7。C、含C025v%的培养箱中培养。第二天按照下列浓度加G418进行耐受性测试:200、400、600、800、1000、1200和1400 μδ/mL。保持各孔G418的浓度不变，每3天更换新鲜培养基。筛选到第7天时，引起细胞全部死亡的G418浓度作为MARC-145进行单克隆筛选的最佳药物作用浓度。本发明筛选的最佳G418作用浓度为600 Pg/mL。
[0024]2.2 重组质粒 pC1-pCD163 转染 MARC-145 细胞
具体操作按Lipofectamine? 2000 (Invitrogen)说明书进行。转染在6孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化MARC-145细胞，用10%的胎牛血清DMEM (不含抗生素)稀释细胞，使其密度达到I X 14个细胞/mL，在6孔细胞板上每孔接种2.5 mL，于37。C、含C025v%的培养箱中培养。在灭菌的1.5 mL的离心管中先加入500 μ?,37。C预热的OPT1-MEM无血清培养基，然后加入1.0 μg的重组质粒pC1-p⑶163，轻轻混匀；在另一个灭菌的1.5mL的离心管中先加入500 μ?,37 ° C预热的OPT1-MEM无血清培养基，然后加入2.5 μ?Lipofectamine? 2000转染试剂，轻轻混勾，在室温放置5 min ;然后将两个1.5 mL的离心管中的液体混匀在一起，室温放置20 min ;从CO2培养箱中取出细胞板，弃去上清，把液体混合物轻轻加入到细胞面上，然后立即把细胞板放入0)2培养箱中；温育6 h后，吸掉上清，轻轻加入2.0 mL 37 ° C预热的含10%的胎牛血清DMEM，放入CO2培养箱继续培养。同时设未转染的MARC-145细胞对照。
[0025]2.3 pCD163-MARC 细胞系的筛选
转染24小时后，在培养基中加入600 Pg/mL G418，每3天更换新鲜培养基。筛选到第7天时，对照未转染的MARC-145细胞全部死亡，转染pCI_pCD163的MARC-145细胞出现存活的抗性细胞克隆。挑取单克隆抗性细胞并扩大培养，长成单层后消化细胞制备细胞悬液，测定细胞数量，有限稀释法稀释细胞，接种96孔细胞培养板，使得每个孔细胞数量为1- 2个，于37。C、含C025v%的培养箱中培养，每3天更换一次新鲜的600 Pg/mL G418的生长液。长成单层后消化细胞再进行亚克隆，如此进行3次细胞亚克隆。然后将得到的单克隆细胞株扩大培养，进行鉴定。
[0026]3.pCD163-MARC 细胞系的鉴定
3.1 IFA鉴定
分别将筛选到的P⑶163-MARC细胞和对照MARC-145细胞铺入含有载玻片的24孔板，于37。C、含0)254的培养箱中培养30 ho 30 h后，加入与原培养液等体积的预冷PBS洗涤细胞3次，后用预冷的4%多聚甲醛固定，4。C作用45 min, PBS洗涤3次，每次5min ；加入0.2% TritonX-1OO通透15 min ;然后取出载玻片，加入1:600稀释的小鼠抗pCD163的单克隆抗体，37 ° C作用45 min，PBS洗3次，每次5 min ;加入1:600稀释的Alexa Fluor488标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)的二抗，37 ° C孵育45 min, PBS洗涤3次，每次5 min ；然后将载玻片置于含有60%甘油、0.1%叠氮钠的PBS的长的载玻片上，用指甲油封边。于荧光显微镜下观察，记录结果。结果见图3。筛选到的PCD163-MARC细胞系呈现较亮的绿色荧光，而对照MARC-145细胞荧光较淡，说明P⑶163蛋白在p⑶163-MARC细胞系的表达量明显高于对照MARC-145细胞。
[0027]3.2 Western blot 鉴定
分别将筛选到的P⑶163-MARC细胞和对照MARC-145细胞铺入6孔板，于37。C、含0)254的培养箱中培养30 h? 30 h后弃去培养液，加入与原培养液等体积的预冷PBS洗涤细胞2次，将6孔板置于冰上，加入细胞裂解液裂解细胞30 min后，4。C 12000 rpm离心10 min。取上清液与上样缓冲液混合后煮沸10分钟。将制得的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳后，参照B1-Rad公司半干转印仪操作说明进行电转印，然后进行免疫检测。将丽春红染色后的NC膜转移至封闭液中，室温轻摇I h后4 ° C封闭过夜；倾去封闭液，用洗涤液TBST洗膜5次，每次5 min，然后加入1:5000稀释的小鼠抗P⑶163的单克隆抗体，室温下振荡I h ;再用TBST洗膜5次，每次5 min,然后加入以封闭液1:5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，室温振荡I h ;再用TBST洗膜5次，每次5 min，最后用化学发光显色试剂盒(Supersignal?West Pico Trial Kit)进行显色，在X胶片上曝光、显影和定影观察。
[0028]试验同时设立β-actin对照，一抗为β-actin单克隆抗体(Santa Cruz公司)，二抗为1:5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP。
[0029]检测检测结果见图4，从图中可以看到，P⑶163得到了正确的表达，分子量约120kD。本发明的P⑶163-MARC细胞系中p⑶163蛋白表达量明显高于对照MARC-145细胞。经过B1-Rad ChemiDoc XRS System分析，pCD163_MARC细胞系中pCD163蛋白表达量约为对照MARC-145细胞中⑶163蛋白表达量的8.7倍。将筛选到的p⑶163-MARC细胞系传至20代，通过检测发现均可稳定高效表达PCD163，各代次之间表达量无差异。
[0030]3.3 pCD163-MARC和对照细胞增殖PRRSV的生长曲线测定
将pCD163-MARC细胞与对照细胞同时感染1M0I的PRRSV经典株SD-1株(GenBank No:AY747596)和高致病性毒株 SD-JN株(GenBank No: FJ422123)，分别于 24 h、48 h、72 h、96h和120 h取样，测定TCID5tl，绘制两株病毒的一步生长曲线。检测结果见图5(A)和(B)，两株病毒生长曲线趋势相似，在96 11，在成0163-麻1^细胞的滴度最高分别为1\108_61'(:105(|/mL和 IX 108 3TCID5Q/mL，在对照细胞的滴度最高分别为 IX 108_°TCID5Q/mL 和 IX 17 7TCID5tl/mL, P⑶163-MARC细胞对两株病毒的滴度相比较于对照细胞，有明显提高。
[0031 ] 3.4 pCD163-MARC和对照细胞增殖PRRSV的RNA测定
将上述24 h、48 h、72 h、96 h和120 h取的样品，用TRIzol试剂提取病毒RNA，以oligo(^)12-18为引物进行反转录后的cDNA作为SYBR Green Real-time PCR的模板，测定样品中的 PRRSV 的 RNA。
[0032]SYBR Green Real-time PCR 的引物序列为:
上游引物 N-Fwd: 5 ’ -AATAACAACGGCAAGCAGCAG-3 ’，
下游引物 N-Rev: 5 ’ -CCTCTGGACTGGTTTTGTTGG-3 ’。
[0033]反应条件为:预变性95。C 2 min;然后进行40个循环，循环条件为95。C 15s,61。C I min。结果见图6 (A)和(B)，pCD163_MARC细胞增殖的经典株SD-1株和高致病性毒株SD-JN株PRRSV的RNA明显高于对照细胞。
[0034]4.pCD163-MARC 细胞系的应用
4.1临床样品PRRSV的分离
将本实验室2012.06-2014.06临床上RT-PCR检测阳性的PRRSV病料样品120份同时接种pCD163-MARC细胞与对照细胞，盲传5代，出现明显CPE的判为分离到病毒，分离率分别为100%和85%，pCD163-MARC细胞明显提高了 PRRSV分离率，更适合于临床PRRSV的分离。
[0035]4.2 PRRS疫苗毒的初步生产
将P⑶163-MARC细胞与MARC-145细胞扩大至转瓶培养，同时感染IMOI的广东大华农动物保健品股份有限公司生产的PRRS疫苗JXAl-R株，96 h收毒，在p⑶163-MARC细胞的滴度为lX 108 5TCID5Q/mL，在对照细胞的滴度为I X 107 8TCID5(l/mL。pCD163_MARC细胞较对照细胞有更强的PRRS疫苗JXAl-R株的增殖能力，可以初步应用于PRRS疫苗毒的生产。
[0036]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种表达猪P⑶163的细胞系，其特征是通过以下步骤得到的: 通过RT-PCR扩增获得P⑶163受体基因，将其插入真核表达载体pC1-neo中，构建真核表达质粒pC1-pCD163，将真核表达质粒pC1-pCD163转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得。
2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于RT-PCR扩增获得pCD163受体基因中使用的引物序列如下:pCD163-Fwd(ZAoI):5’ -ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’，pCD163-Rev(AfoiI): 5’ -ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3’。
3.根据权利要求1或2所述的细胞系，其特征在于RT-PCR扩增获得pCD163受体基因中 PCR 反应体系为 25 μ?，含 cDNA I μ?, Mg2+ 1.5 mmoL/L，dNTP 200 MmoL/L，1XLA PCRBuffer 2.5 μ?，pCD163_Fwd UXoI)和 pCD163_Rev OVoiI)各 400 nmoL/L，TaKaRa LA Taq 2U； 反应条件为:预变性95。C 5 min ;然后进行35个循环，循环条件为95。C 45 s，61° C 45 S，72 ° C I min ;然后 72 ° C 延伸 10 min。
4.一种权利要求1-3中任一项所述的细胞系在临床分离PRRSV病毒和生产PRRSV疫苗中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于将含有PRRSV的病料样品接种至所述的细胞系，盲传5代，出现明显CPE的为分离到病毒。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于将所述的细胞系感染PRRS疫苗株，培养若干小时后收毒，用于疫苗的生产。
【专利摘要】本发明涉及生物技术中基因表达领域，特别涉及一种表达猪pCD163的细胞系，通过RT-PCR扩增获得pCD163受体基因，将其插入真核表达载体pCI-neo中，构建真核表达质粒pCI-pCD163，将真核表达质粒pCI-pCD163转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得。所述的细胞系在临床分离PRRSV病毒和生产PRRSV疫苗中的应用。本发明构建的pCD163-MARC细胞系可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV，突破了PRRSV增殖率低的局限性；对临床样品的PRRSV分离率高，病毒增殖滴度高，更加适合于疫苗生产。
【IPC分类】A61P31-14, C12N5-10, A61K39-12, C12N7-00
【公开号】CN104593331
【申请号】CN201510027577
【发明人】杜以军, 王金宝, 丛晓燕, 陈蕾, 齐静, 孙文博, 吴家强, 陈智, 于江, 郭立辉, 任素芳
【申请人】山东省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月20日