一种具有多级孔隙结构的热固性弹性体组织工程支架的制备方法与流程

本发明属于组织工程支架领域，特别涉及一种具有多级孔隙结构的热固性弹性体组织工程支架的制备方法。
背景技术：
：组织、器官的损伤是严重威胁人类健康的重大疾病之一，传统上主要是通过临床器官移植等手段来进行治疗。20世纪80年代生物工程的先驱者yuan-chengfung教授首先开创了组织工程这一术语，其目的是体内或体外生成可替代性的具有三维结构的组织或器官，以修复、再生受损害或失去的人体组织、器官，从而突破现有临床医学手段对受损组织或器官治疗的限制，包括捐赠器官的数量有限、异体排异性反应、潜在病毒的传染、自体“以创伤修复创伤”的二次伤害等。组织工程技术由于能成功的地使受损组织修复再生以达到治疗病患的目的，在过去二十年里得到了更为广泛的关注。组织工程支架能够起到模拟天然细胞外基质的功能，提供适合细胞生长分化的微观环境。理想的组织工程支架应该具备以下几个基本特点：(1)具有合适的物理表面形态和生物化学性质，以促进细胞的增殖和分化；(2)具有开放性、相互连通的微孔结构，以促进细胞营养物质扩散和代谢产物的释放；(3)具有一定的机械强度，以提供组织生长支撑作用；(4)具有良好的生物相容性，保证对细胞无毒副作用和对人体无免疫原性；(5)具有可控的生物降解性，要求降解速率和组织再生的速率相匹配，组织再生的同时生物支架逐渐降解最终被代谢排出体外。然而目前能够真正应用于临床的还非常有限，其中的原因很多，一个重要的因素就是生物材料和人体组织之间的力学性质不匹配，人体的很多组织和器官比如心血管、肺、膀胱等都是具有良好弹性，同时处于持续的力学刺激的环境中。因此具有良好生物相容性和降解性，能在一定程度上模拟上述天然组织的力学性质的生物弹性体应运而生，这些生物弹性体能够将周围的力学刺激传递给新生组织，能够从循环反复的形变中恢复，适用于细胞的动态体外培养和植入到人体动态的力学环境中，植入后不会对周围的组织产生力学损伤。正是由于这诸多特点，生物弹性体已经迅速成为组织工程中一类重要的生物材料，同时在其它相关的生物医学领域也得到了应用。一个理想的生物弹性体要满足诸多的要求，除了具有优良的力学性能，还要求有良好的生物相容性和生物降解性，同时要能够较好地结合生物活性分子，具有良好的加工性。目前满足这些条件的生物弹性体还较少，真正获得应用的更为有限，主要还是以聚乳酸[poly(lacticacid),pla]，聚乙醇酸[poly(glycolicacid),pga]，和聚己内酯[polycaprolactone(pcl)]及其共聚物和衍生物为主。在新发展起来的生物弹性体中，聚癸二酸甘油酯[poly(glycerolsebacate),pgs]是一个突出的代表。pgs生物弹性体于10多年前，由wang等首先报道，是最早被引入组织工程领域的生物弹性体之一，它的出现带动了其它热固性生物弹性体的发展。而pgs本身也由于其诸多优良的特性，例如有良好的体内降解性能，由外到内逐渐侵蚀，缓慢均匀地降解，使材料在较长时间内保持原有的几何形态和力学性能直至被新生组织代替，从而能保证由其制备的组织工程支架等生物医用植入体在整个降解过程中，能保持良好的完整性，持续发挥应有的作用。因此pgs获得持续广泛的研究，并显示出了良好的应用前景。随着pgs研究的深入，人们也认识到其还存在一些缺陷，限制了其进一步应用，其中一个突出的问题是其需要高温高真空的剧烈交联条件，一般只能通过模具法和刻蚀法成型，使其加工方法和应用受到了很大限制。3d打印技术(又称3d快速成型技术或rp)，它是指在计算机控制下，根据患者受损组织或器官的计算机辅助设计(cad)模型或计算机断层扫描(ct)等数据，通过材料的精确3d堆积，快速制造任意复杂立体形状的新型数字化成型技术。技术不仅能实现材料与患者病变部位的完美匹配，而且能在微观结构上精确调控材料的结构。fdm作为3d打印技术中具有代表性的一种，其原理是采用热熔喷头，使得熔融状态的材料按计算机控制的路径挤出、沉积，并凝固成型，经过逐层沉积、凝固，最后除去支撑材料，得到所需的三维产品。该技术特点是成型产品精度高、表面质量好、无环境污染等，但是其缺点是操作温度较高，也因其这样的原理和特点一直以来是作为热塑性材料的加工方法的。总的来说，材料和支架成型方法是组织工程支架制备的两个关键要素，生物弹性体材料的应运而生一定程度上解决了材料上的困境，pgs由于其优良的性能也逐步成为制备组织工程支架的理想材料之一，而fdm技术作为一种热塑性材料的打印技术，长期被用于构建复杂结构的组织工程支架。fdm打印技术因其熔融成型的原理，一直以来都被作为一种热塑性材料加工方式被使用和研究，较难应用于上述热固性弹性体材料。以pgs为例，其中主要的困难下：首先预聚物是热塑性材料可承受塑性加工即具有可打印性，然后需要进一步的高温、真空环境进行交联而固化保型。但在第二个步骤中，由于预聚物本身对热敏感，受热能使其流动性大大增加，在交联固化前发生形变而破坏原有结构，最终无法通过3d打印这种方式加工pgs这种交联的弹性体。由于上述热固性材料性质和fdm热塑性加工原理之间的不兼容性，导致目前未见利用fdm打印热固性生物支架的报道，更未见fdm打印pgs弹性体支架。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种具有多级孔隙结构的热固性弹性体组织工程支架的制备方法，该方法解决了热塑性fdm直接打印热固性材料根本问题，所制备的组织工程支架在结构上具有精确可控的多级孔隙结构，方法简单、快捷、适用于多种生物材料，具有良好的应用前景。本发明的一种具有多级孔隙结构的热固性弹性体组织工程支架的制备方法，包括：(1)将热固性材料与填充材料按质量比1:0.5-3混合，得到混合材料；利用cad软件构建立方体网状结构的模型，然后在3d打印机的加热腔内加入混合材料，通过3d打印得到初始支架；(2)将步骤(1)中的初始支架进行热交联或光交联，得到热固性弹性体组织工程支架；最后去除填充材料，即得具有多级孔隙结构的热固性弹性体组织工程支架；其中，多级孔隙结构包括初级轮廓结构、纤维单元直径和纤维之间的间隙产生的二级大孔结构以及填充材料作为模板去除后产生的三级微孔结构。所述步骤(1)中的热固性材料为pgs、聚氨酯或环氧树脂等。所述步骤(1)中的填充材料为盐颗粒、石墨烯、碳纳米管(或者其他碳材料)、二氧化硅、羟基磷灰石(或者其他无机材料)、尼龙或聚碳酸酯(或者其他其它熔点较高的聚合物)。所述盐颗粒的直径为20～100μm。所述步骤(1)中的混合方式为溶剂混合法或加热法。所述步骤(1)中的3d打印参数为：挤压腔温度与喷嘴温度40～100℃。所述步骤(2)中的热交联参数为：在100℃的真空烘箱中初步交联固化12-24h，然后在120℃-150℃的真空烘箱中进一步固化交联。所述步骤(2)中得到的具有多级孔隙结构的热固性弹性体组织工程支架通过冷冻干燥进行保存。以pgs作为热固性材料、盐颗粒作为填充材料为例说明本发明的原理：用粉碎机打碎盐颗粒，筛网筛选一定尺寸范围内的盐颗粒，将盐颗粒与pgs预聚物按不同的比例混合，通过实际3d熔融打印实验中的可打印性，包括挤出性和初始形态的稳定性，以及后续高温固化过程中的保形性，综合考察选择最合适的混合比例以满足pgs3d打印的各项要求。将混合物装在针筒中3d打印，调节理想的打印参数，要求可连续均匀纤维挤出(良好的挤出性)，打印完成后有良好的初始形态稳定性。对于pgs弹性体组织工程支架，设计了多级别的孔隙结构。通过对3d打印的模型设计，利用3d打印的个性化可定制优势，可方便构建支架初级轮廓结构。通过选择针头尺寸大小以及对打印路径的设计，来调节纤维单元直径的粗细和纤维之间的间隙，从而可以有效的控制支架的二级大孔结构。另一方面，通过调节混合盐粒的用量和尺寸大小，来调剂盐粒作为模板去除后分布在纤维单元内部多孔结构的孔隙率和空隙尺寸，从而可有效控制支架的三级微孔结构。接着，pgs作为一种代表性的热固性生物弹性体，必须经过高温固化交联才能获得稳定三维形态和力学性能。然而，pgs预聚物自身的结晶温度较低，在高温下黏度会降低容易发生形变。因此，盐粒的混入在高温交联的过程中起到了非常重要的物理支撑作用，而pgs预聚物起到了类似于粘合剂的作用。为了使高温条件固化后的形态与打印的pgs预聚物支架保持一致，支架先在较低的温度下进行一定程度的固化，然后在较高温度下进行进一步的固化交联。最后，将交联完成后的支架，多次浸泡在乙醇蒸馏水混合液中除去未聚合的预聚物，盐颗粒等，从而获得具有多级孔隙结构的3d打印pgs弹性体组织工程支架，然后进行冷冻干燥除去支架中的水分，以便于使用和长期保存。有益效果本发明解决了热塑性fdm直接打印热固性材料根本问题，所制备的组织工程支架在结构上具有精确可控的多级孔隙结构，方法简单、快捷、适用于多种生物材料，可根据患者的ct等数据进行个性化定制所需的组织工程支架，可用于制备人耳软骨支架、心肌补片、以及其他组织工程所需的多级孔支架，具有良好的应用前景。附图说明图1为实施例的工艺流程图；图2为不同混合比例支架的sem图；其中，a、d分别为比例1：0.5的样本的截面和表面的50倍电镜图；b、e分别为比例1：1的样本的截面和表面的50倍电镜图；c、f分别为比例1：2的样本的截面和表面的50倍电镜图；图3为pgs500与pgs300的电镜图；图4为支架的固化交联；图5a-d为支架除去盐颗粒前后对比图；图6为支架剪切应力与剪切速率的曲线图；图7为不同混合比例的样条高温保形性对比图；图8为pgs300与pgs500的微孔尺寸和直径尺寸对比；图9a-d为pgs支架的力学性能；图10为pgs支架的生物降解性；图11a-l为pclu弹性体及其支架的微观形态结构；图12a-d为pclu支架的力学性能及红外光谱分析。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11.打印材料准备pgs预聚物(pre-pgs)与盐颗粒的混合参数直接决定了支架打印时的挤出性、初始形态稳定性、高温固化保形性和支架的孔隙结构，从而间接决定了支架的性能，包括力学性能和生物降解性。混合过程所需研究的参数包括混合方式，混合比例以及盐颗粒的直径等。1.1混合方式pre-pgs在常温下为粘稠状且黏度较大，随着混合的盐比例的增大，混合物的黏度也逐渐增大，很容易产生混合不均匀的问题，因此需要考虑降低混合物的黏度。常用的降低黏度的方法有两种：溶剂法和加热法。因此采用两种方法混合材料，通过预挤出实验进行对比分析，选择更适合的方法进行后续实验。1.1.1溶剂混合法1、将pre-pgs与丙酮以质量体积比1:2无加热搅拌均匀，pre-pgs总量为8g，丙酮为16ml，混合之后得到总体积为20ml的粘稠状溶液；2、nacl置于粉碎机中粉碎之后，通过200目和400目的筛网筛得直径在38～75μm之间的盐粒；3、将盐粒与pre-pgs按一定比例混合均匀，装入注射器针筒中:4、静置待丙酮稍挥发之后置于真空烘箱中30℃，24h除去丙酮；5、用针筒尝试性挤出。1.1.2加热法1、将装有pre-pgs的烧杯置于60℃油浴中加热；2、nacl置于粉碎机中粉碎之后，通过200目和400目的筛网筛得直径在38～75μm之间的盐粒；3、将pre-pgs与盐粒按不同比例混合，装入注射器针筒中：4、用针筒尝试性挤出。1.2混合比例用分析天平称量2gpre-pgs置于烧杯中，60℃油浴加热。用粉碎机打磨盐粒，用200目和400目的筛网筛选直径为38μm～75μm的盐颗粒，用分析天平称取2g盐颗粒，待烧杯中的pre-pgs变为透明的液体时加入，用玻璃棒搅拌均匀制备得到pre-pgs：nacl＝1:1的混合物，装入10ml的一次性针筒中，备用。为了找到合适的打印比例，设计一系列比例的混合物进行打印，混合物的比例如表1：表1pre-pgs与盐颗粒的混合比例1:0.51:11:21:3pre-pgs2g2g2g2g盐颗粒1g2g4g6g2.3d打印pre-pgs支架2.13d打印模型利用autocad2014软件构建模型，构建立方体网状结构，边长为20mm，其微观网格间隙可以通过打印的路径和参数进行控制。为体现3d打印个性化可定制的优势，可打印各种复杂的轮廓结构，在其中选取了雪花图形进行打印。2.23d打印参数控制打开3d打印机的电源，在进行3d打印之前，卸下3d打印机的喷嘴与挤压杆，清洗干净，装上喷嘴和针头，将pgs与nacl的混合物料装进料筒中，然后装回挤压杆。打开1号头的加热装置，设置挤压腔温度与喷嘴温度，双击电脑上的3d打印机软件，使电脑与3d打印机相连接，选择3d打印所需的cad模型。然后进行参数设置，设置挤压腔温度与喷嘴温度分别都为40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃时材料挤出状态的变化。选择20g针头，层高为0.5，网格填充宽度为1.2mm，x位置为90，y位置为90，轮廓填充次数为0，角度为90°和0°。点击xy轴速度填写相应的xy轴运动速度和t轴挤料速度，其中xy轴运动速度为2mm/s，t轴挤料速度为0.006mm/s，保存数据点击“确定”并填充路径。将x,y位置都调到90，调整z轴来调节针头离接收板的高度，然后将打印机的xy轴位置回零，等到温度上升到指定值并稳定之后，即可按auto开始打印。2.3针头尺寸挤出针头的型号直接决定了挤出纤维单元的直径尺寸和支架的精细度，为了提高打印的精细度，使用了内径更小的针头(22g)，来降低纤维单元直径的大小和纤维单元之间的间隙宽度。但是盐粒尺寸与针头大小的匹配性直接决定了打印材料的挤出性能，在盐粒填充物用量不变的前提下，为了使材料更容易挤出，选用了粒径更小的盐粒。选用两种不同直径的盐粒进行对比试验，盐颗粒直径为38～75μm和26～38μm和分别用20g和22g针头进行打印。其中以20g针头和直径为38～75μm盐粒作为填充物所打印的支架为pgs500；其中以22g针头和直径为26～38μm盐粒作为填充物所打印的支架为pgs300。两种针头参数对比见表2：表221g与22g针头参数对比2.4支架的固化交联和析出由于支架原材料为pre-pgs和盐颗粒，还需进行第二步的高温交联才能成为pgs支架。虽然盐颗粒在打印过程中作为定型剂保持了支架的三维结构，但是随着温度的升高，pre-pgs黏度逐步下降，支架的结构不可避免会受到破坏。因此要选择一个合适的较低温度，在此温度下，支架既能在一定时间内保持其结构，pre-pgs还能开始发生交联。在pre-pgs发生一定程度的交联之后，确保其在高温下仍具有保型性之后，再高温快速固化交联。根据参考文献的查阅和pgs聚合和固化交联的条件，将低温保型温度设置为100℃，支架在100℃的真空烘箱中初步交联固化12h，然后转移到150℃的真空烘箱中进行进一步的固化交联。为除去支架中的盐颗粒和未交联的聚合物，在室温条件下将支架浸渍在无水乙醇与蒸馏水按1:3比例混合的溶液中，每4小时换一次混合液，洗涤3次，冷冻12小时后，置于-20℃，50pa的冷冻干燥机中冷冻干燥得到pgs弹性体支架。3.表征与检测3.1可打印性的表征采用控制应力流变仪测定不同比例的混合物的流变性能，设计模块分为两个部分：第一为保温阶段，保温温度为45℃，转速为0，保温时间为300s；第二阶段为转速增加阶段，温度为45℃，转速从0增加到100rpm，时间为600s。设计每个样品测试三组数据，用origin软件绘制四个比例样品的剪切应力-剪切速率曲线图。3.2高温保形性的测定配制pgs和nacl比例分别为1:0.5,1:1,1:2,1:3的混合物，取长1cm，直径为0.5cm的柱状模型，用刮刀将混合物填充入模具中，压实，每个比例的材料制备两个样条，置于-20℃的冰箱中冷冻30min，用棒子推出得到柱状样条。置于100℃的真空烘箱中保温10min，观察其形状变化，从而帮助选择合适的混合比例。3.3形态结构的表征与测试对支架结构的表征通过sem来检测，观察支架的形态，是否发生变形，坍塌以及粗细是否均匀等等从而选择合适的混合比例和固化温度，定性表征支架的孔隙分布和整体结构。并且采用imagej软件对支架的sem图形进行统计，每项测量30～40个数据求平均值和方差，结合origin软件绘制柱状图定量分析支架的纤维单元直径和孔隙尺寸。3.4孔隙率本实验采用乙醇密度法测量孔隙率。支架经冷冻干燥后于干燥器中恒重24h，分析天平称量其质量m0。将支架放入离心管中，完全浸没在无水乙醇中12h，测量离心管、乙醇与支架的总质量为m1。用镊子小心地将支架从瓶中取出，取出的支架吸满乙醇液体又不滴落为准，支架放置在干净的培养皿上。用天平称量剩余乙醇和离心管的总质量为m2。pgs密度ρpgs，20℃下无水乙醇密度ρ乙醇。支架的孔隙率计算公式如下：3.5力学性能测试与表征将四层支架裁成10*5mm的长方形样条，测试其拉伸断裂强度和拉伸断裂伸长率然后在稍低于拉伸断裂伸长率的条件下，进行循环拉伸测试，测试循环次数10次。用16层的支架进行循环压缩测试，形变程度为40％，分别测试循环次数为1次，10次，30次，50次。3.6生物降解性将上述pgs支架裁成5mm*5mm的样品，称量初始质量。将支架分别放入装有5ml酯酶溶液的离心管中，置于37℃恒温孵育箱内。分别在10min，30min，1h，2h，3h，5h，7h时将样本取出，使用蒸馏水润洗后冷冻干燥至恒重，称量样本降解后的质量。并将样本利用sem观测降解后的支架形态。4.结果2.1.1材料的混合方式pre-pgs在常温下为粘稠状且黏度较大，随着混合的盐比例的增大，混合物的黏度也逐渐增大，很容易产生混合不均匀的问题，因此需要考虑降低混合物的黏度。常用的降低黏度的方法有两种：溶剂法和加热法，采用这两种方法进行对比性。实验表明：采用溶剂法混合，从真空烘箱中取出溶液时，虽然丙酮基本上除去，没有很大的刺鼻性气味，但是经过12h静置发现盐粒大多数沉积在底部，与pre-pgs混合不均匀，挤出性能较差。另外还有两个缺陷是：一、无法保证丙酮完全除去；二、实验操作过程中丙酮在不断挥发，pre-pgs丙酮混合液的体积在不断变化，无法保证pre-pgs与nacl颗粒的真正比例。采用加热法混合的材料比较均匀，挤出性比较稳定，同时不添加其他的有机溶剂，保证了材料的生物相容性。因此采用加热法进行后续实验。2.1.2材料的混合比例盐颗粒在混合物中起到定型剂和致孔剂的作用，因此盐粒过少，无法起到定型作用，打印的结构容易发生坍塌；盐粒过多，黏度过高，可能会导致打印困难，甚至无法打印。因此，需要探索一个合适的混合比例既能持续完整地打印，又能保持打印支架的结构，在满足这两个条件的基础上，结合sem电镜的观测，分析支架的整体结构与微观结构，选择pre-pgs与盐颗粒的最合适比例。从sem图中，可以看出比例为1:0.5样本在打印温度为35℃可较为容易的被加热挤出，但由于加热温度与室温接近，使得冷却后流动性变化小，成型后易变形，支架中的纤维单元纵横分布不清，不同层之间彼此粘连到一起。比例为1:1样本，温度在45～50℃可被挤出，纤维整体分布清晰，但单根纤维在无支撑的区域出现一定向下塌陷的现象，受重力作用影响较大。比例为1:2样本，在温度为55℃时可顺利被挤出，室温冷却后成型稳定，且纤维单元分布清晰，在重力作用下基本不发生形变，纤维截面成光滑的圆形，保型性好。比例为1:3样本，加热挤出温度上升至90℃，但存在了挤出不畅的缺陷，纤维被断续式挤出，这可能是含盐量增加导致受热流动性差所引起的。2.1.33d打印参数2.1.3.1打印温度从打印过程来看，随着打印温度的升高，材料的流动性越来越好，与此同时打印的支架的保型性越来越差，因此要选择一个合适的温度，即在此温度下，材料既能稳定连续地挤出成均匀的纤维状，又能在接收板上固定下来并且保持打印时的形状而不发生变形。从实验结果来看，40～50℃时，材料的流动性能很差，纤维挤出不连续，同时由于温度较低，针头部分没有加热，材料容易堵塞在针头。60～65℃时，材料的流动性能太好，以至于打印过程中会因为压力的一些细微变化或者气泡的破裂等而造成纤维直径突然变大或纤维断裂，同时纤维到达接收板之后温度没有及时降低，流动性能较好，受重力影响而使纤维坍塌，整个支架结构发生变形。在55℃左右时，流动性能较为合适，既能连续地挤出，同时稳定达到接收板之后，温度下降流动性能降低，能较稳定地维持其纤维形状与支架结构。因此采用55℃为基准温度，随着打印的过程材料状态的变化而进行不停的微调，因为在打印过程中，材料在挤压腔中受到长时间的挤压和加热，状态都会发生一定程度的变化。打印过程中还需主要的一个问题是材料中容易产生气泡，造成纤维的突然断裂，因此在开始打印之前，需要进行预加压，使材料在挤压腔内稳定一段时间再开始打印。2.1.3.23d打印软件参数喷头挤出的焦糖纤维直径除了与针头的尺寸有关，还与两个因素有关，一是原料挤出速率，二是喷头移动速率。挤出速率恒定情况下，喷头移动速率越大，纤维直径越小；喷头移动速率恒定情况下，挤料速率越大，纤维直径越大。因此要固定原料的基础速率，改变喷头的移动速率探索两者比较合适的比例，从实验结果来看，当t轴挤料速度为0.006mm/s时，喷头移动速率为2mm/时，纤维的直径与针头尺寸较为匹配，这说明t轴挤料速率与喷头移动速率理想之比约为0.003：1，在此基础上可以改变这两者的大小改变打印速度。但这两者的值不能一直增大，因为一旦喷头移动速率过大，纤维很难很好地和接收板贴合，同时纤维转折时由于速度过快容易发生卷翘，支架结构变形。层高与针头尺寸相关，20g针头的内径为0.61，但打印过程中会对纤维产生一定程度的拉伸，而且会受到重力的影响，因此选择0.5mm作为层高。此外，打印开始时一般设置针头离接收板的高度比层高稍小一些，以便材料能稳定黏贴在接收板上。2.1.4针头尺寸在本实验中，nacl颗粒不仅可作为固化时的力学支撑相，还可以作为致孔剂，通过水溶去除后形成微孔结构。为了进一步控制纤维的微观结构和精细化铸造结构，对盐粒尺寸和挤出喷嘴尺寸进行了调节与匹配。a,b分别为pgs500的50倍电镜图和1000倍电镜图；c,d分别为pgs300的50倍电镜图和1000倍电镜图原先采用20g的针头，相对应的采用的是粒径在38μm～75μm的nacl颗粒制得的纤维直径约为500μm左右(pgs500)，纤维内部和表面均匀的分布了大量的微孔结构，孔径大小与颗粒粒径相匹配。而采用22g针头打印挤出时，考虑颗粒在喷头处的挤出顺畅性，选择了粒径在26～38μm的nacl颗粒(≤38μm)，获得了纤维单元直径为300μm左右的支架(pgs300)，同样纤维中也均匀分布有大量的微孔，形成多级孔隙结构。但是，相较而言22g针头制得的pgs支架，纤维直径更小以致纤维排列更加紧密，精细度更高，同时盐颗粒较小使得微孔尺寸更小，整个支架比表面积更大，更有利于作为组织工程支架来使用。2.1.5支架的固化交联图4左边为未固化的支架，右边为固化之后的支架，可以明显看出固化前后支架的整体形状没有发生明显的变化，并且原来的缺陷在固化之后仍然存在，再次说明支架没有发生较大程度的变形。说明设计的100℃低温初步交联，150℃高温进一步交联的实验方案有效地解决热塑性3d打印技术打印热固性的pgs的难题。2.1.6支架的析出从图5a,c来看，支架不仅有网格之间的大孔隙，通过盐颗粒的除去在支架的表面就内部都产生大量的孔隙，从而组成支架的多级孔隙，有利于细胞的繁殖与生长。而通过b,d，可以定量分析得到微孔的尺寸与盐颗粒的尺寸相匹配，从而证明可以通过混入盐颗粒的直径尺寸控制支架微孔的尺寸，这有利于支架在组织工程上面向具体临床的应用。2.2支架结构的表征与检测2.2.1可打印性的表征可打印性包括可挤出性和初始形态的稳定性。左图是根据控制应力流变仪测试得到的数据绘制剪切应力与剪切速率的曲线图，图中各个曲线的斜率代表着各个比例的样品在此剪切速率下的黏度，因此从整条曲线和指定的一个剪切速率来看，都可以得到相同的结论：随着混合物中盐颗粒的比例的增加，材料的黏度在不断的增加。而在3d熔融型挤出实验中，随着盐颗粒地比例的增大，同样温度下，混合物的可挤出性越来越差，而初始形态的稳定性越来越好，这个现象就能用上述的黏度来解释。综合来看，前三个比例的样品都通过打印温度的调节来获得合适的可打印性，但pre-pgs与nacl比例为1：3的样品即使在90℃下也难以具有很好的可挤出性。因此从可打印性上来看，1:3比例的混合物不适合3d熔融挤出打印制备pgs弹性体支架。2.2.2高温保形性的测定从图7可以看出随着混合物中nacl颗粒的含量增加，支架的高温保形性逐渐变好，纯pre-pgs，pre-pgs与nacl比例为1：0.5和1:1这三个比例的样品在100℃低温交联的条件下仍然难以保持其形状，而pre-pgs与nacl比例为1:2和1:3这两个比例的样品则能在一定程度上保持其形状。因此从高温保形性上来看，1:2和1:3这两个比例比较适合，再结合可打印性，1:2这一比例是最理想的。2.2.3直径及孔隙尺寸统计从图8可以定量地看出pgs300与pgs500的直径尺寸存在显著差异，纤维内部和表面的微孔尺寸与所混入的盐颗粒的尺寸相匹配。纤维截面的微孔尺寸明显比纤维表面的大，这是因为纤维表面只能看到微孔的一部分以及表面的盐粒通常被pgs所覆盖，导致盐粒析出之后孔隙的直径较小或者孔隙不明显。2.2.4支架孔隙率的检测三维支架的结构对其在组织工程上的应用有至关重要的作用，如果支架具有较高的孔隙率和良好的贯通性，那么将有利于细胞的吸附与增殖、营养物质和代谢废物的运输。本实验设计的pgs弹性体支架，通过对3d打印的模型设计产生的初级轮廓结构、纤维单元直径和纤维之间的间隙产生的二级大孔结构以及盐粒作为模板去除后产生的三级微孔结构一起组成支架的多级孔隙，作为细胞生长所需营养物质和代谢废物输送的通道。因此pgs弹性体支架的孔隙率是至关重要的一个参数。本测试利用实验部分所示公式测定3d打印的pgs弹性体支架的孔隙率。如表3所示，本方法制备的三维中空支架的孔隙率均在66％以上，平均孔隙率为72.96％。表3支架的孔隙率测定m0m1m2孔隙率0.05791.81091.56320.73540.02591.90621.78060.76550.03102.03331.87010.78340.04771.78941.63100.66300.06111.82611.54970.74920.05931.55161.34310.68092.2.5力学性能测试及表征从力学性能测试结果图9(a)可看出，pgs500支架的拉伸断裂伸长率在35％左右，断裂强度为80kpa左右，pgs300支架的拉伸断裂伸长率在40％左右，断裂强度为60kpa左右。伸长率为25％的条件下循环拉伸10次，展示出典型的弹性形变曲线和具有良好的形变恢复性(c，d)，具备一定的体内缝合强度与体内动态力学环境的顺应性。通过循环压缩测试可看出这种3d打印的弹性体支架具有较强的耐疲劳性，多次形变恢复的曲线基本重合，仍保持初始良好的弹性(b)，具备在体内受到应力压缩而能够及时恢复，可与组织保持良好的匹配性。对pgs500和pgs300的循环压缩曲线分析可知，pgs300的压缩强度比pgs500稍大，这与pgs300的纤维单元排列更加质密有关。这两种支架在形变程度50％以内都保持的是弹性形变，即压缩曲线与释放恢复曲线重合，但在超过50％之后，曲线不发生重合，恢复过程的力学曲线要高于压缩过程，呈现出“力学增强”的现象(b)。对于这种现象，可能是压缩形变程度过大时(大于50％)时，整体变得扁平化，受力面积增大所致。2.2.6生物降解性从图10降解曲线可以看出3d打印的pgs支架具有良好的生物降解性，初期降解较快，后续降解基本平衡，5小时后降解率可达90％以上。从降解后样本的电镜图可以看出，支架的降解是从表面向内部逐步发生刻蚀化降解，表面的微孔结构尺寸逐步变大。实施例2制备pclu支架，方法同实施例1。使用聚己内酯二醇、hdi三聚体为原料，与盐颗粒混合打印后固化成型，省去预聚物合成步骤，让原料单元在3d成型的结构上在加热条件下反应固化。如图11所示，这种方法也可满足于pclu的打印成型，可制备生物支架和其他不规则形状，这种热固性的pclu也是一种弹性体，经过反复的折叠仍可快速的恢复(a-d)。对支架进行电镜测试，其纤维单元清晰规则排列和堆叠，纤维截面呈圆形，未见明显的纤维塌陷现象，具有良好的固化保型性，同时纤维表面和内部分布有大量的微孔，支架整体呈多级别的孔隙结构(e-l)。对pclu支架的力学测试结果如图12所示：其拉伸断裂强度为386kpa左右，断裂伸长率为80％，优于pgs支架。在10个周期循环拉伸测试和50个周期的循环压缩测试中加载和释放的曲线拟合程度高，展现出了优异的弹性和形变恢复性；同时多次循环之后力学特征曲线基本不发生变化，具有很好的耐疲劳性。对于这种pclu弹性体，由于原料采用的是聚己内酯二元醇这种可降解单元，预期其具备生物降解性。另外，对于原料中具有的潜在生物毒性的nco基团，通过红外光谱测定分析后可判断已经反应完全而不存在，类似于其他医用聚氨酯材料而具备良好的生物相容性。当前第1页12