一种植物乳杆菌胞外多糖及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种植物乳杆菌胞外多糖，该多糖的分子结构中的糖单位仅为木糖和半乳糖且半乳糖占比高达98％，属全新结构的植物乳杆菌胞外多糖。同时本发明提供了上述多糖的制备方法，该方法利用乙醇于植物乳杆菌发酵液中沉淀多糖，而后经透析去除小分子，并先后利用酶解方法去除核酸及蛋白杂质，再利用三氯乙酸沉淀杂蛋白，固液分离取上清后执行透析，从而获得纯化的目标多糖。该方法依据目标多糖自身性质以及植物乳杆菌发酵液的杂质成分设计工艺参数，温度和pH条件温和，同时避免使用超滤等可能打断多糖交联键的纯化方法，有效保证了多糖内糖苷键及次级结构的完整。本方法所制备的多糖纯度好，收率高，为后续性能分析及产业应用奠定了基础。CCTCCNO:M201417020140428
【专利说明】
_种植物乳杆菌胞外多糖及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物分离工程技术领域，进一步涉及微生物发酵产物的分离纯化，具 体涉及一种植物乳杆菌胞外多糖及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)，泛指乳酸菌代谢过程中分泌到细胞 外的糖类化合物。由于乳酸菌胞外多糖具有良好的流变性、而且能赋予发酵食品良好的口 感和风味，因此可作为食品工业的胶凝剂、稳定剂、保鲜剂和乳化剂等，目前已广泛用于乳 制品、饮料、糕点、糖果、冰激凌等食品的生产。此外，有研究表明EPS具有抗致病菌、抗肿瘤、 降低胆固醇、延缓衰老、调节肠道菌群平衡以及调节免疫系统功能的作用，因此EPS可能是 乳酸菌益生作用的物质基础之一。
[0003] 多糖是由糖苷键结合的糖链，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。从微观层 面来看，参与成键的单糖分子种类多样，且数量及排列次序各不相同；多糖主链间通过氢键 作用可形成多种不同的构象;在此基础上，由于糖单位羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的 非工价相互作用，导致多糖分子存在更为复杂的构象。因此多糖不是一种纯粹的化学物质， 而是聚合程度不同的混合物。为了探索乳酸菌胞外多糖的性质，首先应当明确其物质基础 并予以确切的表征，因此，对EPS的纯化及结构分析尤为重要。
[0004] 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，属同型发酵乳酸菌，革兰氏阳性，兼性 好氧。该菌株被证明具有耐酸、耐胆盐、抗致病菌、调节肠道菌群平衡的作用，同时有研究表 明上述耐酸能力及益生作用可能与其胞外多糖有关。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种植物乳杆菌胞外多糖，以解决现有技术中缺乏上述植物乳杆菌胞 外多糖的技术问题。
[0006] 本发明要解决的另一技术问题是现有技术中，植物乳杆菌胞外多糖作为一种多糖 混合物，其中成分不明确。
[0007] 本发明同时提供一种上述植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，以解决现有技术中上 述植物乳杆菌胞外多糖难以制备的技术问题。
[0008] 本发明要解决的再一技术问题是常规方法所制备的上述植物乳杆菌胞外多糖纯 度较低。
[0009] 本发明要解决的又一技术问题是常规方法所制备的上述植物乳杆菌胞外多糖产 率较低。
[0010] 本发明要解决的又一技术问题是上述制备方法对核酸的去除不完全。
[0011] 本发明要解决的又一技术问题是上述制备方法对蛋白的去除不完全。
[0012] 本发明要解决的又一技术问题是上述制备方法所制备的植物乳杆菌胞外多糖用 于人类时存在安全风险。
[0013] 为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
[0014] -种植物乳杆菌胞外多糖，该植物乳杆菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖苷键连接 而成，其中半乳糖的摩尔含量不低于98%。也就是说，上述植物乳杆菌胞外多糖的糖单位仅 为木糖或半乳糖，各糖单位之间的连接键含有糖苷键，而在此基础上进一步的次级结构，并 不予以限定;此外，上述半乳糖的摩尔含量是指半乳糖的摩尔数在全部糖单位总摩尔数中 所占百分比(所述糖单位是指多糖分子链中的单糖）。
[0015] 作为优选，该植物乳杆菌胞外多糖经空间排阻色谱的洗脱峰数量为1个。此优选技 术方案所限定的植物乳杆菌胞外多糖，由于在空间排阻色谱中仅有1个洗脱峰，因此其属于 单一分子量的多糖，更有利于明确其物质基础及性质分析。
[0016] -种上述植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0017] 1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；
[0018] 2)向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以8~14KDa截留分子 量的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；
[0019] 3)以含有40~60mM Tris-HCl、5~15mM MgS〇4 ? 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶 解步骤2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2~3yg/mL，水解；
[0020] 4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度40~60iig/mL，酶解；
[0021] 5)而后加入三氯乙酸至终浓度10~15%(w/v)，20~40min后固液分离取上清，透 析，取透析袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。
[0022]作为优选，步骤1)所述的发酵液是植物乳杆菌厌氧发酵22~26h时的发酵液;更 优的，发酵时间是24h。
[0023]作为优选，步骤2)中乙醇的加入量是所述上清液体积的1.5~2.5倍;更优的，乙醇 加入量是所述上清液体积的2倍.
[0024]作为优选，步骤3)中粗多糖的终浓度为4~6mg/L;更优的，是5mg/L。
[0025]作为优选，步骤3)所述水解是在35~39°C条件下持续4~8h;更优的，是在37°C条 件下持续6h。
[0026]作为优选，步骤4)所述酶解是在35~39°C条件下持续16~20h;更优的，是在37°C 条件下持续18h。
[0027] 作为优选，步骤5)透析前，先调节上清液pH至4~5,再透析;更优的，调节pH至4.5; 最优的，所述调节是利用l〇mol/L的NaOH溶液实现的。
[0028]在以上任一技术方案基础上优选的，步骤1)所述的植物乳杆菌，是保藏编号为 CCTCC M 2014170的植物乳杆菌。
[0029]在以上任一技术方案基础上优选的，所述的固液分离，是以10000~14000g的转速 离心15~25min〇
[0030]在以上任一技术方案基础上优选的，透析的持续时间是60~84h;更优的，透析的 持续时间是72h。在此基础上进一步优选的，透析的过程中每天更换透析袋外的超纯水2次。
[0031] 作为优选，步骤1)所述的发酵液，是以MRS培养基发酵获得的。
[0032] 作为优选，步骤1)所述的发酵液，是在35~39°C条件下发酵获得的；更优的发酵温 度为37°C。
[0033] 作为优选，步骤2)所述的干燥是冷冻干燥。
[0034]作为优选，步骤3)所述粗多糖溶解液的pH值为7.2~7.8;更优的，其pH为7.5。
[0035]作为优选，步骤5)中三氯乙酸加入后的终浓度为12% (w/v)，加入三氯乙酸后持续 30min再进行固液分离。
[0036]在以上技术方案中，保藏编号为CCTCC N0:M 2014170的生物材料的保藏单位是 "中国典型培养物保藏中心"，其地址为"中国武汉武汉大学"，该生物材料的保藏日期为 2014年4月28日，其分类命名是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
[0037] 本发明所提供的植物乳杆菌胞外多糖制备方法，是利用乙醇沉淀法直接于植物乳 杆菌发酵液中沉淀多糖，而后经透析去除小分子杂质，并先后利用酶解方法去除核酸及蛋 白杂质，再利用三氯乙酸沉淀杂蛋白，固液分离取上清后执行透析，从而获得纯化的目标多 糖。以上方法依据目标多糖自身性质以及植物乳杆菌发酵液中的杂质成分设计工艺参数， 温度和pH条件温和，同时避免使用超滤等可能打断多糖交联键的纯化方法，有效保证了多 糖内糖苷键及次级结构的完整。在此基础上，本发明结合纯化效率和产物收率匹配了适宜 酶和反应条件，使得多糖纯度和收率得到显著提升，为后续的胞外多糖分子量测定、单糖组 分分析、益生功能评价奠定基础。
[0038] 与现有技术相比较，首先，本发明多糖的分子结构中单糖组分极其简单，仅含有木 糖和半乳糖，且半乳糖占比高达98 %，现有技术中未见报道;此外，本发明多糖经高效排阻 液相色谱处理后的洗脱峰只有一个对称的单峰，是单一分子量的多糖，区别于其他益生菌 含两种分子量的胞外多糖，这也有助于该多糖的物质定性及性质分析；同时，本发明多糖可 利用酸豆角发酵液中的菌株(CCTCC M2014170)来制备，此时该多糖用于人体具有确切的安 全保证。方法层面，本发明方法所制备的多糖能够完整去除核酸和蛋白杂质，且纯度可达 95.1 %，产量可达441.5 ± 7.8mg/L，纯化效率突出。
【附图说明】
[0039] 图1是本发明实施例1所制备植物乳杆菌胞外多糖的全自动扫描光谱（波长范围 200~600nm)〇
[0040] 图2是本发明实施例1中以不同分子量的葡聚糖为标准品、以高效阻液相色谱法绘 制的分子量-洗脱时间标准曲线。
[0041] 图3是本发明实施例1所制备植物乳杆菌胞外多糖的高效阻液相色谱图。
[0042] 图4是本发明实施例1中所选则的多种单糖标品的气质联用色谱图。
[0043] 图5是本发明实施例1所制备植物乳杆菌胞外多糖的气质联用色谱图。
【具体实施方式】
[0044] 以下将对本发明的【具体实施方式】进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在 以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
[0045] 以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的 情况下可允许数量有一定的变动。因此，用"大约"、"左右"等语言所修正的数值不限于该准 确数值本身。在一些实施例中，"大约"表示允许其修正的数值在正负百分之十（10%)的范 围内变化，比如，"大约100"表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在"大约第一数值 到第二数值"的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语 言可能与测量仪器的精度有关。
[0046] 除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人 员普遍理解的相同含义。
[0047] 以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂;所述实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果 取平均值;以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。
[0048] 实施例1
[0049] 1.1植物乳杆菌胞外多糖的制备
[0050] (1)取保藏编号为CCTCC M 2014170的植物乳杆菌，在MRS培养基中发酵，发酵时间 是24h，37°C厌氧培养；
[0051 ] (2)采用2倍体积无水乙醇沉淀发酵液上清48h，12000 Xg离心10min，弃上清，沉淀 采用截留分子量为8000-14000Da的透析袋透析3天，每天换超纯水2次，冷冻干燥获得粗胞 外多糖；
[0052] (3)用50mM Tris-HCl、10mM MgSCk ? 7H20对粗多糖进行溶解，终浓度为5mg/mL，采 用终浓度为2.5yg/mL的核酸酶DNAse type-I在37°C对核酸进行水解6h;
[OO53] (4)水解后的粗多糖采用终浓度为50yg/mL的蛋白酶Pronase E对蛋白质进行酶 解，酶解的条件为37°C，18h;
[0054] (5)水解后用终浓度为12%的三氯乙酸处理30min，用10mol/L的NaOH调节上清pH 至4.0~5.0,进行3天的透析；
[0055] 1.2纯化的胞外多糖中核酸和蛋白质含量的测定
[0056] 取lmg胞外多糖溶于lmL蒸馏水中，以蒸馏水作对照，进行全波长自动扫描分光光 度计测定200~600nm的吸收值。结果如图1所示，光谱在260和280nm均无明显吸收峰，说明 无核酸和蛋白存在。为了进一步确认实验结果，本实施例采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定 蛋白的残余，采用BioTek的Take3多体积板原位法测定核酸残余，实验结果与以上分光光度 法相同。
[0057] 1.3高效排阻液相色谱分析测定胞外多糖的分子量
[0058] (1)采用表1中葡聚糖作为标准品，和多糖样品各5mg分别溶于lmLO . 5mg/mL的 Na2S04溶液中；
[0059] (2)取样量 100yL，所有样品经TSK-GEL G2000PWXL柱子（300mm*7.8mm)，设定柱温 30°C，流速为0.5mL/min。
[0060] 表1葡聚糖标准品的分子量分布
[0062] 如图2所示，利用上述葡聚糖标准品、在以上实验方法下所获得的分子量-洗脱时 间标准曲线呈指数曲线形态，线性良好，可用于分子量的计算。如图3所示，本实施例所制备 的植物乳杆菌胞外多糖的出峰时间是18.774min，只有一个对称的单峰，说明该多糖是单一 分子量的物质。
[0063] 1.4气质联用法测定胞外多糖分子中单糖组分
[0064] (1)多糖水解:称取5mg的胞外多糖样品，加入2mL，0 ? 2mol/mL的三氟乙酸，80°C水 解30min;通风厨干燥，干燥后用甲醇洗2-3次；
[0065] (2)等量称取少量标品(L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和D-半乳糖），混合后取5mg;
[0066] (3)单糖衍生化：水解干燥样品和标品均添加lmL吡啶，0.4mL六甲基二硅氮烷， 0 ? 2mL三甲基氯硅烷，80 °C衍生30min;
[0067] (4)获得的衍生物用过滤器(0.22wn，W〇ndaDiSC NY针头式过滤器），过滤至清亮 状态；
[0068] (5)以Agilent出品的三重串联四级杆气质联用仪作为实验仪器，气质联用仪运行 的条件如下：柱温最初为100°C，维持15min，5°C/min增加到150°C，维持5min，随后增加到 240°C，维持 2min。
[0069]如图4所示，图谱中的峰分别对应L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡 萄糖和D-半乳糖，各单糖标品分别对应一个洗脱时间。如图5所示，本实施例所制备的植物 乳杆菌胞外多糖仅存在2个吸收峰，出峰时间分别对应木糖和半乳糖，而且其中半乳糖含量 占据绝大部分，经计算发现半乳糖的摩尔含量高达98%。
[0070] 实施例2
[0071 ] -种植物乳杆菌胞外多糖，该植物乳杆菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖苷键连接 而成，其中半乳糖的摩尔含量为98%。该植物乳杆菌胞外多糖经空间排阻色谱的洗脱峰数 量为1个。
[0072]上述植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0073] 1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；
[0074] 2)向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以8KDa截留分子量的 透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；
[0075] 3)以含有40mM Tris-HCl、5mM MgS〇4 ? 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤2) 所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2yg/mL，水解；
[0076] 4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度40yg/mL，酶解；
[0077] 5)而后加入三氯乙酸至终浓度10%(w/v)，20min后固液分离取上清，透析，取透析 袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。
[0078] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0079] 步骤1)所述的发酵液是植物乳杆菌厌氧发酵22h时的发酵液。步骤2)中乙醇的加 入量是所述上清液体积的1.5倍。步骤3)中粗多糖的终浓度为4mg/L。步骤3)所述水解是在 35 °C条件下持续4h。步骤4)所述酶解是在35 °C条件下持续16h。步骤5)透析前，先调节上清 液pH至4,再透析。
[0080] 实施例3
[0081 ] -种植物乳杆菌胞外多糖，该植物乳杆菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖苷键连接 而成，其中半乳糖的摩尔含量为98.3%。
[0082]上述植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0083] 1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；
[0084] 2)向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以14KDa截留分子量 的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；
[0085] 3)以含有60mM Tris-HCl、15mM MgSCk ? 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤 2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度3yg/mL，水解；
[0086] 4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度60iig/mL，酶解；
[0087] 5)而后加入三氯乙酸至终浓度15%(w/v)，40min后固液分离取上清，透析，取透析 袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。
[0088] 在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0089] 步骤1)所述的发酵液是植物乳杆菌厌氧发酵26h时的发酵液。步骤2)中乙醇的加 入量是所述上清液体积的2.5倍。步骤3)中粗多糖的终浓度为6mg/L。步骤3)所述水解是在 39°C条件下持续8h。步骤4)所述酶解是在39°C条件下持续20h。步骤5)透析前，先调节上清 液pH至5,再透析。
[0090] 实施例4
[0091 ] -种植物乳杆菌胞外多糖，该植物乳杆菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖苷键连接 而成，其中半乳糖的摩尔含量为98.3%。
[0092]上述植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0093] 1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；
[0094] 2)向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以10~12KDa截留分 子量的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；
[0095] 3)以含有45mM Tris-HCl、8mM MgS〇4 ? 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤2) 所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2.5yg/mL，水解；
[0096] 4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度45yg/mL，酶解；
[0097] 5)而后加入三氯乙酸至终浓度13%(w/v)，25min后固液分离取上清，透析，取透 析袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。
[0098]在以上技术方案的基础上，满足以下条件：
[0099]步骤2)中乙醇的加入量是所述上清液体积的2.2倍。步骤3)所述水解是在38°C条 件下持续5h。步骤5)透析前，先调节上清液pH至4.7,再透析。步骤1)所述的植物乳杆菌，是 保藏编号为CCTCC M 2014170的植物乳杆菌。
[0100] 实施例5
[0101 ] -种植物乳杆菌胞外多糖，该植物乳杆菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖苷键连接 而成，其中半乳糖的摩尔含量为98.3%。该植物乳杆菌胞外多糖经空间排阻色谱的洗脱峰 数量为1个。
[0102] 上述植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0103] 1)取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清；
[0104] 2)向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以lOKDa截留分子量 的透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖；
[0105] 3)以含有55mM Tris-HCl、13mM MgS〇4 ? 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步骤 2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2.8iig/mL，水解；
[0106] 4)而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度55yg/mL，酶解；
[0107] 5)而后加入三氯乙酸至终浓度14%(w/v)，35min后固液分离取上清，透析，取透析 袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。
[0108]以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种植物乳杆菌胞外多糖，其特征在于该植物乳杆菌胞外多糖由木糖和半乳糖以糖 苷键连接而成，其中半乳糖的摩尔含量不低于98%。2. 根据权利要求1所述的植物乳杆菌胞外多糖，其特征在于该植物乳杆菌胞外多糖经 空间排阻色谱的洗脱峰数量为1个。3. -种权利要求1所述植物乳杆菌胞外多糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 取植物乳杆菌发酵液，固液分离取上清； 2) 向步骤1)所述上清液中加入乙醇，醇沉，固液分离取沉淀，以8~14KDa截留分子量的 透析袋透析，取透析袋内容物干燥，即为粗多糖； 3) 以含有40~60mM Tris-HCl、5~15mM MgS〇4 · 7H20的溶液作为粗多糖溶解液，溶解步 骤2)所述粗多糖，而后加入核酸酶DNAse type-I至终浓度2~3yg/mL，水解； 4) 而后加入蛋白酶Pronase E至终浓度40~60yg/mL，酶解； 5) 而后加入三氯乙酸至终浓度10~15% (w/v)，20~40min后固液分离取上清，透析，取 透析袋内容物即为所述植物乳杆菌胞外多糖。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述的发酵液是植物乳杆菌厌 氧发酵22~26h时的发酵液。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤2)中乙醇的加入量是所述上清液 体积的1.5~2.5倍。6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤3)中粗多糖的终浓度为4~6mg/L。7. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤3)所述水解是在35~39°C条件下 持续4~8h。8. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤4)所述酶解是在35~39°C条件下 持续16~20h。9. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤5)透析前，先调节上清液pH至4~ 5,再透析。10. 根据权利要求3~9任一项所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述的植物乳杆菌， 是保藏编号为CCTCC Μ 2014170的植物乳杆菌。
【文档编号】C12R1/25GK105821093SQ201610201385
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】魏华, 张志鸿, 陶雪莹, 徐锋, 夏慧玲, 许恒毅, 万翠香
【申请人】南昌大学