专利名称：粉防已碱在抑制血管生成药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化合物的新用途，特别涉及粉防己碱的新用途。
背景技术：
研究表明，肿瘤自身具备启动和促进新生血管生成的能力，以满足自身的新陈代谢和营养物质供应的需要。肿瘤新生血管的生成(angiogenesis)是从已有血管床开始形成新生血管的过程。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过1-2mm，也不会出现浸润和转移。抑制肿瘤血管生成，与阻断肿瘤的发生、发展、浸润和转移密切相关。抑制肿瘤血管生成，还可阻止癌前病变向癌的恶性转变。不仅实体肿瘤的生长、浸润和转移依赖新生血管生成，血液系统恶性肿瘤(如恶性淋巴瘤、淋巴细胞白血病等)的生长和转移也与血管生成密切相关。肿瘤的生长、转移、复发、愈后与血管生成密切相关，以肿瘤的血管生成为靶点，开发血管生成抑制剂，不但可用于大多数肿瘤的治疗还可用于癌的预防和血液系统恶性肿瘤的治疗。
粉防己碱是从中药材粉防己根中提取而来的双苄基异喹啉生物碱，结构式如式I 式I据文献报导粉防己碱1∶4000稀释液能杀死癌细胞，又有报导认为粉防己碱对KB细胞有明显抑制作用，对Hela细胞及Hela-S3细胞有明显的抑制作用。Wermel曾发现粉防己碱对艾氏腹水癌、小鼠肝癌株有抑瘤效果，国外已有将粉防己碱用于治疗肿瘤的报导。上述发现和应用均未提出与粉防己碱有抑制血管生成的作用有关。美国和日本已有该化合物药用的相关专利，其内容包括抗寄生虫和多药耐药(US5025020、5332747、5466590)、有关眼部感染(US5627195)、抗病毒和抗诱癌剂(JP4099723)等。已有的研究发现，粉防己碱对肿瘤具有一定的治疗作用，主要是通过促进凋亡、逆转多药耐药、增强放疗敏感性而产生。
有关粉防己碱通过抗血管生成机制用于疾病的治疗只有用于糖尿病视网膜病、慢性炎症方面有报导(Biol Pharm Bull 1999 Apr；22(4)360-5、Biol Pharm Bull 1998Apr；21(4)346-9)。
发明内容
本发明的目的是提供粉防己碱的一种新用途。
本发明发明人的研究表明，粉防己碱具有抑制血管生成的作用。
本发明技术方案是粉防己碱在制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中的应用。上述化合物在抑制血管生成的治疗和/或预防药物中，有效剂量一般为4-15mg/kg体重/天。
在上述药物中还可加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、填充剂、赋形剂、粘合剂、湿润剂、崩释剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时加入香味剂、甜味剂等。
本发明制备的药物可制成注射剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种剂型。上述各种剂型的药物均可按照药学领域的常规方法制备。
本发明的研究表明，以上述式1化合物为活性成分制备的药物可广泛的治疗与血管生成有关的疾病。如通过抑制肿瘤的血管生成而达到抑制肿瘤的目的，可以开发出抗肿瘤药物，对于其他与血管生成有关的疾病如早熟视网膜病、视网膜静脉闭塞、老年盘状斑变性、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等疾病具有确切的治疗和预防作用。
本发明以血管生成为治疗疾病的靶点具有以下优点1、针对已经启动的新生血管进行治疗，具有特异性；2、由于血管内皮细胞暴露于血流中，药物可直接发挥作用，故剂量小，疗效高，副作用小；3、由于内皮细胞基因表达相对稳定，故不易产生耐药性。
图1为粉防己碱对人类血管内皮细胞增殖的剂量依赖性抑制作用曲线。
图2为不同浓度粉防己碱处理后人类血管内皮细胞管形成的光学显微镜照片。
图3为不同浓度粉防己碱处理后人类血管内皮细胞迁移结果的光学显微镜照片。
具体实施例方式
实施例1粉防己碱对人类血管内皮细胞增殖的抑制作用。
将人类脐静脉内皮细胞(HUVEC，购自Cascade Biologics公司，CotC-003-5C)置于含10％胎牛血清(FBS)的Medium 200(购自Cascade Biologics公司)中培养(37℃、5％CO2、95％湿度)，取第四代细胞按密度4000/250ul接种于96孔培养板中，设定对照组、各个浓度梯度的用药组及空白对照，每组均做3个复孔。待细胞生长密度达80％，分别加入5ul各浓度梯度的粉防己碱(以DMSO溶解)，使终浓度分别为1000uM、100uM、10uM、5uM和1uM，对照组加入5ulDMSO，继续培养(M200培养基，2％FBS)48小时后，加入5mg/ml的四唑溴盐(MTT)20ul，37℃继续孵育4小时，终止培养，弃上清，每孔加入150ulDMSO，轻轻振荡，1小时后在490nm波长处用BIO-RAD Model 3500微板读数仪测定各孔吸光值，以吸光值表示各孔中活细胞的数量。上述实验重复3次。结果如图1所示，图中横坐标是药物浓度，纵坐标是吸光值(与活细胞数量成正比)。结果显示，粉防己碱对人类脐静脉内皮细胞的增殖呈剂量依赖性抑制作用，其半数抑制量为50uM。
实施例2粉防己碱对人类血管内皮细胞管形成能力的抑制作用。
24孔培养板每孔加入BD MatrigelTMMatrix原胶200ul，使之聚合成胶，第四代人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)悬液按30000cell/500ul密度接种至涂有Matrigel胶的24孔板中，设定对照组、各个浓度梯度的用药组，用药组分别加入10ul有浓度梯度的粉防己碱(10uM、25uM、50uM、100uM，以DMSO溶解)，对照组加入无菌DMSO10ul，每组均做3个复孔。37℃、5％CO2、95％湿度培养24小时，OLYMPUS CK40-RFL光学显微镜观察血管内皮细胞管的形成，每孔取4个低倍视野计数，以OLYMPUS CK40数码照相机拍照。结果如图2所示，表明粉防己碱对人类血管内皮细胞管形成能力呈剂量依赖性抑制，其半数抑制量为25uM。
实施例3粉防己碱对人类血管内皮细胞迁移能力的抑制作用。
1、制备趋化因子取传代后第二天长势良好的NIH3T3细胞。无血清DMEM轻柔漂洗2次。无血清DMEM，5％CO2，37℃培养24-48hours。收集细胞上清。离心(12000g，4℃，10min)。上清滤菌(0.22um滤膜)，分装保存(-20℃)。
2、Matrigel侵袭实验取稀释的Matrigel 25ul(原胶以DMEM按1∶2比例稀释)加入Transwell板上室，覆盖整个聚酯膜表面，37℃孵育30min，使Matrigel聚合成胶。第四代人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)悬液按30000/250ul密度接种至上室，PBS洗涤3次从培养瓶中消化并收获细胞。用无血清DMEM制成单细胞悬液，5×105cells/ml，用药组加入各浓度梯度的药物(10uM、25uM、50uM、100uM，以DMSO溶解)，对照组加入同体积的DMSO。Transwell板下室加入500ul步骤1制备的趋化因子。5％CO2，37℃培养24小时。用DMEM湿棉签轻轻擦去凝胶及聚酯膜上表面的细胞。小心取出上室，用冰预冷的甲醇固定30分钟。苏木素染色1分钟。梯度酒精脱水(80％，95％，100％，100％)，二甲苯透明。小心将聚酯膜从上室切取下来，置于载玻片上中性树脂封片。附着于聚酯膜下表面的细胞在高倍镜下(400×)随机取6个视野计数取平均值并拍照。重复实验2次。结果如图3所示，表明粉防己碱对人类血管内皮细胞的迁移能力呈剂量依赖性抑制作用。
实施例4荷瘤裸鼠体内试验。
收获人类结肠癌细胞系LoVo细胞，用PBS制成细胞悬液，以200万/200ul接种至8周大的BALB/cAnN-nu/nu裸鼠的右股部皮下。待瘤体生长至5mm×5mm大小时，随机分成两组，每组5只。粉防己碱用药组给药剂量为50mg/kg(药物以含10％DMSO的PBS溶液溶解)，对照组给含10％DMSO的PBS溶液200ul，连续给药60天，隔记录瘤体的长径和短径。用药期间，小鼠未出现不良反应。处死小鼠后，取出肿瘤，检测肿瘤的微血管密度。结果显示，用药组瘤体较对照组缩小，生长明显减慢，微血管密度明显低于对照组。说明该药具有体内抑制肿瘤的作用，而且副作用很小。
权利要求
1.粉防己碱在制备抑制血管生成的治疗和/或预防药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的粉防己碱的有效剂量为4-15mg/kg体重/天。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于在制备血管生成的药物中还可加入一种或多种药学上可接受的载体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为治疗和/或预防肿瘤的药物。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为治疗和/或预防老年盘状斑变性的药物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为治疗和/或预防银屑病的药物。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为治疗和/或预防动脉粥样硬化的药物。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为治疗血管瘤的药物。
全文摘要
本发明公开的是粉防已碱在制备抑制肿瘤生成的药物中的应用，其有效剂量为4－15mg/kg体重/天。由于粉防已碱具有抑制肿瘤生成的作用，可以开出广泛的治疗和/或预防肿瘤的发生和转移，并且可用于其它与血管生成有关的疾病，如抗老年盘状斑变性、银屑病、血管瘤、动脉粥样硬化等药物。本发明巧妙地以血管生成做为治疗肿瘤的靶点，具有以下优点1.治疗针对已经启动的新生血管进行，具有特异性；2.由于血管内皮细胞暴露于血流中，药物直接发挥作用，故剂量小，疗效高，副作用小；3.由于内皮细胞基因表达相对稳定，故不易产生耐药性。
文档编号A61K31/4748GK1511527SQ0215942
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月31日 优先权日2002年12月31日
发明者王振军, 赵博 申请人:北京大学第一医院