专利名称：一种基于β-环糊精的聚合物的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于聚合物的药物用途，涉及一种聚合物胶束给药系统在抑制耐药肿瘤细胞中的应用，尤其涉及聚合物胶束给药系统通过P-gp抑制作用逆转肿瘤细胞耐药性的应用。
背景技术：
肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，每年约有60％的癌症患者由于无效治疗而离世。肿瘤化疗是目前应用较为广泛的肿瘤治疗手段，但仍然存在自身局限性，如治愈率低、毒副作用大、多药耐药性等重大问题。其中，多药耐药性是肿瘤临床化疗失败的主要原因之一。90％转移性癌症患者的死因与肿瘤细胞对抗肿瘤细胞药物的耐药直接或间接相关。因此，寻找能够逆转肿瘤细胞耐药性的给药系统已成为肿瘤化疗与研究的重要指导原则。
研究发现，有多种因素可导致肿瘤多药耐药性的产生，广为接受的是P-糖蛋白(P-gp)学说。糖蛋白(P-gp)主要分布在细胞膜，是依赖ATP酶的药物输出泵，也是一种Ca2+与Cl--通道。P-gp蛋白可以与进入细胞浆内的抗肿瘤药物结合，借助于ATP水解所释放出的能量，直接或间接的将药物泵出细胞膜，或借助与P-gp自身的通道作用将药物从胞内泵出至胞外，从而造成药物胞内有效浓度低，细胞毒性减弱从而产生多药耐药性，大大削弱了化疗的效果。
研究显示，个别聚合物载体在一定程度上可以缓解肿瘤的多药耐药性。Pluronic 85聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三聚体(PEO-PPO-PEO)包裹抗肿瘤药物时，在聚合物浓度接近临界胶束浓度时可以发挥较好的抗肿瘤效果，并可以抑制P-gp对药物的排出作用。一方面聚合物胶束的嵌入改变了细胞膜的流动性，另一方面聚合物胶束减少了耐药细胞株的ATP量，两者的协同作用使得被耐药株泵出胞外的抗肿瘤药物的量明显减小，从而表现出良好的对肿瘤耐药性的逆转。
聚合物胶束(Polymer micelle)是近几年蓬勃发展的一类新型的纳米给药系统。具有增溶、低毒、靶向及长循环等特点。聚合物胶束由两亲性的材料在水性环境中自发形成，具有独特的核-壳结构。其内核的疏水性空间为疏水性药物提供稳定的包埋空间，亲水性外壳可以进行一定的修饰而达到使胶束长循环或靶向的作用。胶束可以用于包裹各类疏水性难容药物或蛋白质，较大的疏水性空间及足够的稳定性为胶束这种药物载体的应用提供了更大的发展空间。
β-CD是一种已被FDA批准的应用广泛的药物载体及药物辅料，虽然有大量文献报道了β-CD在药物及基因载体方面的成功应用，但由于β-CD疏水性空间大小的有限性限制了它的一定的应用。聚乙二醇(mPEG)、聚丙交酯(PLA)及聚己内酯(PCL)也是已被FDA批准应用的具有良好生物相容性和生物可降解的材料，广泛应用于药物辅料、药物载体及组织支架工程等。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于β-环糊精的聚合物胶束给药系统在制备抑制耐药肿瘤细胞P-糖蛋白(P-gp)药物中的应用。该聚合物由β-环糊精(β-CD)及接枝的两亲性化合物PLA-PEG或PCL-PEG通过化学键合而成，该聚合物可以在水性环境中自发形成聚合物胶束，由于疏水性可生物降解的PLA或PCL在β-CD与mPEG之间插入，使得β-CD的疏水性区域有效扩大，从而可最大限度地增溶疏水性抗肿瘤药物分子，促进疏水性抗肿瘤药物向肿瘤组织浓集。本发明基于β-CD的两亲性聚合物的组成及制备，已为专利“一种两亲性环糊精聚合物及制备方法和用途”(专利申请号2008100623558)所涵盖。
本发明所述聚合物的结构如下
其中X1是-NH-(CH2)2-NH- X2是-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)- Y是聚丙交酯(PLA)或聚己内酯(PCL)，分子量0-5000；
Z是聚乙二醇单甲醚mPEG，分子量2000-5000；
本发明提供的基于β-CD的聚合物胶束可表现出显著的抑制肿瘤细胞P-gp的特点，通过对比P-gp底物若丹明R123在阿霉素敏感细胞MCF7和耐药细胞MCF7/ADR的细胞内积累的比较，进一步证实所产生的抑制作用可由聚合物化学结构控制，尤其是疏水链段PLA或PCL在β-CD和mPEG之间的插入，对于限制耐药肿瘤细胞的药物外排、显著提高抗肿瘤药物在细胞内的有效浓度、逆转肿瘤细胞的耐药性，具有非常重要的作用，最终达到提高抗肿瘤药物疗效的目的。
本发明的有益之处，是为多药耐药肿瘤细胞，提供一种可抑制P-gp作用的聚合物胶束给药系统。该聚合物胶束给药系统具有良好的生物相容性、药物装载性，并可显著抑制耐药肿瘤细胞的P-gp作用，有效逆转耐药肿瘤细胞的耐药性等特点。并且本发明对于改善其它与P-gp相关的给药效应，例如口服小肠药物吸收、基因给药、中枢神经系统给药等都具有启发意义。
图1为各种浓度疏水链为PLA的聚合物胶束溶液对于MCF-7敏感细胞及MCF-7/ADR耐药细胞细胞内R123积累的影响作用。(A)β-CD-PLA1000-mPEG2000，(B )β-CD-PLA2000-mPEG2000(C)β-CD-PLA2000-mPEG5000(D)β-CD-PLA4000-mPEG5000。
图2为各种浓度疏水链为PCL的聚合物胶束溶液对于MCF-7敏感细胞及MCF-7/ADR耐药细胞细胞内R123积累的影响作用。(A)β-CD-PCL2000-mPEG2000，(B)β-CD-PCL2000-mPEG5000(C)β-CD-PCL5000-mPEG5000。
图3为各种浓度的β-CD-mPEG2000聚合物胶束对于MCF-7敏感细胞及MCF-7/ADR耐药细胞细胞内R123积累的影响作用。
图4为疏水链为PLA的聚合物的1H NMR图谱(A)β-CD-PLA 1000-mPEG2000(B)β-CD-PLA2000-mPEG2000(C)β-CD-PLA2000-mPEG5000(D)β-CD-PLA4000-mPEG5000(氘代二甲亚砜)。
图5为疏水链为PCL的聚合物的1H NMR图谱(A)β-CD-PCL2000-mPEG2000(B)β-CD-PCL2000-mPEG5000(C)β-CD-PCL5000-mPEG5000(氘代二甲亚砜)。
图6为β-CD-mPEG2000的1H NMR图谱(氘代二甲亚砜)。
具体实施例方式 本发明通过实施例和附图作进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。
实施例1β-CD-PLA1000-mPEG2000(YPLA，分子量1000；ZmPEG，分子量2000)聚合物胶束在抑制P-gp中的应用 1.β-CD-PLA1000-mPEG2000聚合物胶束的制备及理化性质测定
氨基活化反应 将11.3g(10mmol)β-CD溶于75ml吡啶中，慢慢滴加25ml含有13.3g(70mmol)对甲苯磺酰氯(TsCl)的吡啶溶液，冰水浴条件磁力搅拌反应4h，再于室温下继续搅拌20h。停止反应后，在40℃条件下减压蒸除大部分吡啶，用乙醚浸泡2天后成细粉状，水洗，过滤，再用丙酮浸泡1d，过滤后真空干燥。
将5.0g磺酰化后的β-CD加入到20ml乙二胺中，40℃下反应48h。将反应液减压浓缩后倒入100ml丙酮中沉淀，过滤后真空干燥，用10ml甲醇/水(1/1，体积比)混合溶剂，0.45μm纤维素膜过滤后，冻干得到产物即氨基化
(β-CDen7)。
(2)端羟基Y-Z聚合物合成 采用开环聚合方法合成。称取4.0g(1mmol)mPEG2000和2.0g(1mmol)丙交酯(LA)加入反应管中，0.01g辛酸亚锡(Sn(Oct)2)作为催化剂，抽真空2h后封管，升温至130℃反应24h。冷却后用10ml二氯甲烷溶解，乙醚沉淀，过滤，重复两次后真空干燥24h得到产物mPEG2000-PLA1000。
(3)Y-Z聚合物端羟基活化 将3.0g(1mmol)mPEG2000-PLA1000溶于80ml二氧六环(Dioxane)中，加入DMAP 0.122g(0.12mmol)，TEA 0.14ml(0.12mmol)，待完全溶解混匀后，慢慢滴加20ml含0.125g(0.12mmol)琥珀酸酐的二氧六环溶液，反应1天后减压浓缩反应液，倒入乙醚中沉淀，过滤干燥，二氯甲烷溶解，乙醚沉淀后真空干燥，得到含羧基端的嵌段共聚物mPEG2000-PLA1000-COOH。
(4)环糊精聚合物合成 将1.53g(0.5mmol)mPEG2000-PLA1000-COOH溶于40ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，在氮气保护条件下，依次加入DCC 0.114g(0.07mmol)，DMAP0.012g(0.07mmol)，β-CDen70.105g(0.07mmol)，反应1天后倒入乙醚中沉淀，过滤抽干后，重新用DMF溶解，0.45μm偏氟膜过滤，转入截留分子量7000的透析袋中透析2天，冻干得到聚乙二醇单甲醚-聚丙交酯修饰环糊精聚合物β-CD-PLA1000-mPEG2000，其核磁谱图见附图4(A)。
(5)采用芘荧光法，测定聚合物胶束临界胶束浓度。
制备不同浓度的β-CD-PLA1000-mPEG20007两亲性星型聚合物胶束溶液各10ml，分别加入定量的芘(芘的终浓度为6×10-7mol/L)，40℃水浴8小时。扫描芘的激发和发射光谱，并测定I333/I338倾斜度的突然变化，确定该胶束的临界胶束浓度为0.0089mg/mL。
2.β-CD-PLA1000-mPEG2000聚合物胶束的载药胶束 取6mg盐酸阿霉素溶于2ml氯仿并加入3倍当量的三乙胺进行脱盐，另取β-CD-PLA1000-mPEG20007聚合物20mg，溶于40ml去离子水中，制成浓度为0.5mg/mL的聚合物溶液。将脱盐后的疏水性阿霉素溶液在高速均质机搅拌作用下加入到聚合物水溶液中制成均一的O/W乳液。室温下磁力搅拌挥去氯仿有机溶剂后，将载药体系过过0.45um的水膜除去阿霉素及聚合物聚集体，冷冻干燥待用。
经测定，载药胶束的粒径为203nm，包封率为69.7％，载药量为16.1％。
3.β-CD-PLA 1000-mPEG2000聚合物胶束的细胞毒性 本发明分别以乳腺癌细胞(MCF-7)细胞和乳腺癌耐药细胞(MCF7/ADR)为模型细胞，评价β-CD-PLA1000-mPEG2000聚合物胶束及载阿霉素聚合物胶束的细胞毒性。
具体方法为分别以乳腺癌细胞(MCF-7细胞)和乳腺癌耐药细胞(MCF7/ADR细胞)为模型细胞，在96孔细胞培养板中，每孔加入100ul含1×105个MCF-7细胞和MCF7/ADR细胞的培养液，置于5％CO2，37℃培养箱中培养24小时，待细胞完全贴壁后，细胞中加入不同浓度的β-CD-PLA1000-mPEG20007两亲性星型聚合物胶束溶液、载药阿霉素聚合物胶束溶液及游离阿霉素溶液，以未经处理的空白细胞为对照，每孔设4复孔。正常RMPI1640继续培养24小时，每孔加入5mg/mL的MTT 31.5ul，置5％CO2，37℃培养箱中培养4小时弃去上清液，每孔加入200ul二甲基亚砜溶液，用酶标仪测定吸光值，计算细胞抑制率。细胞抑制率计算公式如下 细胞抑制率％＝(空白对照组吸光值-实验组吸光值)/空白对照组吸光值×100％ 经测定，β-CD-PLA1000-mPEG20007聚合物胶束对二种细胞的细胞毒性非常小，经24小时的作用后四种细胞的存活率依然在75％以上，细胞毒性均为0～1级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PLA1000-mPEG2000-DOX)及游离阿霉素的两种细胞的IC50见表1，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。
表1游离阿霉素溶液和载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PLA1000-mPEG2000-DOX)对MCF7敏感株和MCF7/ADR耐药株的细胞毒性
4.β-CD-PLA1000-mPEG2000聚合物胶束P-gp蛋白的抑制作用 本发明通过对罗丹明123(R123)的含量测定来评价β-CD-PLA1000-mPEG20007两亲性聚合物材料自身的P-gp蛋白抑制作用。R123为P-gp蛋白的结合底物，环孢素霉A(CsA)为P-gp蛋白的抑制剂。取对数生长期的MCF-7敏感细胞和MCF-7/ADR耐药细胞(1.0×105个/mL)用胰酶消化、PBS洗涤、离心后用缓冲溶液(122mM NaCl、25mM NaHCO3、10mM葡萄糖、10mM HEPES、3mM KCl、1.2mM MgSO4、1.4mM CaCl2、0.4mMKH2PO 4pH＝7.4)在37℃下孵育30分钟。将5mM R123和各种浓度的β-CD-PLA1000-mPEG20007两亲性星型聚合物(w/v)或是CsA预先于37℃下平衡30分钟。30分钟后将细胞中的缓冲液吸去分别加入预先平衡好的R123-聚合物溶液或是R123-CsA溶液，整个体系在37℃下孵育90分钟后吸去细胞上清液并用冰的缓冲液冲洗细胞3次，用含有1％的Triton X-100裂解细胞后于14000rmp下离心5分钟，取上清液进行荧光测定。(ex＝485nm，em＝530nm)荧光值需折合到细胞蛋白水平。上述实验，每组重复2次，每个浓度设4个复孔。
细胞蛋白浓度测定离心收集细胞，用含有1mM EDTA和0.1％(v/v)的蛋白酶抑制剂的缓冲液处理细胞30分钟，随后水浴超声30分钟并震摇15分钟，将细胞置于EP管中于1000rmp下离心10分钟，取上清液用蛋白测定试剂盒进行测定。
不同浓度β-CD-PLA1000-mPEG2000两亲性聚合物胶束溶液及CsA溶液处理后的细胞R123水平见图1(A)。研究结果表明，β-CD-PLA1000-mPEG20007聚合物胶束溶液对于R123细胞内的积累具有一定的影响作用。可在一定浓度范围内可以达到与CsA P-gp蛋白抑制剂相近或是优于CsA P-gp蛋白抑制剂的效果，较未添加抑制剂组相比，最高可增加2.6倍的R123的摄取吸收。β-CD-PLA1000-mPEG2000两亲性聚合物胶束自身具有一定的P-gp蛋白抑制作用。
实施例2β-CD-PLA2000-mPEG2000(YPLA，分子量2000；ZmPEG，分子量2000)聚合物胶束在抑制P-gp中的应用 1.β-CD-PLA2000-mPEG2000聚合物胶束的制备及理化性质测定
氨基活化反应方法同实施例1的1(1)。
(2)端羟基Y-Z聚合物合成 方法同实施例1的1(2)。mPEG2000用量为2g，丙交酯用量为2g，辛酸亚锡用量为0.01g。
(3)Y-Z聚合物端羟基活化 方法同实施例1的1(3)。mPEG2000-PLA2000∶DMAP∶TEA∶琥珀酸酐＝1∶1.2∶1.2∶1.2(mol/mol)。
(4)环糊精聚合物合成 方法同实施例1的1(4)。mPEG2000-PLA2000-COOH∶DCC∶DMAP∶β-CDen7＝1∶7.2∶7.2∶7.2(mol/mol)。聚合物核磁谱图见附图4(B)。
(5)采用芘荧光法，测定聚合物胶束临界胶束浓度 方法同实施例1的1(5)。确定该胶束的临界胶束浓度为0.0032mg/mL。
2.β-CD-PLA2000-mPEG2000聚合物胶束的载药胶束 方法同实施例1的2。经测定，载药胶束的粒径为164nm，包封率为77.9％，载药量为18％。
3.β-CD-PLA2000-mPEG2000聚合物和载药的细胞毒性 方法同实施例1的3。经测定，β-CD-PLA2000-mPEG2000聚合物对二种细胞的细胞毒性非常小，经24小时的作用后四种细胞的存活率依然在75％以上，细胞毒性均为0～1级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PLA2000-mPEG2000-DOX)及游离阿霉素的两种细胞的IC50见表2，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。
表2游离阿霉素溶液和载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PLA2000-mPEG2000-DOX)对MCF7敏感株和MCF7/ADR耐药株的细胞毒性
4.β-CD-PLA2000-mPEG2000聚合物胶束P-gp蛋白的抑制作用方法同实施例1的4。
不同浓度β-CD-PLA2000-mPEG2000两亲性星型聚合物胶束溶液及CsA溶液处理后的细胞R123水平见图1(B)。研究结果表明，β-CD-PLA2000-mPEG20007两亲性星型聚合物胶束溶液对于R123细胞内的积累具有一定的影响作用。可在一定浓度范围内可以达到与CsA P-gp蛋白抑制剂相近或是优于CsA P-gp蛋白抑制剂的效果，较未添加抑制剂组相比，最高可增加2.7倍的R123的摄取吸收。β-CD-PLA2000-mPEG20007两亲性聚合物胶束自身具有一定的P-gp蛋白抑制作用。
实施例3β-CD-PLA2000-mPEG5000(YPLA，分子量2000；ZmPEG，分子量5000)聚合物胶束在抑制P-gp中的应用 1.β-CD-PLA2000-mPEG5000聚合物胶束的制备及理化性质测定
氨基活化反应方法同实施例1的1(1)。
(2)端羟基Y-Z聚合物合成 方法同实施例1的1(2)。mPEG5000用量为5g，丙交酯用量为2g，辛酸亚锡用量为0.01g。
(3)Y-Z聚合物端羟基活化 方法同实施例1的1(3)。mPEG5000-PLA2000∶DMAP∶TEA∶琥珀酸酐＝1∶1.2∶1.2∶1.2(mol/mol)。
(4)环糊精聚合物合成 方法同实施例1的1(4)。mPEG5000-PLA2000-COOH∶DCC∶DMAP∶β-CDen7＝1∶7.2∶7.2∶7.2(mol/mol)。聚合物核磁谱图见附图4(C)。
(5)采用芘荧光法，测定聚合物胶束临界胶束浓度 方法同实施例1的1(5)。确定该胶束的临界胶束浓度为0.01mg/mL。
2.β-CD-PLA2000-mPEG5000聚合物胶束的载药胶束 方法同实施例1的2。经测定，载药胶束的粒径为163nm，包封率为72.3％，载药量为17.8％。
3.β-CD-PLA2000-mPEG5000聚合物和载药的细胞毒性 方法同实施例1的3。经测定，β-CD-PLA2000-mPEG5000聚合物对二种细胞的细胞毒性非常小，经24小时的作用后四种细胞的存活率依然在75％以上，细胞毒性均为0～1级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PLA2000-mPEG5000-DOX)及游离阿霉素的两种细胞的IC50见表3，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。
表3游离阿霉素溶液和载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PLA2000-mPEG5000-DOX)对MCF7敏感株和MCF7/ADR耐药株的细胞毒性
4.β-CD-PLA2000-mPEG5000聚合物胶束P-gp蛋白的抑制作用 方法同实施例1的4。
不同浓度β-CD-PLA2000-mPEG5000两亲性星型聚合物胶束溶液及CsA溶液处理后的细胞R123水平见图1(C)。研究结果表明，β-CD-PLA2000-mPEG50007两亲性星型聚合物胶束溶液对于R123细胞内的积累具有一定的影响作用。可在一定浓度范围内可以达到与CsA P-gp蛋白抑制剂相近或是优于CsA P-gp蛋白抑制剂的效果，较未添加抑制剂组相比，最高可增加2.69倍的R123的摄取吸收。β-CD-PLA2000-mPEG50007两亲性聚合物胶束自身具有一定的P-gp蛋白抑制作用。
实施例4β-CD-PLA4000-mPEG5000(YPLA，分子量4000；ZmPEG，分子量5000)聚合物胶束在抑制P-gp中的应用 1.β-CD-PLA4000-mPEG50007聚合物胶束的制备及理化性质测定
氨基活化反应方法同实施例1的1(1)。
(2)端羟基Y-Z聚合物合成 方法同实施例1的1(2)。mPEG5000用量为5g，丙交酯用量为4g，辛酸亚锡用量为0.02g。
(3)Y-Z聚合物端羟基活化 方法同实施例1的1(3)。mPEG5000-PLA4000∶DMAP∶TEA∶琥珀酸酐＝1∶1.2∶1.2∶1.2(mol/mol)。
(4)环糊精聚合物合成 方法同实施例1的1(4)。mPEG5000-PLA4000-COOH∶DCC∶DMAP∶β-CDen7＝1∶7.2∶7.2∶7.2(mol/mol)。聚合物核磁谱图见附图4(D)。
(5)采用芘荧光法，测定聚合物胶束临界胶束浓度 方法同实施例1的1(5)。确定该胶束的临界胶束浓度为0.0023mg/mL。
2.β-CD-PLA4000-mPEG5000聚合物胶束的载药胶束 方法同实施例1的2。经测定，载药胶束的粒径为121nm，包封率为84.3％，载药量为18.7％。
3.β-CD-PLA4000-mPEG5000聚合物和载药的细胞毒性 方法同实施例1的3。经测定，β-CD-PLA4000-mPEG5000聚合物对二种细胞的细胞毒性非常小，经24小时的作用后四种细胞的存活率依然在75％以上，细胞毒性均为0～1级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PLA4000-mPEG5000-DOX)及游离阿霉素的两种细胞的IC50见表4，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。
表4游离阿霉素溶液和载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PLA4000-mPEG5000-DOX)对MCF7敏感株和MCF7/ADR耐药株的细胞毒件
4.β-CD-PLA4000-mPEG5000聚合物胶束P-gp蛋白的抑制作用 方法同实施例1的4。
不同浓度β-CD-PLA4000-mPEG5000两亲性星型聚合物胶束溶液及CsA溶液处理后的细胞R123水平见图1(D)。研究结果表明，β-CD-PLA4000-mPEG50007两亲性星型聚合物胶束溶液对于R123细胞内的积累具有一定的影响作用。可在一定浓度范围内可以达到与CsA P-gp蛋白抑制剂相近或是优于CsA P-gp蛋白抑制剂的效果，较未添加抑制剂组相比，最高可增加3.23倍的R123的摄取吸收。β-CD-PLA4000-mPEG50007两亲性聚合物胶束自身具有一定的P-gp蛋白抑制作用。
实施例5β-CD-PCL2000-mPEG2000(YPCL，分子量2000；ZmPEG，分子量2000)两亲性聚合物胶束在抑制P-gp中的应用
氨基活化反应方法同实施例1的1(1)。
(2)端羟基Y-Z聚合物合成 方法同实施例1的1(2)。mPEG2000用量为2g，PCL用量为2g，辛酸亚锡用量为0.01g。
(3)Y-Z聚合物端羟基活化 方法同实施例1的1(3)。mPEG2000-PCL2000∶DMAP∶TEA∶琥珀酸酐＝1∶1.2∶1.2∶1.2(mol/mol)。
(4)环糊精聚合物合成 方法同实施例1的1(4)。mPEG2000-PCL2000-COOH∶DCC∶DMAP∶β-CDen7＝1∶7.2∶7.2∶7.2(mol/mol0。聚合物核磁谱图见附图5(A)。
(5)采用芘荧光法，测定聚合物胶束临界胶束浓度 方法同实施例1的1(5)。确定该胶束的临界胶束浓度为0.0044mg/ml。
2.β-CD-PCL2000-mPEG2000聚合物胶束的载药胶束 方法同实施例1的2。
经测定，载药胶束的粒径157nm，包封率为84.7％，载药量为15.7％。
3.β-CD-PCL2000-mPEG2000聚合物和载药的细胞毒性 方法同实施例1的3。
经测定，β-CD-PCL2000-mPEG2000聚合物对二种细胞的细胞毒性非常小，经48小时的作用后四种细胞的存活率依然在75％以上，细胞毒性均为0～1级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PCL2000-mPEG2000-DOX)及游离阿霉素的两种细胞的IC50见表5，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。
表5游离阿霉素溶液和载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PCL2000-mPEG2000-DOX) 对MCF7敏感株和MCF7/ADR耐药株的细胞毒性
4.β-CD-PCL2000-mPEG2000聚合物胶束P-gp蛋白的抑制作用 方法同实施例1的4。
不同浓度β-CD-PCL2000-mPEG20007两亲性星型聚合物胶束溶液及CsA溶液处理后的细胞R123水平见图2(A)。研究结果表明，β-CD-PCL2000-mPEG20007两亲性星型聚合物胶束溶液对于R123细胞内的积累具有一定的影响作用。可在一定浓度范围内可以达到与CsA P-gp蛋白抑制剂相近或是优于CsA P-gp蛋白抑制剂的效果，较未添加抑制剂组相比，最高可增加3.43倍的R123的摄取吸收。β-CD-PCL2000-mPEG20007两亲性星型聚合物胶束自身具有一定的P-gp蛋白抑制作用。
实施例6β-CD-PCL2000-mPEG5000(YPCL，分子量2000；ZmPEG，分子量5000)两亲性聚合物胶束在抑制P-gp中的应用
氨基活化反应方法同实施例1的1(1)。
(2)端羟基Y-Z聚合物合成 方法同实施例1的1(2)。mPEG5000用量为5g，PCL用量为2g，辛酸亚锡用量为0.01g。
(3)Y-Z聚合物端羟基活化 方法同实施例1的1(3)。mPEG5000-PCL2000∶DMAP∶TEA∶琥珀酸酐＝1∶1.2∶1.2∶1.2(mol/mol)。
(4)环糊精聚合物合成 方法同实施例1的1(4)。mPEG5000-PCL2000-COOH∶DCC∶DMAP∶β-CDen7＝1∶7.2∶7.2∶7.2(mol/mol)。聚合物核磁谱图见附图5(B)。
(5)采用芘荧光法，测定聚合物胶束临界胶束浓度 方法同实施例1的1(5)。确定该胶束的临界胶束浓度为0.0048mg/ml。
2.β-CD-PCL2000-mPEG5000聚合物胶束的载药胶束 方法同实施例1的2。经测定，载药胶束的粒径197nm，包封率为84.3％，载药量为15.9％。
3.β-CD-PCL2000-mPEG5000聚合物和载药的细胞毒性 方法同实施例1的3。
经测定，β-CD-PCL2000-mPEG5000聚合物对二种细胞的细胞毒性非常小，经48小时的作用后四种细胞的存活率依然在75％以上，细胞毒性均为0～1级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PCL2000-mPEG5000-DOX)及游离阿霉素的两种细胞的IC50见表6，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。
表6游离阿霉素溶液和载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PCL2000-mPEG5000-DOX)对MCF7敏感株和MCF7/ADR耐药株的细胞毒性
4.β-CD-PCL2000-mPEG5000聚合物胶束P-gp蛋白的抑制作用 方法同实施例1的4。
不同浓度β-CD-PCL2000-mPEG5000两亲性聚合物聚合物胶束溶液及CsA溶液处理后的细胞R123水平见图2(B)。研究结果表明，β-CD-PCL2000-mPEG5000两亲性聚合物胶束溶液对于R123细胞内的积累具有一定的影响作用。可在一定浓度范围内可以达到与CsA P-gp蛋白抑制剂相近或是优于CsA P-gp蛋白抑制剂的效果，较未添加抑制剂组相比，最高可增加3.63倍的R123的摄取吸收。β-CD-PCL2000-mPEG5000两亲性聚合物聚合物胶束聚合物具有一定的P-gp蛋白抑制作用。
实施例7β-CD-PCL5000-mPEG5000(YPCL，分子量5000；ZmPEG，分子量5000)两亲性聚合物胶束在抑制P-gp中的应用
氨基活化反应方法同实施例1的1(1)。
(2)端羟基Y-Z聚合物合成 方法同实施例1的1(2)。mPEG5000用量为5g，PCL用量为5g，辛酸亚锡用量为0.025g。
(3)Y-Z聚合物端羟基活化 方法同实施例1的1(3)。mPEG5000-PCL5000∶DMAP∶TEA∶琥珀酸酐＝1∶1.2∶1.2∶1.2(mol/mol)。
(4)环糊精聚合物合成 方法同实施例1的1(4)。mPEG5000-PCL5000-COOH∶DCC∶DMAP∶β-CDen7＝1∶7.2∶7.2∶7.2(mol/mol)。聚合物核磁谱图见附图5(C)。
(5)采用芘荧光法，测定聚合物胶束临界胶束浓度 方法同实施例1的1(5)。确定该胶束的临界胶束浓度为0.00092mg/ml。
2.β-CD-PCL5000-mPEG5000聚合物胶束的载药胶束 方法同实施例1的2。经测定，载药胶束的粒径157nm，包封率为86.4％，载药量为18.4％。
3.β-CD-PCL5000-mPEG5000聚合物和载药的细胞毒性 方法同实施例1的3。
经测定，β-CD-PCL5000-mPEG5000聚合物对二种细胞的细胞毒性非常小，经48小时的作用后四种细胞的存活率依然在75％以上，细胞毒性均为0～1级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PCL5000-mPEG5000-DOX)及游离阿霉素的两种细胞的IC50见表7，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。
表7游离阿霉素溶液和载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-PCL5000-mPEG5000-DOX)对MCF7敏感株和MCF7/ADR耐药株的细胞毒性
4.β-CD-PCL5000-mPEG5000聚合物胶束P-gp蛋白的抑制作用 方法同实施例1的4。
不同浓度β-CD-PCL5000-mPEG5000两亲性聚合物聚合物胶束溶液及CsA溶液处理后的细胞R123水平见图2(C)。研究结果表明，β-CD-PCL5000-mPEG5000两亲性聚合物胶束溶液对于R123细胞内的积累具有一定的影响作用。可在一定浓度范围内可以达到与CsA P-gp蛋白抑制剂相近或是优于CsA P-gp蛋白抑制剂的效果，较未添加抑制剂组相比，最高可增加可4.25倍的R123的摄取吸收。β-CD-PCL5000-mPEG5000两亲性聚合物聚合物胶束聚合物具有一定的P-gp蛋白抑制作用。
实施例8β-CD-mPEG2000(ZmPEG，分子量2000)两亲性聚合物胶束在抑制P-gp中的应用
氨基活化反应方法同实施例1的1(1)。
(2)mPEG端羟基活化 方法同实施例1的1(3)。mPEG2000∶DMAP∶TEA∶琥珀酸酐＝1∶1.2∶1.2∶1.2(mol/mol)。
(3)环糊精聚合物合成 方法同实施例1的1(4)。mPEG2000-COOH∶DCC∶DMAP∶β-CDen7＝1∶7.2∶7.2∶7.2(mol/mol)。聚合物核磁谱图见附图6。
(4)采用芘荧光法，测定聚合物胶束临界胶束浓度 方法同实施例1的1(5)。确定该胶束的临界胶束浓度为0.034mg/ml。
2.β-CD-mPEG2000聚合物胶束的载药胶束 方法同实施例1的2。经测定，载药胶束的粒径247.9nm，包封率为56.1％，载药量为12.9％。
3.β-CD-mPEG2000聚合物和载药的细胞毒性 方法同实施例1的3。
经测定，β-CD-mPEG2000聚合物对二种细胞的细胞毒性非常小，经48小时的作用后四种细胞的存活率依然在75％以上，细胞毒性均为0～1级，具有良好的生物相容性。载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-mPEG2000-DOX)及游离阿霉素的两种细胞的IC50见表8，结果表明聚合物胶束可产生MCF7/ADR的阿霉素耐药逆转作用。
表8游离阿霉素溶液和载药阿霉素聚合物胶束溶液(-CD-mPEG2000-DOX)对MCF7敏感株和MCF7/ADR耐药株的细胞毒性
4.β-CD-mPEG2000聚合物胶束P-gp蛋白的抑制作用 方法同实施例1的4。
不同浓度β-CD-mPEG2000两亲性聚合物聚合物胶束溶液及CsA溶液处理后的细胞R123水平见图3。研究结果表明，与β-CD-PLA(或PCL)-mPEG聚合物胶束相比，β-CD-mPEG2000两亲性聚合物胶束对于R123细胞内的积累影响很小，与CsA的P-gp蛋白抑制剂相差甚远，说明疏水链段PLA或PCL在β-CD和mPEG之间的插入，对于提高聚合物与P-gp相互作用，抑制阿霉素外排、逆转肿瘤细胞耐药是必不可少的。
权利要求
1.一种基于β-环糊精的聚合物胶束给药系统在制备抑制耐药肿瘤细胞P-糖蛋白药物中的应用，所述聚合物由β-环糊精及接枝的两亲性化合物PLA-PEG或PCL-PEG通过化学键合而成，该聚合物在水性环境中自发形成聚合物胶束，所述聚合物的结构为
其中X1是-NH-(CH2)2-NH-
X2是-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-
Y是聚丙交酯(PLA)或聚己内酯(PCL)，分子量0-5000；
Z是聚乙二醇单甲醚(mPEG)，分子量2000-5000。
全文摘要
本发明提供一种基于β-环糊精的聚合物系统在抑制肿瘤细胞P-糖蛋白中的应用。该聚合物由β-环糊精及接枝的两亲性聚合物合物所组成。本发明提供的基于β-CD的星型两亲性聚合物具有显著的抑制P-gp蛋白的功效，其抑制作用显著优于P-gp蛋白的抑制剂CsA，且该聚合物具有细胞毒性低、生物相容性好和可生物可降解及体内循环时间长等特性，并为疏水性抗肿瘤药物提供了一种理想的给药载体材料。
文档编号A61P35/00GK101766821SQ20101003954
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月5日 优先权日2010年1月5日
发明者邱利焱, 王蓉娟 申请人:浙江大学