马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，属于农业微生物领域。本发明依次通过TSA复苏冻干种子、在TSA琼脂斜面一级中培养、在TSB培养基进行二级种子培养、在无血清和葡萄糖的加富胰酪蛋白培养基中厌氧发酵，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。本发明通过不添加任何血清和葡萄糖、厌氧发酵培养的方法，进行工业放大生产研究，发酵抗原含量无降低，发酵过程中不用调整通气、控制溶氧，抗原含量高，工艺参数容易控制，减少补料；较现有发酵工艺稳定、生长速度快，易于实现马链球菌抗原的大规模高密度培养。同时提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保护效果。
【专利说明】
马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺
技术领域
[0001] 本发明设及农业微生物技术领域，特别设及一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高 密度发酵培养工艺。
【背景技术】
[0002] 马链球菌兽疫亚种根据兰氏分群属于C群链球菌，该菌可引起多种动物感染，临床 症状表现为败血症、脑膜炎、关节炎等，一般呈地方流行性。随着集约化养猪业的发展，中国 猪链球菌病时有发生。流行病学调查表明，除猪链球菌2型外，马链球菌兽疫亚种仍是中国 各地猪链球菌病的主要病原。目前控制该病的主要手段仍是疫苗，主要有弱毒疫苗、灭活 苗。
[0003] 马链球菌弱毒菌株ST171是生产链球菌弱毒活疫苗的专用菌株，对其培养及研究 局限于大瓶培养和普通发酵活菌低的特点。马链球菌兽疫亚种为兼性厌氧型微生物，生长 过程中需要血清和葡萄糖作为营养物质，但是运些异源物质的残存会使疫苗存在安全隐 患。普通发酵工艺要随着发酵的进行不断调整通气量，控制溶氧，同时需要添加2~5%的血清 和1 %的葡萄糖。
【发明内容】
[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密 度发酵培养工艺。本发明通过不添加任何血清和葡萄糖、厌氧发酵培养的方法，进行工业放 大生产研究，发酵抗原含量无降低，发酵过程中不用调整通气、控制溶氧，抗原含量高，工艺 参数容易控制，减少补料;较现有发酵工艺稳定、生长速度快，易于实现马链球菌抗原的大 规模高密度培养。
[0005] 本发明的技术方案为： 一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，包括步骤： 1) 取冻干的发酵种子菌用活化培养基活化，至单菌落长出； 2) 挑取单菌落至一级种子培养基，培养12-16小时，得一级种子； 3) 取一级种子并接种于二级种子培养基，培养至ODsgg值达到0.4-0.6，得二级种子； 4) W 1%-3%接种量将二级种子液转接至发酵罐中的发酵培养基进行发酵种子培养;调 节pH至7.2 ±0.2,关闭进气阀和出气阀，保持罐体正压0.03-0.05Mpa，揽拌速度为50- 150rpm;当ODs日日值达到一定数值时停止发酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度 抗原;所述发酵培养基为加富膜酪蛋白培养基。
[0006] 作为优选方案，还包括步骤5)，将发酵种子培养收获的菌液Wl%-3%的接种量接种 至体积更大的发酵罐中进行扩大培养，扩大培养的培养基也为加富膜酪蛋白培养基，扩大 培养的工艺条件为：pH 7.2 ± 0.2，罐体正压0.03-0.05Mpa，揽拌速度为50-150巧m;当ODsoo 值达到1.5-1.卵寸停止发酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。
[0007] 作为优选方案，步骤1)中，所述活化培养基为添加有3-8%成牛血清的TSA培养基。
[000引作为优选方案，步骤2)中，所述一级种子培养基为添加有3-8%成牛血清的TSA培养 基。
[0009] 进一步地，步骤3)中，所述二级种子培养基为添加有3-8%成牛血清的TSB培养基。
[0010] 进一步地，步骤3)中，W1-3 ml TSB液体洗涂一级种子培养基的琼脂斜面，将一级 种子接种于二级种子培养基，然后于36-38°C ,50-15化pm条件下，摇床震荡培养3-4h。
[0011] 作为优选方案，所述发酵种子菌为马链球菌兽疫亚种ST171株。
[0012] 作为优选方案，所述扩大培养所用发酵罐的体积为200-40化，所述发酵种子培养 所用发酵罐的提交为8-20L。
[0013] 本发明的有益效果为： 本发明通过不添加任何血清和葡萄糖、厌氧发酵培养的方法，进行工业放大生产研究， 发酵抗原含量无降低，发酵过程中不用调整通气、控制溶氧，抗原含量高，工艺参数容易控 审IJ，减少补料;较现有发酵工艺稳定、生长速度快，易于实现马链球菌抗原的大规模高密度 培养。同时提高菌株的免疫原性，提高疫苗的保护效果。
[0014]
【附图说明】
[0015] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 W根据运些附图获得其他的附图。
[0016] 图1为普通发酵工艺与本发明发酵工艺发酵生长曲线对比图；曲线A代表本发明发 酵工艺；曲线B代表普通发酵工艺。
【具体实施方式】
[0017] W下各实施例中所用TSA培养基W及TSB培养基购自美国抓公司；加富膜酪蛋白培 养基购自山东阳谷蛋白侨润办事处润蠢蛋白厂。
[001引实施例1 一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，包括步骤： 1)取冻干的马链球菌兽疫亚种ST171株发酵种子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培养基 活化12-16小时，至单菌落长出； 2巧陳单菌落至添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，培养12-16小时，得一级种子； 3) W2 ml TSB液体洗涂添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，将一级种子接种于添加有 5%成牛血清的TSB培养基，然后于37°C，100巧m条件下，摇床震荡培养3-地，培养至ODso日值达 到0.4-0.6,得二级种子； 4) W2%(V/V)的接种量将二级种子液转接至IOL发酵罐中的发酵培养基(加富膜酪蛋白 培养基)进行发酵种子培养;采用IOM的氨氧化钢调节抑至7.2±0.2，12rC灭菌30min，关闭 进气阀和出气阀，保持罐体正压0.03-0.05Mpa，揽拌速度为10化pm;培养4小时后开始取样 测定ODs日日值和活菌计数，5小时活菌数达到63亿cfu/mL ODs日日值达到1.7时停止发酵，收获菌 液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。
[0019] 实施例2 一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，包括步骤： 1)取冻干的马链球菌兽疫亚种ST171株发酵种子菌，在添加有7%成牛血清的TSA培养基 活化12-16小时，至单菌落长出； 2巧陳单菌落至添加有7%成牛血清的TSA琼脂斜面，培养12-16小时，得一级种子； 3) W3 ml TSB液体洗涂添加有7%成牛血清的TSA琼脂斜面，将一级种子接种于添加有 7%成牛血清的TSB培养基，然后于38°C，100巧m条件下，摇床震荡培养3-地，培养至ODso日值达 到0.4-0.6,得二级种子； 4) W3%(V/V)的接种量将二级种子液转接至1化发酵罐中的发酵培养基(加富膜酪蛋白 培养基)进行发酵种子培养;采用IOM的氨氧化钢调节抑至7.2±0.2，12rC灭菌30min，关闭 进气阀和出气阀，保持罐体正压0.03-0.05Mpa，揽拌速度为10化pm;培养4小时后开始取样 测定ODs日日值和活菌计数，5小时活菌数达到62亿cfu/mL ODs日日值达到1.別寸停止发酵，收获菌 液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。
[0020] 实施例3 一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，包括步骤： 1)取冻干的马链球菌兽疫亚种ST171株发酵种子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培养基 活化12-16小时，至单菌落长出； 2巧陳单菌落至添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，培养12-16小时，得一级种子； 3) W2 ml TSB液体洗涂添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，将一级种子接种于添加有 5%成牛血清的TSB培养基，然后于37°C，100巧m条件下，摇床震荡培养3-地，培养至ODso日值达 到0.4-0.6,得二级种子； 4) W2%(V/V)的接种量将二级种子液转接至IOL发酵罐中的发酵培养基(加富膜酪蛋白 培养基)进行发酵种子培养;采用IOM的氨氧化钢调节抑至7.2±0.2，12rC灭菌30min，关闭 进气阀和出气阀，保持罐体正压0.03-0.05Mpa，揽拌速度为10化pm; 5) 当当步骤4)中发酵种子培养至ODsoo值达至IjO.4-0.6时，取步骤4)发酵罐中的菌液，W 2%(V/V)的接种量转接至30化发酵罐中的发酵培养基(加富膜酪蛋白培养基)进行扩大培 养;采用1OM的氨氧化钢调节pH至7.2 ± 0.2，12 rC灭菌30min，关闭进气阀和出气阀，保持罐 体正压0.03-0.05Mpa，揽拌速度为10化pm;培养4小时后开始取样测定ODs日日值和活菌计数，5 小时活菌达到70亿Cf u/mL ODsoo值达到1.7时停止发酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚种 发酵高密度抗原。
[0021] 对比例1 一种马链球菌兽疫亚种普通发酵工艺，包括步骤： 1)取冻干的马链球菌兽疫亚种ST171株发酵种子菌，在添加有5%成牛血清的TSA培养基 活化12-16小时，至单菌落长出； 2巧陳单菌落至添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，培养12-16小时，得一级种子； 3) W2 ml TSB液体洗涂添加有5%成牛血清的TSA琼脂斜面，将一级种子接种于添加有 5%成牛血清的TSB培养基，然后于37°C，100巧m条件下，摇床震荡培养3-地，培养至ODso日值达 到0.4-0.6,得二级种子； 4) W2%(V/V)的接种量将二级种子液转接至IOL发酵罐中的发酵培养基(加富膜酪蛋白 培养基)进行发酵种子培养，添加5%成牛血清和1%的葡萄糖;采用IOM的氨氧化钢调节pH至 7.2±0.2，121°(：灭菌30111111，控制溶氧在10~50%，揽拌速度为10化9111;培养4小时后开始取样 测定ODs日日值和活菌计数，6小时活菌数达到61亿cfu/ni; ODs日日值达到1.7时停止发酵，收获菌 液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。
[0022] 实施例1(本发明发酵工艺)所得发酵抗原与对比例1(普通发酵工艺)所得发酵抗 原分别配制疫苗进行21-28日龄仔猪免疫，免疫后28天按照《中华人民共和国兽用生物制品 规程》(2000年版）的《猪败血性链球菌病活疫苗制造及检验规程》进行效力检验，对照猪免 疫相同剂量的侣胶生理盐水稀释液，结果如表1所示。
[0023]
由表1可知，本发明发酵工艺所得抗原的免疫原性明显改善，提高了疫苗的保护效果。
[0024] 实施例1(本发明发酵工艺)与对比例1(普通发酵工艺)发酵生长曲线对比图如图1 所示；由图1可知，本发明发酵工艺较现有普通发酵工艺稳定、生长速度快，易于实现马链球 菌抗原的大规模高密度培养。
【主权项】
1. 一种马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，其特征在于，包括步骤：I) 取冻干的发酵种子菌用活化培养基活化，至单菌落长出；2)挑取单菌落至一级种子培养基， 培养12-16小时，得一级种子;3)取一级种子并接种于二级种子培养基，培养至OD 6qq值达到 0.4-0.6，得二级种子;4)以1%-3%接种量将二级种子液转接至发酵罐中的发酵培养基进行 发酵种子培养;调节pH至7.2 ± 0.2，关闭进气阀和出气阀，保持罐体正压0.03-0.05Mpa，搅 拌速度为50-150rpm;当OD6qq值达到一定数值时停止发酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚 种发酵高密度抗原;所述发酵培养基为加富胰酪蛋白培养基。2. 如权利要求1所述马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，其特征在于， 还包括步骤5)，将发酵种子培养收获的菌液以1%-3%的接种量接种至体积更大的发酵罐中 进行扩大培养，扩大培养的培养基也为加富胰酪蛋白培养基，扩大培养的工艺条件为:PH 7.2 ± 0.2，罐体正压0.03-0.05Mpa，搅拌速度为50-150rpm;当OD6qq值达到1.5-1.9时停止发 酵，收获菌液，得到马链球菌兽疫亚种发酵高密度抗原。3. 如权利要求1或2所述马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，其特征在 于:步骤1)中，所述活化培养基为添加有3-8%成牛血清的TSA培养基。4. 如权利要求1或2所述马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，其特征在 于:步骤2)中，所述一级种子培养基为添加有3-8%成牛血清的TSA培养基。5. 如权利要求4所述马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，其特征在于： 步骤3)中，所述二级种子培养基为添加有3-8%成牛血清的TSB培养基。6. 如权利要求5所述马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，其特征在于： 步骤3)中，以1-3 mL TSB液体洗涤一级种子培养基的琼脂斜面，将一级种子接种于二级种 子培养基，然后于36-38 °C，50-150rpm条件下，摇床震荡培养3-4h。7. 如权利要求1所述马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，其特征在于： 所述发酵种子菌为马链球菌兽疫亚种ST171株。8. 如权利要求2所述马链球菌兽疫亚种无血清厌氧高密度发酵培养工艺，其特征在于： 所述扩大培养所用发酵罐的体积为200-400L，所述发酵种子培养所用发酵罐的提交为8-20L〇
【文档编号】C12R1/46GK105925517SQ201610575429
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】朱杰, 王楠, 牛成明, 董新荣
【申请人】山东滨州沃华生物工程有限公司