一种基于3D生物打印构建三维血管组织的方法与流程

本发明涉及组织工程技术领域，特别是一种基于3D生物打印构建三维血管组织的方法。

背景技术：

组织工程的目标是通过制造缺失或者损伤的组织和器官替代物，来解决供体器官极度短缺的难题。目前，组织工程已经取得了很多进展，然而这些进展仅局限于相对较薄的组织结构，例如皮肤和膀胱等。这些工程化组织能够依靠周围宿主血管提供营养，但是当工程化组织的厚度超过150-200微米时，就超过了氧气与营养物质扩散的限制。因此为了给组织提供氧气和营养以及移出细胞内的代谢废物，组织工程必须为工程化组织创建一种功能性的血管网络。传统的组织工程无法解决这个难题，然而生物打印技术有希望解决这种关键性的问题。

基于喷墨式打印的生物打印技术是一种非接触性的打印技术，该技术可以实现极小的墨滴在生物材料等基材上的打印构建。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种通过将细胞打印到特定位置，同时发生酶聚合反应而形成支架，在这种细胞支架结构体中形成微米级的纤维蛋白通道，从而在工程化组织中形成微血管网络的基于3D生物打印构建三维血管组织的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种基于3D生物打印构建三维血管组织的方法，其创新点在于：依次由人类微血管内皮细胞的培养、生物墨水的配制、生物打印纸的制备、3D打印纤维蛋白通道的制备和微血管系统的培养来完成构建三维血管组织，具体步骤如下：

1）人类微血管内皮细胞的培养：取一百万个人类微血管内皮细胞培养在MCDB131培养基中，培养温度为37℃，培养环境为含5%（v/v）CO₂的空气，每2天更换培MCDB131养基，培养10天后传代，传代时将细胞悬液a在1000转/分钟的速度下离心转动5分钟，弃去上层清液，得到人类微血管内皮细胞；

2）生物墨水的配制：将所得到的人类微血管内皮细胞用PBS配置成细胞悬液b，取等体积的细胞悬液b与凝血酶溶液混合即得生物墨水，其中凝血酶溶液中含100酶活力单位/ml的凝血酶和160mmol/L的钙离子，所述得到的生物墨水每毫升含有8百万人类微血管内皮细胞，50酶活力单位的凝血酶, 钙离子浓度为80mmol/L；

3）生物打印纸的制备：将120毫克的纤维蛋白酶原溶液溶于2毫升去离子水中，混合均匀后过滤得到纤维蛋白酶溶液即生物打印纸，其中纤维蛋白酶的浓度为60毫克/毫升；

4）3D打印纤维蛋白通道的制备：打印前将生物打印机进行紫外线杀菌消毒，然后将配制好的生物墨水加入到无菌的生物打印墨盒中，以纤维蛋白酶溶液作为打印纸进行打印，打印过程中，生物墨水与生物打印纸发生酶聚合作用形成3D纤维蛋白通道，而生物墨水中的人类微血管内皮细胞不断沉积并整齐排列在纤维蛋白通道内；

5）微血管系统的培养：将打印好的3D纤维蛋白通道放置在37℃环境下孵育15-20分钟直到凝固产生纤维蛋白支架，然后小心的MCDB131培养基加入到纤维蛋白支架上培养21天，培养温度为37℃，培养环境为含5%（v/v）CO₂的空气，且每2天更换一次MCDB131培养基，即可得到微血管系统。

进一步的，所述步骤（1）或（5）中的MCDB131培养基还添加有补充因子，所述补充因子包括胎牛血清、L-谷氨酰胺、皮质醇、人类表皮生长因子和肝素。

本发明的有益效果如下：

发明提供的基于3D生物打印构建三维血管组织的方法操作简便、工艺先进，通过将人类微血管内皮细胞配制成生物墨水并用生物打印机打印，生物墨水与生物打印纸发生酶聚合作用形成管道结构，沉积在管道中的内皮细胞通过增殖逐渐填充管道而形成由人类微血管内皮细胞组成的管状网络结构，即微血管系统。无论组织厚薄程度如何，通过该方法利用3D打印技术都可以形成内皮网络结构，实用性较强，适合广泛推广。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明。

图1为通过本发明方法打印出的蛋白纤维通道扫描电镜孔洞图；

图2为通过本发明方法打印出的蛋白纤维通道扫描电镜纤维蛋白支架图；

图3为本发明培养21天后的微血管通道形态图；

图4为本发明打印血管的形态图。

具体实施方式

为使本领域技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，下面结合附图及具体实施例进行进一步说明。

具体实施例

一种基于3D生物打印构建三维血管组织的方法，依次由人类微血管内皮细胞的培养、生物墨水的配制、生物打印纸的制备、3D打印纤维蛋白通道的制备和微血管系统的培养来完成构建三维血管组织，具体步骤如下：

1）人类微血管内皮细胞的培养：取一百万个人类微血管内皮细胞培养在MCDB131培养基中，培养温度为37℃，培养环境为含5%（v/v）CO₂的空气，每2天更换培MCDB131养基，培养10天后传代，传代时将细胞悬液a在1000转/分钟的速度下离心转动5分钟，弃去上层清液，得到人类微血管内皮细胞；

2）生物墨水的配制：将所得到的人类微血管内皮细胞用PBS配置成细胞悬液b，取等体积的细胞悬液b与凝血酶溶液混合即得生物墨水，其中凝血酶溶液中含100酶活力单位/ml的凝血酶和160mmol/L的钙离子，所述得到的生物墨水每毫升含有8百万人类微血管内皮细胞，50酶活力单位的凝血酶, 钙离子浓度为80mmol/L；

3）生物打印纸的制备：将120毫克的纤维蛋白酶原溶液溶于2毫升去离子水中，混合均匀后过滤得到纤维蛋白酶溶液即生物打印纸，其中纤维蛋白酶的浓度为60毫克/毫升；

4）3D打印纤维蛋白通道的制备：打印前将生物打印机进行紫外线杀菌消毒，然后将配制好的生物墨水加入到无菌的生物打印墨盒中，以纤维蛋白酶溶液作为打印纸进行打印，打印过程中，生物墨水与生物打印纸发生酶聚合作用形成3D纤维蛋白通道，而生物墨水中的人类微血管内皮细胞不断沉积并整齐排列在纤维蛋白通道内；

5）微血管系统的培养：将打印好的3D纤维蛋白通道放置在37℃环境下孵育15-20分钟直到凝固产生纤维蛋白支架，然后小心的MCDB131培养基加入到纤维蛋白支架上培养21天，培养温度为37℃，培养环境为含5%（v/v）CO₂的空气，且每2天更换一次MCDB131培养基，即可得到微血管系统。

为了对本发明制备的微血管系统样品（三维血管组织）有更充分的认识，对其进行了一系列测试和表征：

a.纤维蛋白支架的电镜表征：取适量孵育好的纤维蛋白支架置于4℃体积分数为100%的乙醇中过夜干燥，接着在真空和CO₂条件下进一步干燥。将干燥后的纤维蛋白支架切片或制样后在扫描电镜下观察，结果如图1所示，图中的孔洞用于可细胞的种植和增殖，而图2中显示的支架上的纳米级纤维有利于细胞的粘附与增殖。

b.纤维蛋白支架机械性能的测试：在室温下用MTS电机学测试系统拉住纤维蛋白支架，并对其进行单一轴向张力测试，使样品以5毫米/分钟的速度持续发生拉伸形变，获得弹性模量2.9 MPa和最大拉伸长度数据1.7 MPa。

c.微血管结构的荧光染色和观察：通过对纤维蛋白支架中的人类微血管内皮细胞进行荧光染色来分析其在生物打印的微血管系统中的增殖进度；在室温避光条件下，将荧光染色的微血管结构样品静置30-45分钟，由ImageJ软件将共聚焦显微镜在5微米间隙下所获得的z轴方向的系列荧光图合成为3D影像来展示所打印的血管结构，如图3所示，所构建的血管具有中空结构，并和所打印的图像吻合。

d.微血管系统的完整性检测：用浓度为10微克/毫升的荧光标定葡聚糖粒子对血管进行标记，37℃避光40分钟之后用荧光显微镜观察其血管的完整性，如图4所示，结果表明所打印血管的完整性良好，没有发现渗漏情况。

以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明的保护范围。