示的核苷酸序列的DNA在严谨条件下杂交的DNA编码，并 且与具有SEQ. ID. NO 1所示的氨基酸序列的蛋白具有同等功能的蛋白。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述步骤2)的IL-21的剂量为lOng/ml 50ng/ml。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述步骤2)的YC-1的有效剂量为0.5uM 5uM。
12.依据权利要求7所述的方法，其中所述步骤2)的NK前体细胞与IL-15(白细胞介 素-15)共培养。
13. 一种用于治疗癌症的细胞疗法，其含有将由权利要求7所述方法分化得到的NK细 胞施予肿瘤细胞的步骤。
14. 一种增加NK细胞杀伤活性的方法，其含有将IL-21(白细胞介素-21)施予造血干 细胞的步骤。
15 一种增加NK细胞杀伤活性的方法，其含有给药造血干细胞将YC-l[3-(5'-羟甲 基-2'-呋喃)-1_苄基吲唑]施予造血干细胞的步骤。
16. —种增加NK细胞杀伤活性的方法，其含有将YC-l[3-(5'-羟甲基-2'-呋 喃)-1_苄基吲唑]和IL-21(白细胞介素-21)施予造血干细胞的步骤。
17.根据权利要求14-16任一项所述的方法，其中所述造血干细胞正在分化成NK细胞。
18.依据权利要求14-16任一项所述的方法，其中所述造血干细胞与IL-15(白细胞介 素-15)共培养。
19. 一种用于癌症治疗的细胞疗法，其含有将通过权利要求14-16任一方法所得到的 具有改善的杀伤活性的NK细胞施予肿瘤细胞的步骤。
20. YC-1在制备用于NK细胞分化的药剂或抗癌药剂中的应用。
21. IL-21在制备用于NK细胞分化的药剂或抗癌药剂中的应用。
22. YC-1和IL-21在制备用于NK细胞分化的药剂或抗癌药剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于将造血干细胞分化成自然杀伤细胞的药剂和分化的方法，更具体地是涉及一种含有YC-1[3-(5′-羟甲基-2′-呋喃)-1-苄基吲唑]或IL-21(白细胞介素-21)作为活性成分的将造血干细胞分化为自然杀伤细胞的药剂和利用该药剂将造血干细胞分化为天然杀伤细胞的方法。YC-1和IL-21调控造血干细胞向自然杀伤细胞的分化并增加N K细胞的杀伤活性。因此，本发明的用于N K细胞分化的药物能够有效地用作癌症治疗的细胞疗法，其通过调节造血干细胞分化成具有肿瘤细胞杀伤活性的天然杀伤细胞。
文档编号A61K31/416GK101801374SQ200780100131
公开日2010年8月11日 申请日期2007年10月2日 优先权日2007年8月2日
发明者尹沼贤, 尹锡兰, 崔仁杓, 郑秦雄 申请人:韩国生命工学研究院