I 与Nrf2染色叠加图像； 图11为Nrf2在MCF-7/R0S细胞中的表达及定位，其中图11-a为MCF-7/R0S细胞的DAPI核染图像(蓝色)，图11-b为MCF-7/R0S细胞的Nrf2染色图像(绿色)，图11-c为MCF-7/ R0S细胞的DAPI与Nrf2染色叠加图像； 图 12 为GSTJr、PKCa、C-Myc的Westernblot检测结果。
【具体实施方式】
[0020] 本发明结合具体实施例对本发明做进一步说明。 实施例
[0021] 一、材料 1、细胞株：人乳腺癌细胞株MCF-7,商购所得。
[0022] 2、仪器、软件和试剂： XFS-280A型压力蒸汽灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司； PH计，BT25S，BSA224S-CW电子天平：SartoriousAG; 磁力搅拌器：江苏中大仪器厂； ThermoBarnsteadNANOpureDlamondUV/UF超纯水系统，高速低温台式离心机，ThermoEC250、140、120垂直电泳仪及电转装置，MultiskanSpectrum全波长酶标仪，高速低 温台式离心机：ThermoScientific; ZHJH-C1112型超净工作台，HH-6型恒温水浴锅，二氧化碳培养箱：上海智诚分析仪器 制造有限公司； KQ-500Z型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司； TL-2000C型医用检测自动旋转振荡仪：姜堰市天力医疗器械有限公司； 微量加样器：Eppendorf公司； 倒置生物显微镜：宁波舜宇仪器有限公司； 激光共聚焦显微镜：莱卡公司； 流式细胞仪：BD公司； 凝胶成像系统，QuantityOne图像处理软件：Bio_Rad公司； SPSS13. 0统计软件包：SPSS公司； MTT(溴化-(4, 5)-二甲基-2-噻唑基-2, 5-二苯基四氮唑)，阿霉素，紫杉醇，顺钼， 5_氟尿嘧啶，硫酸长春新碱，DMS0,DAPI，DCFH-DA:Sigma公司； 小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司； RPMI1640培养基：Gibco公司； Westernblot相关试剂及抗体：武汉博士德生物技术有限公司。
[0023] 二、构建方法 1、细胞培养：取对数生长期的人乳腺癌细胞株MCF-7,使用含10 %小牛血清的RPMI1640培养基，调整细胞浓度为1-2. 5X104个/mL，取细胞悬液5mL置于50mL玻璃培养瓶中， 于37°C、5%C02孵箱中培养过夜，使其贴壁生长，分组备用。
[0024] 2、筛选培养条件：从步骤（1)所得备用细胞中取5组细胞，使用含10%小牛血清 的RPMI1640培养基并给予不同浓度的H202，持续培养4周；各组细胞对应的H202浓度分别 为 0? 001iimol/L，0? 01iimol/L，0? 1iimol/L，1iimol/L，10iimol/L。培养过程中隔天随更换 培养基更换新鲜的H202。倒置显微镜连续观察细胞生长状态，4周后仍存活的细胞组对应的 H202浓度为 0? 001Umol/L，0? 01i!mol/L，0? 1i!mol/L，选择最高浓度 0? 1i!mol/L作为MCF-7 细胞耐药模型的最优造模浓度。
[0025] 3、构建耐药模型：取1组备用细胞，使用含10%小牛血清的RPMI1640培养 基+0.liimol/LH202连续培养，培养过程中隔天趁更换新鲜培养基时给予新鲜配置的 0.liimol/LH202。当细胞生长至约80%-90%汇合时传代：轻摇振荡培养瓶后倾弃培养液， PBS工作液漂洗2遍后加入适量的2. 5g/L胰蛋白酶，室温下倒置显微镜观察消化过程， 待单层的细胞成片收缩，细胞逐渐变圆，加入含10%小牛血清的RPMI1640培养液终止消 化，制成单细胞悬液。取样镜下计数，调整细胞浓度仍为1-2.5X104个/mL，每组取细胞悬 液5mL置于新的50mL玻璃培养瓶中，于37°C、5%C02孵箱中培养过夜贴壁，之后继续按照 上述给药方式进行条件培养。
[0026] 4、耐药性跟踪指导的循环培养：每隔2-3周对培养的细胞进行耐药倍数评价，即 MTT法检测细胞抑制率：检测时从瓶中取出一些细胞，以5X104个/mL密度接种于96孔培 养板中，每孔180yL，加入各种浓度的抗肿瘤药，培养48小时，每孔细胞加入MTT溶液10 iiL(5mg/mL)，并继续培养4h后离心、弃上清。每孔加入150iiL二甲基亚砜，37°C震荡 10分钟后用酶标仪在570nm波长处测其0D值，计算细胞抑制率。当相同药物浓度下模型组 抑制率显著低于空白对照组抑制率时，初步判断细胞产生耐药性。耐药性达到预期之前，造 模组需重复执行步骤3的相关操作继续条件培养。培养20周后冻存细胞，即为MCF-7/R0S 细胞。该细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-C201520。
[0027] 在执行上述步骤3及步骤4的同时，参照上述实验条件另取5组备用细胞做平行 试验，其中一组为空白对照（细胞组1)，使用含10 %小牛血清的RPMI1640培养基+同样 给药体积的PBS;其余各组使用含10%小牛血清的RPMI1640培养基+相应药物进行连续 培养。各组细胞对应的孵育药物见表1。
[0028] 表1各细胞组及其对应的孵育药物 三、检测方法及结果 采用下述方法评价模型细胞的耐药特征。
[0029] 法检测模型细胞的耐药性： MTT法检测各浓度抗肿瘤药对各组细胞的抑制率，计算IC5(I值，结果如图1和表2所示。
[0030] 从图1可以看出，阳性对照(细胞组2)阿霉素长期孵育诱导的多药耐药，在孵育过 程中加入R0S消除剂GSH(细胞组3)可显著降低其相应IC5(I浓度，证实R0S确为多药耐药 形成的重要因素。
[0031] 图1还表明，使用0? 001、0. 01和0? 1iimol/LH202 (分别对应细胞组4、5、6)连续 培养20周所得细胞对阿霉素和紫杉醇的耐药性均与所加H202浓度呈正相关，证实H202的最 优造模浓度确为〇? 1Umol/L。
[0032] 根据表2可知，MCF-7/R0S对阿霉素、紫杉醇、顺钼、5-氟尿嘧陡、长春新碱的耐药 指数分别为13. 99、4. 61、5. 32、1. 73、8. 80,指示所得细胞株具有肿瘤多药耐药的特征。
[0033] 表2细胞株对各化疗药物的IC5Q及耐药指数
【主权项】
1. 一种构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法，其特征在于，包括以ROS为孵育药物对敏 感肿瘤细胞进行持续培养、使敏感肿瘤细胞产生多药耐药的步骤。
2. 如权利要求1所述构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法，其特征在于，所述ROS为 H2O2。
3. 如权利要求1所述构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法，其特征在于，所述敏感肿瘤 细胞为人乳腺癌细胞MCF-7。
4. 如权利要求1-3任一所述构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法，其特征在于，所述方 法的具体步骤是： (1) 细胞培养：选择某种对化疗药物敏感的肿瘤细胞株，调整细胞浓度，分组培养备 用； (2) 筛选培养条件：各组细胞分别使用不同的ROS浓度进行持续培养，4周后在存活细 胞组中选择最高的ROS浓度作为该种耐药模型的最优造模浓度； (3) 构建耐药模型：选用对数生长期的该种肿瘤细胞，调整细胞浓度，使用步骤（2)所 得的最优造模浓度持续培养肿瘤细胞，培养过程中按生长情况传代； (4) 耐药性跟踪指导的循环培养：每隔2-3周对步骤（3)中的ROS培养细胞进行耐药倍 数评价；重复执行步骤（3)的相关操作，直到评价结果提示细胞产生的耐药性符合预期；冻 存细胞。
5. 如权利要求4所述构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法，其特征在于，步骤（3)所用 ROS为H2O2，浓度0? I ii mol/L，培养时间为20周。
6. 如权利要求5所述构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法，其特征在于，各步骤所用培 养基为含10%小牛血清的RPMI 1640培养基。
7. 如权利要求5或6所述构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法，其特征在于，步骤（2)及 步骤（3)培养细胞过程中隔天随更换培养基更换R0S。
8. 根据权利要求2所述方法建立的人乳腺癌多药耐药细胞株，其特征在于，所述细 胞株命名为MCF-7/R0S，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学， 430072 ;保藏日期：2015年1月28日；保藏编号为CCTCC-C201520。
【专利摘要】本发明属于肿瘤生物学领域，涉及一种体外构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法，包括以ROS为孵育药物对敏感肿瘤细胞进行持续培养、使敏感肿瘤细胞产生多药耐药的步骤。同时还涉及通过该法建立的人乳腺癌多药耐药细胞株，该细胞株命名为MCF-7/ROS，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072；保藏日期：2015年1月28日；保藏编号为CCTCC-C201520。本发明提供的方法过程简单，造模条件稳定，可显著降低造模成本，具有广泛的适用性。以此建立的MCF-7/ROS细胞株可作为研究相关机制、靶点探索和新药筛选的优势实验模型。CCTCC-C20152020150128
【IPC分类】C12N5-09
【公开号】CN104745531
【申请号】CN201510075926
【发明人】岑娟, 张峰, 姬汴生, 刘路, 刘芳芳, 邹玉
【申请人】河南大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年2月13日