本发明属于细胞培养领域。更具体地，本发明涉及一种中国仓鼠卵巢细胞培养基。
背景技术：
：真核细胞中中国仓鼠卵巢细胞(ChineseHamsterOvary，中国仓鼠卵巢细胞)是目前重组糖基蛋白生产的首选体系，因为与其他表达系统相比，其具有诸多优点。目前已有越来越多的药用蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达，其中许多CHO表达的药物已投放市场，例如EPO、Enbrel等。国际和国内有很多人开发了各种CHO培养基和补料配方，如：国内华东理工大学张立、张元兴等人在中国专利申请200410018258.0中公布的CHO培养基。国际上有商业出售的培养基，如JRHBiosciences公司是专业从事细胞培养基产品(cellculturemedia)的公司，是美国FDA指定生物医药企业专用培养基。Invitrogen公司也出品无血清培养基。但是大规模的进行抗体药物蛋白质表达需要的培养基量很大，费用昂贵，比如JRH基础培养基的价格在每升100元人民币以上，在成本中占很大比例，在我国，蛋白药物厂家也面临着培养基的巨额费用的问题，而且同时蛋白产量低也是一个很大的问题。因此，本领域迫切需要开发新的适合中国仓鼠卵巢细胞培养的、高蛋白产量的无血清培养基。技术实现要素：本发明的目的就是为解决上述问题，提供一种新的培养中国仓鼠卵巢细胞的培养基，本发明培养基是适合中国仓鼠卵巢细胞培养的、高蛋白产量的无血清培养基。本发明培养基通过以下技术方案实现的：一种中国仓鼠卵巢细胞培养基包括以下组分：DMEM基础培养基10-50g/L，酵母抽提物1-20g/L，碳酸氢钠0.2-3.4g/L，氨基酸5-50g/L，维生素1.5-10g/L，无机盐2.9-15g/L，白蛋白1-20g/L，转铁蛋白30-50g/L和亚油酸1-30mg/L。优选地，所述氨基酸(g/L)包括：精氨酸0.05-1.59g/L，亮氨酸1.25-2.56g/L，异亮氨酸0.86-3.42g/L，天冬氨酸0.12-1.27g/L，谷氨酸0.21-4.25g/L，赖氨酸0.13-2.47g/L，苏氨酸2.46-5.64g/L，脯氨酸0.19-0.95g/L，甘氨酸0.023-0.45g/L和丙氨酸1.38-5.35g/L。优选地，所述无机盐(g/L)包括：柠檬酸铁2.42-4.87g/L，硫酸锌0.13-1.24g/L，硫酸铜0.98-4.58g/L，亚硒酸钠0.05-3.84g/L，硫酸镁0.0042-0.05g/L和偏钒酸钠0.00047-0.0085g/L。优选地，所述维生素(g/L)包括：维生素B10.10-0.58g/L，维生素B20.25-1.38g/L，维生素B50.02-0.65g/L，维生素B120.001-0.056g/L，维生素C0.13-0.84g/L，维生素E0.23-2.41g/L和维生素D1.0-3.85g/L。优选地，所述中国仓鼠卵巢细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM基础培养基32g/L，酵母抽提物13g/L，碳酸氢钠0.85g/L，白蛋白16g/L，转铁蛋白35g/L和亚油酸21mg/L，精氨酸1.32g/L，亮氨酸1.58g/L，异亮氨酸2.92g/L，天冬氨酸0.73g/L，谷氨酸2.51g/L，赖氨酸1.42g/L，苏氨酸3.65g/L，脯氨酸0.87g/L，甘氨酸0.19g/L，丙氨酸2.13g/L，柠檬酸铁3.29g/L，硫酸锌1.04g/L，硫酸铜2.97g/L，亚硒酸钠1.03g/L，硫酸镁0.03g/L，偏钒酸钠0.0022g/L，维生素B10.36g/L，维生素B20.97g/L，维生素B50.24g/L，维生素B120.031g/L，维生素C0.54g/L，维生素E1.33g/L和维生素D2.67g/L。DMEM基础培养基为细胞的生长提供所需的营养成分，酵母抽提物的加入使培养基营养更加丰富。氨基酸作为最主要的氮源物质，存在于细胞培养基中。氨基酸可合成蛋白质、多肽及其他含氮化合物，其分解产生的能量供细胞生长，本发明培养基中加入的氨基酸及其浓度，对中国仓鼠卵巢细胞有良好的促进作用，并且其中的这些氨基酸会影响中国仓鼠卵巢细胞蛋白表达水平。白蛋白是脂类、无机盐等小分子物质的载体，可解决脂类的难溶性及细胞毒性的问题；也可增加培养基黏度，保护悬浮细胞免受剪切力的损伤。本发明细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：S1.称取上述DMEM培养基干粉，酵母抽提物，氨基酸，可溶性维生素，无机盐，白蛋白，转铁蛋白，加注射用水至总体积的70％-85％，轻微搅拌溶解，并继续加入维生素E、D和亚油酸，并加入0.2％的吐温80，搅拌溶解，得A液；S2.向步骤S1所得A液中加入碳酸氢钠，轻微搅拌溶解，加注射用水至规定体积，得B液；S3.向步骤S2所得B液中用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2-7.4，得C液；S4.将步骤S3所得C液中用0.22μm滤膜正压过滤除菌，即得。本发明的培养基，为中国仓鼠卵巢细胞生长提供了丰富的营养环境，避免了有血清添加的各种弊端，本发明培养基各组分共同作用，减少了中国仓鼠卵巢细胞生长代谢产生的有害代谢物，在不添加补料培养基的条件下，能够促进中国仓鼠卵巢细胞功能蛋白的表达。本发明提供了一种中国仓鼠卵巢细胞培养基，是一种无血清培养基，具有以下优点：1、本发明提供的中国仓鼠卵巢细胞的无血清基础培养基，能够促进中国仓鼠卵巢细胞生长，减少有害代谢物。2、本发明培养基可以促进中国仓鼠卵巢细胞功能蛋白的表达和积累。具体实施方式下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1一种中国仓鼠卵巢细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM基础培养基10g/L，酵母抽提物1g/L，碳酸氢钠0.2g/L，白蛋白1g/L，转铁蛋白30g/L和1-30mg/L的亚油酸。所需添加氨基酸，如表1所示：表1培养基中所需添加的氨基酸(g/L)所需添加无机盐，如表2所示：表2培养基中所需添加的无机盐(g/L)柠檬酸铁2.42硫酸锌0.13硫酸铜0.98亚硒酸钠0.05硫酸镁0.0042偏钒酸钠0.00047所需添加的维生素，如表3所示：表3培养基所需添加的维生素(g/L)维生素B10.10维生素B20.25维生素B50.02维生素B120.001维生素C0.13维生素E0.23维生素D1.0培养基制备方法：S1.称取上述DMEM培养基干粉，酵母抽提物，氨基酸，可溶性维生素，无机盐，白蛋白，转铁蛋白，加注射用水至总体积的70％-85％，轻微搅拌溶解，并继续加入维生素E、D和亚油酸，并加入0.2％的吐温80，搅拌溶解，得A液；S2.向步骤S1所得A液中加入碳酸氢钠，轻微搅拌溶解，加注射用水至规定体积，得B液；S3.向步骤S2所得B液中用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调pH至7.2-7.4，得C液；S4.将步骤S3所得C液中用0.22μm滤膜正压过滤除菌，即得。实施例2一种中国仓鼠卵巢细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM基础培养基50g/L，酵母抽提物20g/L，碳酸氢钠3.4g/L，白蛋白20g/L，转铁蛋白50g/L和亚油酸30mg/L。所需添加氨基酸，如表4所示：表4培养基中所需添加的氨基酸(g/L)精氨酸1.59亮氨酸2.56异亮氨酸3.42天冬氨酸1.27谷氨酸4.25赖氨酸2.47苏氨酸5.64脯氨酸0.95甘氨酸0.45丙氨酸5.35所需添加无机盐，如表5所示：表5培养基中所需添加的无机盐(g/L)所需添加的维生素，如表6所示：表6培养基所需添加的维生素(g/L)维生素B10.58维生素B21.38维生素B50.65维生素B120.056维生素C0.84维生素E2.41维生素D3.85制备方法与实施例1类似。实施例3一种中国仓鼠卵巢细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM基础培养基32g/L，酵母抽提物13g/L，碳酸氢钠0.85g/L，白蛋白16g/L，转铁蛋白35g/L和亚油酸21mg/L。所需添加氨基酸，如表7所示：表7培养基中所需添加的氨基酸(g/L)精氨酸1.32亮氨酸1.58异亮氨酸2.92天冬氨酸0.73谷氨酸2.51赖氨酸1.42苏氨酸3.65脯氨酸0.87甘氨酸0.19丙氨酸2.13所需添加无机盐，如表8所示：表8培养基中所需添加的无机盐(g/L)柠檬酸铁3.29硫酸锌1.04硫酸铜2.97亚硒酸钠1.03硫酸镁0.03偏钒酸钠0.0022所需添加的维生素，如表9所示：表9培养基所需添加的维生素(g/L)维生素B10.36维生素B20.97维生素B50.24维生素B120.031维生素C0.54维生素E1.33维生素D2.67制备方法与实施例1类似。对比例1一种中国仓鼠卵巢细胞培养基，由以下成分及其浓度组成：DMEM基础培养基32g/L，酵母抽提物13g/L，磷酸氢二钠2.8g/L，白蛋白16g/L，转铁蛋白35g/L和亚油酸21mg/L。所需添加氨基酸(g/L)，如表10所示：表10培养基中所需添加的氨基酸所需添加无机盐，如表11所示：表11培养基中所需添加的无机盐柠檬酸铁3.29硫酸锌1.04硫酸铜2.97亚硒酸钠1.03硫酸镁0.03偏钒酸钠0.0022所需添加的维生素，如表12所示：表12培养基所需添加的维生素维生素B10.36维生素B20.97维生素B50.24维生素B120.031维生素C0.54维生素E1.33维生素D2.67与实施例3的区别在于，用磷酸氢二钠替换碳酸氢钠。制备方法与实施例1类似。试验例1细胞培养基对中国仓鼠卵巢细胞生长及性能的研究试验对象：实施例1-3及对比例1制备得到的CHO培养基试验方式：流加培养(加入补料培养基)，加入补料培养基为JRH补料培养基试验程序：在这个培养试验中，在细胞生长到对数生长期中期的进行补料，细胞在平台期的中期进行降温操作开始表达蛋白，存活率降低到50％左右为培养终点。培养环境：37℃，5％二氧化碳，95％空气。摇瓶培养过程：在超净台内分别向4个125mL摇瓶内加入过滤好的实施例1的培养基、实施例2的培养基、实施例3的培养基和对比例1的培养基，接种后使得细胞总体积为30mL，接种时细胞密度皆为：0.5x106/mL。在细胞生长到对数生长期中期(第七天)进行补料，加入浓缩的相对应的的补料培养基750μl左右，细胞培养液体积没有太大变化(取样和蒸发会损失一点体积)。细胞进入平台期中期后开始降温，使细胞由生长状态转为表达蛋白。实验结果：细胞生长状况及表达蛋白浓度如表13所示：表13中国仓鼠卵巢细胞在不同培养基中的生长状况项目实施例1实施例2实施例3对比例1生长七天后细胞密度(细胞/mL)2.7x1062.3x1063.1x1061.8x106补料后最高密度12.9.x10612.3x10613.6x10610.3x106补料后最高密度时细胞生存率97.897.698.892.1蛋白滴度(g/L)1.211.091.50.69通过实验比较，实施例3培养基与实施例1、实施例2培养基相比能达到更高的细胞密度，细胞密度、细胞生存率及蛋白滴度均比对比例1高，这说明本发明培养基是一个稳定平衡的整体，各成分相互作用，共同促进中国仓鼠卵巢细胞的生长。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。当前第1页1 2 3