人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法与流程

本发明涉及一种干细胞诱导分化方法，特别是涉及一种人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法。

背景技术：

膝关节软骨损伤是运动医学临床工作的主要研究领域之一，是体育科学研究的热点与重点。关节软骨损伤的早期可引起损伤关节的疼痛和关节功能的受限，晚期关节可能出现退行性病变，发生非炎性骨关节炎，将严重降低患者生活质量。关节软骨损伤后，软骨细胞主要靠关节滑液及细胞周围的基质供给营养，以无氧酵解供能，其自身的修复能力很有限，甚至依靠自身是无法再修复。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)的出现，为软骨损伤的修复治疗带来了希望。间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，具有自我更新，高度增殖及多向分化潜能。在体内外特定的诱导条件下，MSC可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织器官的损伤修复与治疗，具有广阔的临床应用前景。

MSCs最初在骨髓中发现，由于对骨髓来源的MSCs细胞采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制，获取大量骨髓细胞十分困难。此外骨髓来源的MSCs细胞免疫原性较强，而且随着供者年龄的增大，其细胞数量及分化潜能出现明显下降趋势，病毒感染率较高，长期以来人们一直在致力于寻找一种替代骨髓来源的间充质干细胞。

脐带间充质干细胞，是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，主要分布在华通氏胶和脐带血管周围。研究发现，脐带组织来源的MSCs极好地保持了间充质干细胞的生物学特性及多向分化的能力。此外与骨髓及脂肪来源的MSCs相比，脐带组织在取材及免疫原性上表现出很强的优势，主要包括：①脐带中的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。②免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病。③干细胞易于分离，纯度高，无肿瘤细胞污染。④潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播几率比较低。⑤采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤。⑥来源广泛，采集方便，易于保存和运输，伦理争议较少。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种以人脐带来源的间充质干细胞为种子，能将脐带间充质干细胞高效分化为软骨细胞的人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法。

为实现上述目的，本发明将人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法是将脐带组织清洗去除血迹后剪成小段，剖开脐带小段剔除血管组织，将脐带小段剪碎并消化得到单个间充质干细胞，将获得的间充质干细胞扩增培养至第七代制得单细胞悬液，接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换新鲜培养基，诱导14天后，即可得到软骨细胞。即应用改进的胰酶和胶原酶多步消化法，从脐带组织中分离提取并采用无血清培养基对原代MSCs进行扩增培养获得了大量的MSCs。将MSCs单细胞悬液，接种于软骨分化专用诱导剂中继续培养14天后，即可得到软骨细胞。本发明人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法具有能将脐带间充质干细胞高效分化为软骨细胞的优点。

作为优化，所述制得单细胞悬液是先进行(1)脐带组织的预处理、后用(2)酶消化法从脐带中获取原代的MSCs细胞，再将(3)脐带来源MSCs细胞的扩增培养制得单细胞悬液；

所述(1)脐带组织的预处理是剪取健康足月剖宫产的新生儿脐带靠近婴儿端脐带长约20cm左右，先置于含双抗的生理盐水中浸泡，后在无菌条件下，将脐带组织置于皿中，以含双抗的DPBS反复冲洗，直至无明显血块；先将脐带剪成小段，后纵向剖开，再剔除动静脉；以含双抗的DPBS将组织块漂洗干净，并将其剪碎至组织小块；

所述(2)酶消化法从脐带中获取原代的MSCs细胞是将剪碎的组织块收集至离心管内，加入胰蛋白酶，37℃水浴摇床上消化，弃去消化液，用DPBS将组织块反复冲洗多次，并移至另一新离心管内，加胶原酶I消化液，置于水浴摇床上消化，并确保组织块与消化液充分接触；将消化液以细胞筛网过滤后收集滤液，加入多倍滤液体积的完全培养基终止消化，离心、吸弃上清液，即得到一次原代MSCs细胞沉淀；剩余组织块加胶原酶I重复上述步骤继续消化，收集得到二次原代MSCs细胞沉淀；将两次消化获取的细胞沉淀重悬于无血清培养基，于37℃，5％CO₂的培养箱内静置培养；待次日细胞贴壁后，更换新鲜的培养基，以后每3天更换一次培养液，观察细胞的生长状态；

(3)脐带来源MSCs细胞的扩增培养是待原代培养的细胞达到80％以上汇合时，吸弃培养液，加入Tryple消化，以无血清培养基终止消化，离心，将细胞沉淀重悬于无血清培养基中；借助台盼蓝计数法，将5x10⁵/瓶活细胞接种于新的培养瓶中，置于培养箱中37℃，5％CO₂培养中继续培养并观察细胞生长情况，待细胞扩增后得单细胞悬液。

作为优化，(1)步骤中：含双抗的生理盐水是含1％双抗的生理盐水，将脐带组织置于皿中是将脐带组织置于10cm培养皿中，双抗的DPBS是1％双抗的DPBS，将脐带剪成小段是将脐带剪成2-3cm长的小段，剪碎至组织小块是用眼科剪将其剪碎至1-2mm³的组织小块；

(2)步骤中：所述离心管为50ml的离心管，加入胰蛋白酶是加入0.25％胰蛋白酶，37℃水浴摇床上消化是37℃水浴摇床上消化10分钟，用DPBS将组织块反复冲洗多次是用DPBS将组织块反复冲洗三次，加胶原酶I消化液是加0.1％胶原酶I消化液，置于水浴摇床上消化是置于37℃水浴摇床上消化1小时，摇床转速为100转/分钟；加入多倍滤液体积的完全培养基终止消化，离心是加入3倍滤液体积的完全培养基终止消化，1000转/分钟，离心5分钟；剩余组织块加胶原酶I重复上述步骤继续消化是剩余组织块加0.1％胶原酶I重复上述步骤继续消化1小时；

(3)加入Tryple消化是加入Tryple消化2-3min，离心是1000rpm离心5min，培养瓶是T-75。

作为优化，在制得单细胞悬液后，先进行(1)MSCs细胞的形态学鉴定和(2)MSCs细胞表面标志物表达的鉴定，鉴定合格后才进行接种；

所述(1)MSCs细胞的形态学鉴定是倒置显微镜下观察，在无血清培养基条件下贴壁生长的细胞呈梭形或分支状生长，接种后第4天即大量汇合，以平行排列状或漩涡状生长，细胞在增殖传代过程中形态无明显改变，即为形态学鉴定合格；

所述(2)MSCs细胞表面标志物表达的鉴定是取扩增培养至第七代的MSCs单细胞悬液，去掉培养液，加入Tryple消化细胞，以无血清培养基终止消化后，加DPBS洗涤细胞，并制成1ml共含有1×10⁷个MSCs的单细胞悬液，等分为10份，分别加入10个Eppendorf管中，按照人类间充质干细胞分析试剂盒(BD 562245Human MSC Analysis Kit)说明加入对应的抗体，室温避光孵育30min，用DPBS清洗两次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测；如果结果是获取的MSCs均表现为CD44、CD73、CD90、和CD105阳性比率均高于95％的强阳性，阳性比率低于2％的不表达CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR，即为MSCs细胞表面标志物表达检测合格。

作为优化，制得单细胞悬液加入Tryple消化细胞，以无血清培养基终止消化，将得到的细胞沉淀以无血清培养基调整至1x10⁷个/ml，之后接种于96孔板中，次日待细胞贴壁后，更换为100μl成软骨分化培养基，每3天以半换液的形式补充成软骨分化培养基，诱导约14天后，得到细胞球。

作为优化，之后接种于96孔板中是之后以5μl/孔接种于96孔板中。

作为优化，其中成软骨分化培养基组成为：DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10ng/ml的TGF-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50μg/ml，地塞米松10^-7mol/L，丙酮酸钠6.25μg/ml。链霉素，10ng/ml的TGF-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50μg/ml，地塞米松10^-7mol/L，丙酮酸钠6.25μg/ml。

作为优化，得到软骨细胞后进行MSCs细胞成软骨分化能力的检测，判断得到的细胞是否为软骨细胞。

作为优化，MSCs细胞成软骨分化能力的检测是对在分化培养基内诱导培养14天的细胞球，用4％多聚甲醛室温固定15min后执行阿利新蓝染色鉴定，检测得到的细胞是否为软骨细胞。

作为优化，阿利新蓝染色鉴定是吸去多聚甲醛，用PBS漂洗2次后，加入pH 2.5的阿利新蓝染液染色30min，蒸馏水冲洗2min，在倒置相差显微镜下观察染色情况，如果显微镜下可见有细胞小球生成，且被阿利新蓝染液染为蓝色，即为细胞胞浆内硫酸化糖胺多糖表达阳性，表现出了软骨细胞的生物学特性。

本发明一种将人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法主要包括：将脐带组织清洗去除血迹后剪成小段，剖开脐带小段剔除血管组织，将脐带小段剪碎并消化得到单个间充质干细胞，将获得的间充质干细胞扩增培养后制得单细胞悬液，接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换新鲜培养基，诱导14天后，即可得到软骨细胞。该方法证明了脐带间充质干细胞可高效分化为软骨细胞，在修复人体内软骨组织，治疗骨损伤方面具有重要意义。

采用上述技术方案后，本发明人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法能将脐带间充质干细胞高效分化为软骨细胞，在修复人体内软骨组织，治疗骨损伤方面具有重要意义的优点。

附图说明

图1是本发明人脐带源间充质干细胞在细胞接种于无血清培养基中培养第二天的形态学照片；

图2是本发明人脐带源间充质干细胞在细胞接种于无血清培养基中培养第四天的形态学照片；

图3-5是本发明人脐带源间充质干细胞在无血清培养基中培养至第七代时细胞表面标志物的表达数值示图；

图6是本发明人脐带源间充质干细胞在细胞接种于成软骨分化培养基中培养第十四天形成的细胞小球，经阿利新蓝染成蓝色的形态学照片。

具体实施方式

本发明人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法是将脐带组织清洗去除血迹后剪成小段，剖开脐带小段剔除血管组织，将脐带小段剪碎并消化得到单个间充质干细胞，将获得的间充质干细胞扩增培养至第七代制得单细胞悬液，接种于含软骨分化诱导剂的无血清培养基中继续培养，每隔3天半量更换新鲜培养基，诱导14天后，即可得到软骨细胞。

具体是所述制得单细胞悬液是先进行(1)脐带组织的预处理、后用(2)酶消化法从脐带中获取原代的MSCs细胞，再将(3)脐带来源MSCs细胞的扩增培养制得单细胞悬液：

所述(1)脐带组织的预处理是剪取健康足月剖宫产的新生儿脐带靠近婴儿端脐带长约20cm左右，先置于含双抗的生理盐水中浸泡，后在无菌条件下，将脐带组织置于皿中，以含双抗的DPBS反复冲洗，直至无明显血块；先将脐带剪成小段，后纵向剖开，再剔除动静脉；以含双抗的DPBS将组织块漂洗干净，并将其剪碎至组织小块；

所述(2)酶消化法从脐带中获取原代的MSCs细胞是将剪碎的组织块收集至离心管内，加入胰蛋白酶，37℃水浴摇床上消化，弃去消化液，用DPBS将组织块反复冲洗多次，并移至另一新离心管内，加胶原酶I消化液，置于水浴摇床上消化，并确保组织块与消化液充分接触；将消化液以细胞筛网过滤后收集滤液，加入多倍滤液体积的完全培养基终止消化，离心、吸弃上清液，即得到一次原代MSCs细胞沉淀；剩余组织块加胶原酶I重复上述步骤继续消化，收集得到二次原代MSCs细胞沉淀；将两次消化获取的细胞沉淀重悬于无血清培养基，于37℃，5％CO₂的培养箱内静置培养；待次日细胞贴壁后，更换新鲜的培养基，以后每3天更换一次培养液，观察细胞的生长状态；

所述(3)脐带来源MSCs细胞的扩增培养是待原代培养的细胞达到80％以上汇合时，吸弃培养液，加入Tryple消化，以无血清培养基终止消化，离心，将细胞沉淀重悬于无血清培养基中；借助台盼蓝计数法，将5x10⁵/瓶活细胞接种于新的培养瓶中，置于培养箱中37℃，5％CO₂培养中继续培养并观察细胞生长情况，待细胞扩增后得单细胞悬液。

更具体是：(1)步骤中：含双抗的生理盐水是含1％双抗的生理盐水，将脐带组织置于皿中是将脐带组织置于10cm培养皿中，双抗的DPBS是1％双抗的DPBS，将脐带剪成小段是将脐带剪成2-3cm长的小段，剪碎至组织小块是用眼科剪将其剪碎至1-2mm³的组织小块；

(2)步骤中：所述离心管为50ml的离心管，加入胰蛋白酶是加入0.25％胰蛋白酶，37℃水浴摇床上消化是37℃水浴摇床上消化10分钟，用DPBS将组织块反复冲洗多次是用DPBS将组织块反复冲洗三次，加胶原酶I消化液是加0.1％胶原酶I消化液，置于水浴摇床上消化是置于37℃水浴摇床上消化1小时，摇床转速为100转/分钟；加入多倍滤液体积的完全培养基终止消化，离心是加入3倍滤液体积的完全培养基终止消化，1000转/分钟，离心5分钟；剩余组织块加胶原酶I重复上述步骤继续消化是剩余组织块加0.1％胶原酶I重复上述步骤继续消化1小时；

(3)加入Tryple消化是加入Tryple消化2-3min，离心是1000rpm离心5min，培养瓶是T-75。

具体是：在制得单细胞悬液后，先进行(1)MSCs细胞的形态学鉴定和(2)MSCs细胞表面标志物表达的鉴定，鉴定合格后才进行接种；

所述(1)MSCs细胞的形态学鉴定是倒置显微镜下观察，在无血清培养基条件下贴壁生长的细胞呈梭形或分支状生长，接种后第4天即大量汇合，以平行排列状或漩涡状生长，细胞在增殖传代过程中形态无明显改变，即为形态学鉴定合格；

所述(2)MSCs细胞表面标志物表达的鉴定是取扩增培养至第七代的MSCs单细胞悬液，去掉培养液，加入Tryple消化细胞，以无血清培养基终止消化后，加DPBS洗涤细胞，并制成1ml共含有1×10⁷个MSCs的单细胞悬液，等分为10份，分别加入10个Eppendorf管中，按照人类间充质干细胞分析试剂盒(BD 562245Human MSC Analysis Kit)说明加入对应的抗体，室温避光孵育30min，用DPBS清洗两次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测；如果结果是获取的MSCs均表现为CD44、CD73、CD90、和CD105阳性比率均高于95％的强阳性，阳性比率低于2％的不表达CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR，即为MSCs细胞表面标志物表达检测合格。人类间充质干细胞分析试剂盒就是BD 562245Human MSC Analysis Kit试剂盒。

具体是：制得单细胞悬液加入Tryple消化细胞，以无血清培养基终止消化，将得到的细胞沉淀以无血清培养基调整至1x10⁷个/ml，之后接种于96孔板中，次日待细胞贴壁后，更换为100μl成软骨分化培养基，每3天以半换液的形式补充成软骨分化培养基，诱导约14天后，得到细胞球。

更具体是：之后接种于96孔板中是之后以5μl/孔接种于96孔板中。

具体是：其中成软骨分化培养基组成为：DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10ng/ml的TGF-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50μg/ml，地塞米松10^-7mol/L，丙酮酸钠6.25μg/ml。

具体是：得到软骨细胞后进行MSCs细胞成软骨分化能力的检测，判断到的细胞是否为软骨细胞。

更具体是：MSCs细胞成软骨分化能力的检测是对在分化培养基内诱导培养14天的细胞球，用4％多聚甲醛室温固定15min后执行阿利新蓝染色鉴定，检测得到的细胞是否为软骨细胞。

优选：阿利新蓝染色鉴定是吸去多聚甲醛，用PBS漂洗2次后，加入pH 2.5的阿利新蓝染液染色30min，蒸馏水冲洗2min，在倒置相差显微镜下观察染色情况，如果显微镜下可见有细胞小球生成，且被阿利新蓝染液染为蓝色，即为细胞胞浆内硫酸化糖胺多糖表达阳性，表现出了软骨细胞的生物学特性。

下面结合附图作更进一步说明：

本发明人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法的步骤如下：

1、脐带来源MSCs细胞的分离培养：

(1)脐带组织的预处理：脐带样本来自健康足月剖宫产的新生儿脐带，剪取靠近婴儿端脐带长约20cm左右，置于含1％双抗的生理盐水中浸泡。在无菌条件下，将脐带组织置于10cm培养皿中，以含1％双抗的DPBS反复冲洗，直至无明显血块。将脐带剪成2-3cm长的小段，纵向剖开，剔除动静脉。以含1％双抗的DPBS将组织块漂洗干净，并用眼科剪将其剪碎至1-2mm³的组织小块。

(2)酶消化法从脐带中获取原代的MSCs细胞：将剪碎的组织块收集至50ml的离心管内，加入0.25％胰蛋白酶，37℃水浴摇床上消化10分钟。弃去消化液，用DPBS将组织块反复冲洗三次，并移至另一新的50ml的离心管内，加0.1％胶原酶I消化液，置于37℃水浴摇床上消化1小时，摇床转速为100转/分钟，以确保组织块与消化液充分接触。将消化液以细胞筛网过滤后收集滤液，加入3倍滤液体积的完全培养基终止消化，1000转/分钟，离心5分钟，吸弃上清液，即得到原代MSCs细胞沉淀。剩余组织块加0.1％胶原酶I重复上述步骤继续消化1小时，收集得到MSCs细胞沉淀。将得到的细胞沉淀重悬于无血清培养基，于37℃，5％CO₂的培养箱内静置培养。待次日细胞贴壁后，更换新鲜的培养基，以后每3天更换一次培养液，观察细胞的生长状态。

(3)脐带来源MSCs细胞的扩增培养：待原代培养的细胞达到80％以上汇合时，吸弃培养液，加入Tryple消化2-3min，以无血清培养基终止消化，1000rpm离心5min，将细胞沉淀重悬于无血清培养基中。台盼蓝计数，5x10⁵/瓶活细胞接种于新的T-75培养瓶中。置于培养箱中37℃，5％CO₂培养中继续培养并观察细胞生长情况。

2、细胞鉴定：

(1)MSCs细胞的形态学鉴定：如图1和2，倒置显微镜下观察，在无血清培养基条件下贴壁生长的细胞呈梭形或分支状生长，接种后第4天即大量汇合，以平行排列状或漩涡状生长，细胞在增殖传代过程中形态无明显改变。

(2)MSCs细胞表面标志物表达的鉴定：细胞表面标志物的鉴定取扩增培养至第七代的MSCs，去掉培养液，加入Tryple消化细胞，以无血清培养基终止消化后，加DPBS洗涤细胞，并制成1ml共含有1×10⁷个MSCs的单细胞悬液，等分为10份，分别加入10个Eppendorf管中，按照人类间充质干细胞分析试剂盒(BD 562245Human MSC Analysis Kit)说明加入对应的抗体，室温避光孵育30min，用DPBS清洗两次，去除未标记的抗体，流式细胞仪进行检测。

结果如图3-5：我们获取的MSCs均表现为CD44、CD73、CD90、和CD105强阳性(阳性比率均高于95％)，不表达CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR(阳性比率低于2％)，说明我们所分离培养的细胞在P7代具有间充质干细胞的表型特征。

3、诱导分化：

(1)MSCs细胞向软骨细胞方向诱导培养：待细胞扩增至一定程度后，加入Tryple消化细胞，以无血清培养基终止消化，将得到的细胞沉淀以无血清培养基调整至1x10⁷个/ml，之后以5μl/孔接种于96孔板中，次日待细胞贴壁后，更换为100μl成软骨分化培养基，其中成软骨分化培养基组成为：DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，10ng/ml的TGF-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50μg/ml，地塞米松10^-7mol/L，丙酮酸钠6.25μg/ml。每3天以半换液的形式补充成软骨分化培养基，诱导约14天后，得到细胞球。

(2)MSCs细胞成软骨分化能力的检测：对在分化培养基内诱导培养14天的细胞球，用4％多聚甲醛室温固定15min后执行阿利新蓝染色鉴定，检测得到的细胞是否为软骨细胞。具体如下：吸去多聚甲醛，用PBS漂洗2次后，加入pH 2.5的阿利新蓝染液染色30min，蒸馏水冲洗2min，在倒置相差显微镜下观察染色情况。

结果表明，通过本发明所述的定向诱导分化技术，P7代细胞可以向软骨细胞分化。如图6，经成软骨诱导培养14天后，显微镜下可见有细胞小球生成，且细胞胞浆内硫酸化糖胺多糖表达阳性(被阿利新蓝染液染为蓝色)，表现出了软骨细胞的生物学特性。

本发明中用到的试剂：本发明中所述的双抗(PS)购自Gibco公司，其中1％的使用浓度意思是含100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素。本发明所述的0.1％胶原酶I指的是0.1g胶原酶I粉末溶于100ml的HBSS(含钙镁)缓冲液中，经0.2μm一次性滤器过滤后分装，-20℃储存，用前取出于37℃预热。本发明中所用的无血清培养液来自Gibco公司。

采用上述技术方案后，本发明人脐带源间充质干细胞诱导分化成软骨细胞的方法能将脐带间充质干细胞高效分化为软骨细胞，在修复人体内软骨组织，治疗骨损伤方面具有重要意义的优点。