lI是限制性核酸内切酶，其识别序列和切割位点分别是G丨AATTC、 GITCGAC。pBABE-puro质粒带有EcoRI和SalI的识别切割序列。
[0020] 目前，G6H)相关功能和机制的研究多用瞬时转染模型。如MHam等在巨噬细胞细 胞系RAW264. 7瞬时过表达G6H)研究其功能，结果表明巨噬细胞中G6H)表达增加可促进肥 胖动物体内脂肪组织产生氧化应激和炎症反应。J〇〇-WonLee等应用包含有G6H)基因的腺 病毒感染大鼠胰岛细胞INS-1，72hr后收集细胞进行各项检测，其结果提示G6H)在胰岛细 胞中过表达可引起胰岛0细胞功能紊乱及细胞凋亡，这可能是2型糖尿病的发病的原因之 一。新近研究表明，与癌旁组织或正常组织相比，G6H)在膀胱癌、胃肠癌、结肠癌、乳腺癌、 前列腺癌等多种肿瘤组织中呈现异常高表达、高活性，这提示G6H)参与了多种肿瘤的发生 发展过程，其分子机制有待进一步研究阐明。
[0021]G6ro与肿瘤发生发展的关系及其机制研究离不开稳定转染细胞系的建立。有文 献报道，在NIH3T3细胞中转入pH0Apr-l-G6PD-neo质粒，经G418筛选获得稳定过表达人 G6H)基因的NIH3T3-G6H)细胞。与对照组细胞相比，NIH3T3-G6H)细胞的增殖速度和促 进肿瘤形成的能力明显增加。AnaGaldn-Cobo等在大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12中转 染G6H)过表达质粒pCDNA_G6PD，经 800ug/mLG418 筛选，Northernblot、Quantitative RT-PCR及ELISA鉴定获得G6TO稳定过表达细胞，并用于研究G6TO与低氧诱导因子 2a(hypoxia-induciblefactor2a，HIF2a)的关系。我们先前应用pRNAT_U6.2/Lenti 质粒，经慢病毒包装、感染获得的G6H)敲低的人黑色素瘤稳定细胞株（A375-G6H)A)，这细 胞呈现凋亡增加、裸鼠移植瘤生长抑制的特征；随后在A375-G6H)A细胞中再次导入人正 常G6H)基因，筛选获得稳定细胞株A375-G6H)A-G6PDWT，这细胞功能得到部分恢复。
[0022] 本课题组前期研究证实，G6H)在人肾细胞癌瘤体组织中高表达，提示G6H)可能参 与了肾细胞癌的发生发展。鉴于目前国内未见G6H)与肾细胞癌相关研究的报道，也缺乏 G6H)过表达的人肾细胞腺癌细胞株及其相关功能、机制的研究。本申请将人G6H)基因cDNA 克隆入pBABE-Puro质粒，构建pBABE-Pur〇-G6ro表达载体，转染G6H)表达水平较低的肾细 胞癌细胞系ACHN，经嘌呤霉素加压筛选获得了G6H)表达稳定增加40倍以上的G6H)过表达 型ACHN稳转细胞株（ACHN-G6PD)，G6H)酶活性升高了 2. 2倍。这一稳定细胞株的建立，为 探究G6H)与肾细胞癌的相关性及其机制研究提供细胞模型，也为揭示肾细胞癌的发生发 展机理，发现新的药物作用靶点奠定研究基础。
【附图说明】
[0023] 图1是G6TO基因cDNA的PCR扩增结果图。
[0024] 图2是pBABE-Pur〇-G6PD重组质粒的EcoRI和SalI双酶切鉴定结果图。
[0025] 图3是G6H)基因的测序及pBABE-G6PD表达载体的结构示意图。
[0026] 图4是嘌呤霉素对ACHN-Wildtype细胞株杀伤曲线的检测。图中分别用不同浓 度的嘌呤霉素（〇、〇.〇5、〇.l、〇. 15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45iig/mL)处理细胞，观察 存活细胞数，以确定嘌呤霉素的筛选浓度。
[0027] 图5光学显微镜下的ACHN-G6H)稳转细胞株（40X)。
[0028]图 6 是ACHN-Wildtype和ACHN-G6PD细胞株的RNA电泳图。
[0029]图 7 是ACHN-WiIdtype和ACHN-G6PD细胞株的G6PD的mRNA检测图。
[0030]图8是ACHN-WiIdtype和ACHN-G6PD细胞株的G6PD蛋白的Westernblot检测图。
[0031] 图9是图8中G6H)蛋白Western blot的灰度扫描结果图。
[0032] 图10是ACHN-Wild type和ACHN_G6ro细胞株的G6H)酶活性测定图。
【具体实施方式】
[0033] 一、G6PD基因的克隆
[0034]用Primer5. 0 软件设计针对人G6PD基因（NM_001042351. 2)cDNA的PCR正向 和反向引物，正向引物5' -GGAAITCATGGCAGAGCAGGTGGCCCTG-3'中引入EcoRI酶切位点 (GIAAITC)，反向引物 5' -ACGCGTCGACTCAGAGCTTGTGGGGGITCAC-3' 中引入SalI酶切位点 (G丨TCGAC)。以本课题组前期构建的pMD19-Tsimple-G6PD-WT质粒DNA为模板，通过PCR 扩增得到含有G6H)的cDNA的片段，长1548bp。PCR反应体系（50iiL)如下：
[0035]
【主权项】
1. 一种G6H)过表达型ACHN稳转细胞株，其特征在于是一种G6H)过表达型ACHN稳 转细胞株，是将pBABE-pur〇-G6ro转染人肾细胞腺癌细胞株ACHN，经嘌呤霉素加压筛选， Real-time PCR、Western blot验证，以及反复传代、冻存复苏所得的G6H)表达量稳定增加 40倍以上的细胞株。
2. 如权利要求1所述的G6H)过表达型ACHN稳转细胞株的构建方法，其特征在于包括 以下步骤： 一、G6H)基因的克隆 用Primer 5. 0软件设计针对人G6PD基因的PCR正向引物5' -GGAAITCATGGCAGAGCAGG TGGCCCTG-3' 和反向引物 5' -ACGCGTCGACTCAGAGCTTGTGGGGGITCAC-3'，分别引入 EcoR I 和 Sal I酶切位点，以pMD19-Tsimple-G6PD-WT质粒DNA为模板，通过PCR扩增出G6H)的编码 序列1548bp，纯化PCR产物，获得G6H)基因的cDNA ; 二、 pBABE-puro-GGH)重组表达载体的构建 上述G6H)基因cDNA的PCR纯化产物和pBABE-puro载体分别用EcoR I和Sal I进行 酶切，用TaKaRa的T4DNA连接酶进行连接，转化E. coli DH 5 a，涂布平板，过夜培养；随机 挑取2个单菌落进行扩增培养，提取质粒后进行EcoR I和Sal I双酶切鉴定；对于酶切鉴 定正确的质粒进行测序及序列的分析比对；扩增培养测序正确的阳性克隆，提取其不含内 毒素的pBABE-pur〇-G6PD重组质粒； 三、 ACHN细胞株的转染 复苏培养ACHN细胞至状态良好，转染前一天传代细胞至6孔板，每孔加入2 X 105细胞， 次日观察其汇合度为70%?80%时进行细胞转染；转染采用1^?〇作(^&1^11 6 2000转染试 剂和Opti-MEM培养基；6孔板每孔的转染量为4 ii g质粒稀释到250 ii L Opti-MEM培养基， 得到A液，取10iiL Lipofectamine 2000溶解于250iiL Opti-MEM培养基，得到B液，室温 孵育5min后将A液和B液混合，室温孵育20min后加入弃培养基的细胞中；孵育6?8hr 后更换为新鲜不含抗生素的完全培养基； 四、 ACHN-G6PD稳定细胞株的筛选及鉴定 细胞转染换液24hr后，更换完全培养基为含0. 25 y g/mL嘌呤霉素的筛选培养基， 压力筛选一周，中间换一次液；一周后在倒置显微镜下观察，把单独每一个细胞群圈出， 用0. 25%胰酶消化画圈的细胞群，每一团细胞收集到新的24孔板的一个孔培养；继续用 0. 25 y g/mL的嘌呤霉素压力筛选一周；倒置显微镜下观察，进行亚克隆筛选，挑选出正常 生长细胞群传代，逐步放大培养；应用Real-time PCR、Western blot分别在mRNA和蛋白水 平检测转染细胞株G6H)的表达水平，用紫外分光光度法在340nm检测G6H)酶活性；将稳转 细胞株反复传代、冻存及复苏，观察其G6H)表达是否稳定；ACHN-G6H)细胞株已在体外传代 20次以上，其G6H)表达量稳定增加40倍以上，G6H)酶活性增加2. 2倍，表明G6H)过表达 型ACHN稳转细胞株构建成功。
【专利摘要】本发明涉及医学分子生物学相关技术，尤其是采用siRNA干扰技术构建细胞研究模型。本发明所述的G6PD过表达型ACHN稳转细胞株是一种G6PD过表达型ACHN稳转细胞株，是将pBABE-puro-G6PD转染人肾细胞腺癌细胞株ACHN，经嘌呤霉素加压筛选，Real-time PCR、Western blot验证，以及反复传代、冻存复苏所得的G6PD表达量稳定增加40倍以上的细胞株。其构建方法包括以下步骤：一、G6PD基因的克隆；二、pBABE-puro-G6PD重组表达载体的构建；三、ACHN细胞株的转染；四、ACHN-G6PD稳定细胞株的筛选及鉴定。这一稳定细胞株的建立，为探究G6PD与肾细胞癌的相关性及其机制研究提供细胞模型，也为揭示肾细胞癌的发生发展机理，发现新的药物作用靶点奠定研究基础。
【IPC分类】C12N15-85, C12N15-53, C12N5-10
【公开号】CN104531622
【申请号】CN201410797658
【发明人】朱月春, 张巧, 王艳玲, 况应敏, 狄勇, 李玉倩, 杨惠鑫
【申请人】昆明医科大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月19日