氨苄西林对中央记忆性t细胞体外扩增中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于中央记忆性T细胞体外扩增技术领域，更具体地，涉及氨苄西林对中 央记忆性T细胞体外扩增中的应用。
【背景技术】
[0002] 氨苄西林(英语:Ampicillin)，是一种临床上常用广谱青霉素抗生素，为广谱半合 成青霉素，毒性极低。抗菌谱与青霉素相似，对青霉素敏感的细菌效力较低，对草绿色链球 菌的抗菌作用与青霉素相仿或略强。对白喉杆菌、破伤风杆菌和放线菌其效能基本和青霉 素相同。对肠球菌及李斯特菌的作用则优于苄青霉素。对耐药葡萄球菌及其它能产生青霉 素酶的细菌均无抗菌作用。对革兰阴性菌有效，但易产生耐药性。临床主要用于敏感菌所 致的泌尿系统、呼吸系统、胆道、肠道感染以及脑膜炎、心内膜炎等。主要用于伤寒、副伤寒 的治疗；也用于泌尿道、呼吸道感染。
[0003] 由于T细胞在免疫系统中起着重要的作用，越来越多的研宄小组尝试运用T细胞 的过继治疗的方式来进行肿瘤治疗。中央记忆性T细胞（TCM)具有自我更新的能力，而且应 答时间短，作用时间长，对人体的副作用小。今年来，多个研宄组报道，发现具有记忆功能的 T细胞回输肿瘤患者体内以后，治疗效果明显并且持续治疗时间长，可以减少患者的痛苦以 及降低细胞体外培养次数过多的生物安全风险。但是在人体内相对数量较少，且由于体外 长时间培养的T细胞会使T细胞失去活力，绝大部分细胞分化为终末分化的效应细胞，使得 回输体内的T细胞存活时间过短，无法产生持续的杀伤肿瘤细胞的功能，因此如何在体外 获得大量的记忆性T细胞是细胞免疫治疗的一个新的研宄热点。
[0004] 目前，国外的许多研宄小组通过构建人工抗原提呈细胞，将其应用于T细胞的体 外培养，提高T细胞的存活时间，用于过继免疫治疗，但要获得足够量的T细胞，技术要求复 杂，培养的成功率较低。在进行T细胞治疗时，主要策略是先通过克隆扩增，得到足够量的 具有杀伤功能的T细胞，可以与DC等提呈细胞共培养，也可以直接用相关肿瘤抗原刺激细 胞克隆扩增，得到具有特定肿瘤抗原特异性的T细胞。此种办法培养得到的T细胞未经过 任何转基因修饰，安全性较高。但这种肿瘤高反应性的细胞需要扩增至临床需要的l〇9_l〇n 治疗剂量的数量数，过程持续时间比较长，对于肿瘤患者来说时间也是一个需要更多考虑 的因素。而且体外培养的时间长，细胞容易变老，活力下降，多为终末分化的细胞，在体外有 较好的效果，但是在体内存活时间较短，治疗效果受影响。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有中央记忆性T细胞体外扩增技术的不足，提 供氨苄西林对中央记忆性T细胞体外扩增中的应用。
[0006] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 本发明提供了氨苄西林对中央记忆性T细胞在体外扩增上的应用。
[0007] 优选地，所述氨苄西林的浓度为5~40uM。
[0008] 更优选地，所述氨苄西林的浓度为20uM。
[0009] 优选地，所述中央记忆性T细胞为⑶4+T细胞。
[0010] 优选地，所述中央记忆性T细胞的提取方法是先将外周成分血与含2% BSA和0. 5% EDTA的PBS按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者 的比例为1:1 ;离心300Xg 30 min ;小心吸取单核细胞，置入另一离心管中，加入5倍体积 的含0. 5% BSA和2% EDTA的PBS稀释，混合均匀后，300Xg 15 min;重复上一步骤一次； 孵育CD4+ T细胞阴选一抗，15 min;用10倍体积的含0. 5% BSA和2% EDTA的PBS稀释， 混合均勾后，300Xg 12 min;孵育带有磁珠的二抗，30 min;过柱进行细胞分选，得到⑶4+ T细胞。
[0011] 优选地，所述中央记忆性T细胞的培养方法是在5%C02、饱和湿度及37°C条件下 将5X105个/孔的⑶4 +T细胞置于1mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培养。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果： 本发明首次公开了氨苄西林在体外T细胞培养中的应用，方法安全有效，成本低廉，为 过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。
【附图说明】
[0013] 图1为氨苄西林浓度为20uM时对⑶4+T细胞中⑶4+TCM所占比例的检测。
[0014] 图2为不同浓度的氨苄西林对中央记忆性⑶4+T细胞的比例扩增效果。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的 限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0016] 除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
[0017] 实施例1 1、 试验材料准备 人的外周成分血由广州市血液中心提供，试验中随机选取了 24份正常人的血液样本。
[0018] 主要试剂：胎牛血清购自于GIBC0公司；RPMI1640培养基购自于INVERTR0GEN公 司；氨苄西林购自于INVERTR0GEN公司；流式细胞仪检测抗体anti-⑶45RA-TexasRed、 anti-CCR7-AF700\anti-CD62L-PE-cy7购自于BD公司；淋巴细胞分离液购自于天津灏阳 生物制品有限责任公司；CD4+T细胞阴性选择磁珠购自于BD公司。
[0019] 主要的实验仪器：台式高速离心机（EppendorfCentrifuge5810R)、流式细胞 仪（BeckmanCoulter公司）、（1)2细胞培养箱（ThermoSCIENTIFIC)、生物安全柜（Thermo SCIENTIFIC)、倒置生物显微镜（Leica)、磁珠分选磁力架（BDPharmigen)。
[0020] 细胞培养 2. 1细胞提取分离 将外周成分血与PBS缓冲液(含2% BSA、0. 5% EDTA)按1:4混合均匀；然后将稀释后 的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1 ;离心300Xg 30 min;小心吸 取单核细胞，置入另一离心管中，加入5倍体积的PBS(含0.5% BSA、2% EDTA)稀释，混合均 匀后，300Xg 15 min;重复上一步骤一次；孵育⑶4+ T细胞阴选一抗，15 min ;10倍体积 的PBS(含0.5%BSA、2%EDTA)稀释，混合均匀后，300Xg12min;孵育带有磁珠的二抗，30min;过柱进行细胞分选，得到⑶4+T细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640重悬细胞，计 数细胞后调整细胞至所需浓度。
[0021] 2. 2培养条件 在5%C02、饱和湿度及37°C下，将5X105个/孔的CD4 +T细胞置于1mL含10%胎牛 血清的RPMI1640中培养。
[0022] 细胞铺板及加药处理 3. 1铺板 将分选出来的CD4+T细胞铺在12孔板中，按照实验设计，每孔预期的细胞数为5 X 105。
[0023] 3. 2加药处理 对铺板后的CD4+T细胞进行5种不同的处理，每种处理设置三个复孔作为平行对照，并 在细胞培养的第4天，第7天，第10天，第13天施加相应刺激。
【主权项】
1. 氨苄西林对中央记忆性T细胞在体外扩增上的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氨苄西林的浓度为5~40uM。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述氨苄西林的浓度为20uM。
4. 根据权利要求1至3任意一项所述的应用，其特征在于，所述中央记忆性T细胞为 CD4+ T细胞。
5. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中央记忆性T细胞的提取方法是先将 外周成分血与含2% BSA和0. 5% EDTA的PBS按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加 入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1 ;离心300 Xg 30 min ;小心吸取单核细胞，置 入另一离心管中，加入5倍体积的含0.5% BSA和2% EDTA的PBS稀释，混合均匀后，300Xg 15 min ;重复上一步骤一次；孵育⑶4+ T细胞阴选一抗，15 min ;用10倍体积的含0. 5% BSA 和2% EDTA的PBS稀释，混合均匀后，300 Xg 12 min;孵育带有磁珠的二抗，30 min;过柱 进行细胞分选，得到⑶4+ T细胞。
6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中央记忆性T细胞的培养方法是在 5% CO2、饱和湿度及37°C条件下将5 X IO5个/孔的⑶4 + T细胞置于I mL含10%胎牛血清 的RPMI1640中培养。
【专利摘要】本发明提供了氨苄西林对中央记忆性T细胞在体外扩增上的应用，所述氨苄西林的浓度为5~40uM，最适浓度为20uM，所述中央记忆性T细胞为CD4+T细胞。本发明中首次公开了氨苄西林在体外T细胞培养中的应用，方法安全有效，成本低廉，为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。
【IPC分类】C12N5-0783
【公开号】CN104830770
【申请号】CN201510228552
【发明人】张辉, 张译文
【申请人】中山大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月7日