天然来源的蛋白质及由其制备的材料的制作方法

专利名称：天然来源的蛋白质及由其制备的材料的制作方法
天然来源的蛋白质及由其制备的材料本发明涉及天然来源的蛋白质及由其制备的材料，特别是来自其的 线、纤维、泡沫和凝胶。本发明还提供这些蛋白质/线和材料用在生物技术 和/或药物领域中，特别是用在制备伤口闭合或覆盖系统，缝线材料和在制 备替代材料，优选地人工软骨或腱材料，以及在其它商业应用中的应用。蜘蛛拖丝(Spider dragline)的丝具有由其作为半晶体聚合物(2)的组成 引起的特别的性质(l)，所述聚合物包含被包埋在无定形基质中的晶体区 域。X射线衍射和NMR显示晶体区域由赋予了线以强度的聚丙氨酸序列 的e折叠片组成(3，4)，同时无定形基质的主要二级结构是提供弹性的富含 甘氨酸的3,螺旋(5)。新鲜分泌的丝蛋白作为液体晶体粘稠物(7， 8)以高浓 度贮存(6)，其在它通过吐丝导管的过程中，通过离子组成，pH(从pH6.9 至'J6.3)的改变(9，10)和水提取(IO，U)而变化从而最终通过外延流动(12) 转化为固体的线。至今研究的所有的拖丝的丝由至少两种不同的蛋白质组成，所述蛋白 质具有多到数百kDa的分子量(13)。十字园蛛(」ra^w力'^fewa&力的两种 主要的拖丝的丝蛋白，ADF-3和ADF-4对拖丝线装配和结构的分别的作 用迄今尚未得到确定。分析一级结构揭示ADF-3和ADF-4(14,15)具有类似 的脯氨酸含量和聚丙氨酸基序，但是它们在谷氨酰胺和丝氨酸含量上以及 在富含甘氨酸的区域的长度上有所不同。重要的是，丝线的性质不能从基 础的蛋白质序列推导出来。尽管丝线的质量基于涉及的蛋白质的一级结 构，其还取决于丝装配的过程(8)，这使对结构和装配性质的实验分析成为 必要。科学和商业利益促进了蜘蛛丝的工业规模生产的研究。由于蜘蛛的同 种相残，天然的蜘蛛丝生产是不切实际的，而人工生产在获得足够的蛋白 质产量和出众的线-装配中遇到问题。细菌的表达产生低蛋白水平(16)，这 可能是由于细菌和蜘蛛的不同的密码子选择导致的。具有适应于表达宿主 的密码子选择的合成基因导致更高的产量(13，17)，但是其合成的蛋白质显示与天然蜘蛛丝不同的性质。部分拖丝的丝cDNAs在哺乳动物细胞系中 的表达确实产生了丝蛋白(例如ADF-3)，其可以以人工方式纺(spin)为"丝 样"的线，尽管在品质上仍旧很差(18)。WO03060099涉及将生物丝蛋白旋转为纤维的方法和装置。本发明特 别用于从水溶液中旋转重组的丝蛋白，并增加纤维的强度和制品的实用性 从而使这些纤维的商业生产和应用是可实践的。其中，公开了在哺乳动物 细胞，例如转基因的山羊乳腺细胞中表达蜘蛛丝蛋白。因此，本发明的目标是提供改善的原材料，即蛋白质，用于以高产率 和优越的品质制备蜘蛛丝线，纤维和其它材料。另外的目标是提供新的蛋 白质/线和基于蜘蛛丝蛋白的另外的材料和/或其它天然衍生的材料用于生 物技术，药物和其它的商业目的。这些目的通过独立权利要求的主题而得以解决。优选的实施方案在从 属权利要求中提出。关于涉及蜘蛛丝蛋白和由其衍生的线的生产的现有技术方法的缺陷， 可以使用合成真正的蜘蛛丝蛋白的不同的更有效的路径。显示特别的强度和韧性的蜘蛛拖丝的丝主要有两种相关蛋白组成，其 在线装配中的作用和对于拖丝的线的机械性质的作用大部分还是未知的。为了阐明该作用，本发明人使用杆状病毒表达系统来在宿主昆虫细胞 中产生重组的ADF-3和ADF-4，花园蜘蛛十字园蛛的两种主要的拖丝的 丝蛋白。据显示ADF-4，而不是ADF-3容易地在细胞的胞质中自我装配 为丝。这些ADF-4的丝显示特别的化学稳定性，其对于真正的蜘蛛拖丝的 丝线是典型的。结果，ADF-4的性质显示其在拖丝的丝中作为结构关键参 与者的作用。迄今，关于蜘蛛拖丝丝线的两种主要的蛋白质组分之间的结构，功能 和可能的相互影响知道的很少。本发明人观察到尽管它们在一级结构上的 相似性，ADF-3和ADF-4显示令人惊讶的不同的性质。同时ADF-3在其 本质上是可溶的蛋白，ADF-4在所用的实验条件下实际上是不可溶的，并 在s/9细胞的细胞质中形成丝状团聚体，其具有可与天然拖丝的线比较的 化学稳定性。在ADF-4丝和天然拖丝的丝线之间的相似性显示ADF-4是
在拖丝的线中提供其化学和物理强度的结构"关键参与者"。由于线形成必须快到l-10cm/s的自然巻绕速度(19)，容易装配的化合物，诸如ADF-4 对于丝形成是必需的。然而，ADF-4聚合的倾向显示可能在旋转粘稠物中 需要其它因素来避免腺体中的过早聚合。这些因素可能是翻译后修饰诸如 磷酸化作用和糖基化作用。另外，ADF-4的溶解性可以被共分泌并且也储 存在粘稠物的蛋白质所影响。尽管ADF-3在昆虫细胞的胞质中不影响 ADF-4的溶解性，其仍旧可以在蜘蛛腺体分泌的过程或其后在调节ADF-4 的溶解性中起重要作用。在蜘蛛腺体细胞以及在腺体内腔中的分泌途径中 存在的特定条件可导致在ADF-3和ADF-4之间的相互作用，其调节丝线 装配。蜘蛛丝可以被视为未来聚合物设计的基准点，这不仅是由于它们优越 的品质，还因为它们可以以经济的并且以与环境相容的方式在环境温度和 环境压力下从水性溶剂中产生而被优选。然而，主要的障碍存在于我们与 天然丝纤维生产过程匹配的能力。本文提供的结果构成阐明蜘蛛丝拖丝蛋白例如园蛛拖丝的丝的两种主要的成分，ADF-3和ADF-4的功能和相互 作用的必要基础。这些知识对于从重组蛋白质中旋转丝线和生产新一代的 纤维材料是必要的。在本发明的背景中，可以使用产生来自主要的壶腹状腺体的蜘蛛丝拖 丝蛋白的方法，这包括下列步骤a) 提供编码一种或多种蜘蛛拖丝蛋白的核酸序列，b) 将在a)中提供的核酸序列引入昆虫细胞中，c) 表达所述拖丝蛋白；和d) 回收所述拖丝蛋白。因此，如上提及，由该方法提供的一个主要的优势存在于提供用于蜘 蛛丝拖丝蛋白的表达系统，即在昆虫细胞中的表达。如上所释，令人惊奇 地证实，那些蛋白在昆虫细胞中的表达比在其它细胞，如，例如细菌细胞 和哺乳动物细胞中的表达优越。这种改善等价地影响品质，即机械性质等， 以及蜘蛛丝拖丝蛋白的产率。作为实例，按照参考文献16的方法，获得4mg/l的细胞，其不能旋 转成线，，在参考文献18中，获得25 mg/l的细胞(获得线，但是具有非常 差的品质)。通过本发明的方法，可以获得〉30mg/l的细胞(自我装配，稳定 的线)。优选地，由在上述方法的步骤a)中提供的核酸序列编码的拖丝蛋白优 选地选自球-网蜘蛛(园蛛科(Araneidae))的拖丝蛋白。这样的拖丝蛋白可以来自下列蜘蛛的一种或多种希氏尾园蛛 (Arachnura higginsi)， Araneus circulissparsus，十字园蛛，Argiope picta，条 带园蛛(Banded Garden Spider)(三带蜘蛛(Argiope trifasciata))，(BatikSpider) (Batik Golden Web Spider )(Nephila antipodiana)， Beccari's Tent Spider (Cyrtophora beccarii), 鸟类蛛 (Bird-dropping Spider)(Celaenia excavata),黑白棘蛛(Black-and-White Spiny Spider)(库氏 棘腹蛛(Gasteracantha kuhlii))，黑白园蛛(Black-and-yellow Garden Spider )(Argiope aurantia),流星锤蛛(Bolas Spider) (Ordgarius ftircatus)，流 星锤蛛-巨蜘蛛(Bolas Spider -Magnificent Spider) (Ordgarius magnificus),棕 色水手蛛(Brown Sailor Spider )(嗜水新园蛛(Neoscona nautica))，棕腿蛛 (Brown-Legged Spider )(Neoscona rufofemorata); Capped Black-Headed Spider (帆楚蛛(Zygiella calyptrata)),普通园蛛(Common Garden Spider) (Parawixia dehaani)， 普通园蛛(Common Orb Weaver ) (Neoscona oxancensis), 蟹样棘园蛛(Crab-like Spiny Orb Weaver) (Gasteracantha cancriformis (elipsoides)), Curved Spiny Spider (Gasteracantha arcuata),皿云 斑蛛(Cyrtophora moluccensis)， Cyrtophora pamasia， Dolophones conifera, Dolophones turrigera， Doria's Spiny Spider (Gasteracantha doriae),双点棘蛛 (Double-Spotted Spiny Spider) (Gasteracantha mammosa), Double-Tailed Tent Spider (方格云斑蛛(Cyrtophora exanthematiea))，塞若尖腹蛛 (Aculeperia ceropegia) ， Eriophom pustulosa, Flat Anepsion (Anepsion depressium), Four-spined Jewel Spider (Gasteracantha quadrispinosa)， 园网 蛛(Garden Orb Web Spider )(Eriophora transmarina)， Giant Lichen Orbweaver (Araneus bicentenarius),金色网蛛(Golden Web Spider )(Nephila maculata)， Hasselt's棘蛛(Hasselt's Spiny Spider) (Gasteracantha hasseltii)， Tegenaria atrica， Heurodes turrita, Island Cyclosa Spider (岛艾蛛(Cyclosa insulana)), Jewel or Spiny Spider (Astracantha minax)， 肾形园妹(Kidney
Garden Spider)(卵园蛛(Araneus mitificus))， Laglaise's 园蛛(Laglaise's Garden Spider) (Eriovixia laglaisei), Long-Bellied Cyclosa Spider (Cyclosa bifida), Malabar Spider (Nephilengys malabarensis)， Multi-Coloured St Andrew's Cross Spider (多色金蛛(Argiope versicolor)),观赏性树干蛛 (Ornamental Tree-Trunk Spider )(裂腹虫朱(Herennia omatissima))， Oval St. Andrew's Cross Spider (好胜金蛛(Argiope aemula))， Red Tent Spider (单色云 斑蛛(Cyrtophora unicolor))， Russian Tent Spicier (Cyrtophora hirta)， Saint' Andrew's Cross Spider (凯氏金蛛(Argiope keyserlingi))，猩红阿秋蛛(猩红 阿秋蛛(Acusilas coccineus)), 银色金蛛 (Argiope argentata)， Spinybacked Orbweaver (Gasteracantha cancriformis),斑点园蛛(Spotted Orbweaver) (Neoscona domiciliorum)， St. Andrews Cross (Argiope aetheria), St. Andrew's Cross Spider (Argiope Keyserlingi)， Tree-Stump Spider (无鳞波蛛(Poltys illepidus))， Triangular Spider (Arkys clavatus)， Triangular Spider (Arkys lancearius) ， Two-spined Spider (Poecilopachys australasia),络新妇蛛属(Nephila)物种，例如Nephila clavipes, Nephila senegalensis， Nephila madagascariensis和更多(对于另夕卜的蜘蛛物禾中，还见 下)。十字园蛛是最优选的。优选地，通过该方法生产的拖丝蛋白质是拖丝蛋白质野生型ADF-3, ADF-4, MaSp I，禾口/或MaSp II。术语ADF-3/-4用在由十字园蛛产生的 MaSp蛋白质的背景下(十字园蛛丝心蛋白-3/-4)。两种蛋白质ADF-3和~4 属于MaSp II蛋白质类(主要的壶腹状spidroin 11)。可以通过此(即，单独的或组合以其它蛋白质)生产的另外的蜘蛛丝 蛋白和它们的数据库登记号是spidroin 2 [Araneus bicentenarius]gi|2911272主要的壶腹状腺体拖丝丝蛋白质-1 [大腹园蛛(Araneus ventricosus)] gi|27228957主要的壶腹状腺体拖丝丝蛋白质-2 [大腹园蛛]gi |27228959 壶腹状spidroin 1 [Nephila madagascariensis]gi 113562006 主要的壶腹状spidroin 1 [Nephila senegalensis]gi卩3562010
主要的壶腹状spidroin 1 [Latrodectus geometricus]gi| 13561998 主要的壶腹状spidroin 1 [三带金蛛]gil13561984 主要的壶腹状spidroin 1 [Argiope aurantia〗gi| 13561976 拖丝丝蛋白spidroin 2 [棒络新妇蛛(Nephila clavata)]gij 16974791 主要的壶腹状spidroin 2 [Nephila senegalensis]gi| 13562012 主要的壶腹状spidroin 2 [Nephila madagascariensis]gi| 13562008 主要的壶腹状spidroin 2 [Latrodectus geometricus]gi| 13562002本发明特别涉及下面的方面和实施方案按照第一个方面，本发明涉及蜘蛛拖丝蛋白质，其由SEQ ID NO: 1 或2的核酸序列，或那些核酸序列的变体编码，所述变体每个被限定为与 SEQ ID NO: 1或2的序列比较，具有一个或多个取代，插入和/或缺失， 在所述变体在适度严格条件下与包含SEQ ID NO: 1或2的序列的核酸杂 交的条件下，或在所述变体包含由于遗传密码子的简并性所造成的核酸变 化的条件下，其编码与SEQ ID NO: 1或2的核酸序列相同或功能上等价 的氨基酸。
术语"核酸序列"指这些核苷酸的杂聚物或这些核苷酸的序列。术语 "核酸"和"多核苷酸"在本文交互地使用来指核苷酸的杂聚物。
杂交的严格性，用于本文时，指这样的条件下，在所述条件下，所述 多核苷酸双链体是稳定的。如本领域那些技术人员已知的，双链体的稳定 性是钠离子浓度和温度的函数(见，例如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory,(1989))。用于杂 交的严格性水平可以容易地由本领域那些技术人员来改变。
用于本文时，短语"适度严格条件"指这样的条件，其容许DNA结 合于互补核酸，所述互补核酸与所述DNA具有约60%的同一性，优选地 约75%的同一性，更优选地约85%的同一性；其中与所述DNA大于约90% 的同一性是尤其优选的。优选地，适度严格条件是这样的条件，其等价于 在50%甲酰胺，5 xDenhart's溶液，5 x SSPE， 0.2% SDS中于42。C进行 杂交，随后在0.2 x SSPE, 0.2% SDS，于65'C进行洗涤。
注意到，本发明意欲两种不同种类的ADF-3和ADF-4编码序列:第一，ADF-3和ADF-4已经公开的序列(本文"野生型"序列)和第二，其变体， 由SEQIDNO: 1 (ADF-3)和2 (ADF-4)编码。野生型序列已经公开并且可 以在登记号U47855和U47856(SEQ ID NO: 3和4)下获得。二如上解释，丝纤维具有P-折叠的晶体区域，其间散布类似于液体晶 体聚合物的弹性无定形片段。这两种片段由两种不同的蛋白质，由不同的 基因编码的MaSp I (主要的壶腹状spidroin I)和MaSp II (主要的壶腹状 spidroin II)代表。本发明的核酸序列优选地是ADF-3, ADF-4(SEQ ID NO: 1和2)或其变 体。SEQ ID NO: 3和4显示野生型序列的相应的氨基酸序列。按照优选实施方案，本发明的方法提供由聚合物组成的蜘蛛丝蛋白， 其构件被限定为一个或多个如上定义的蛋白质或所述蛋白质的变体。本发 明的蛋白质的氨基酸序列还涵盖通过氨基酸插入、缺失和置换而与本文公 开的序列不同的所有的序列。优选地，氨基酸"置换"是一种氨基酸被具有类似结构和/或化学性质 的另一种氨基酸取代，即保守性氨基酸取代的结果。氨基酸置换可以在涉 及的残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的类似 性基础上进行。例如，非极性(疏水)氨基酸包括，丙氨酸，亮氨酸，异亮 氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸 包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺； 带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸；带负电荷(酸性) 氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。"插入"或"缺失"典型地在约1-5个氨基酸，优选地约1， 2或3 个氨基酸范围内。氨基酸添加典型地不超过100，优选地不超过80，更优 选地不超过50，最优选的不超过20个氨基酸，其添加在本发明的蛋白质 上和/或插入其中。注意到本发明仅意欲那些的添加，其不会对本文公开的 蛋白质的机械和其它的性质具有不利影响。可以使用重组DNA技术并分析得到的重组变体的活性，通过在蛋白 质中系统性进行氨基酸的插入，缺失或置换来对容许的改变进行实验性确 定。这不需要本领域技术人员进行超出常规的实验。按照优选的实施方案，将上述限定的一个或多个核酸序列包含在载体
中。优选地，该载体是表达载体，其包含编码上述定义的一个或多个拖丝 蛋白的核酸序列和一个或多个调节序列。这些调节序列可以优选地包括启 动子p10和/或多角体蛋白，但是也可以使用其它的晚期和极晚期的杆状病 毒启动子。
所述载体更优选地是病毒载体，最优选地是杆状病毒载体系统或痘苗 病毒载体系统。还可以在本发明中使用另外的病毒载体系统。根据不同的 情况，可能需要对载体进行修饰。另外的病毒载体的实例是腺病毒和所有
的负链RNA-病毒，例如狂犬病毒，麻瘆病毒，RSV，等。
作为昆虫细胞，可以优选地使用鳞翅目昆虫细胞，更优选地来自
Spod叩tera frugiperda和来自粉夜蛾(Trichoplusia ni)的细胞。最优选地，所 述昆虫细胞是Sf9， Sf21或高效(highfive)细胞。
昆虫细胞表达系统，例如相对于细菌系统的一个优势在于这样的事 实，即产生的蛋白质被糖基化，由此作为微生物降解的靶标。这种性质例 如在药物领域，只要丝蛋白质倾向于其中需要生物降解的体内应用，可能 是是重要的。该性质可以特别应用在缝线材料和伤口闭合和覆盖系统中。
按照另一个优选实施方案，表达的拖丝蛋白仅是由野生型ADF-4或 由SEQ ID NO: 2编码的ADF-4。
作为备选，表达的拖丝蛋白仅是野生型ADF-3或作为拖丝蛋白的由 SEQIDNO: 1的核酸编码的氨基酸。
本发明人令人惊奇地发现，与现有技术的概念相反，两种已知的主要 的拖丝蛋白中只有一种(优选地ADF-4)是生产和装配拖丝丝线所需要的。 因此，制备拖丝的丝的已知方法可以通过使用仅一种成分来制备拖丝的丝 取代用两种成分来制备拖丝的丝，来将拖丝的丝的制备大大简化，如本领 域已知的。因此，仅由ADF-3，并且优选地仅由ADF-4组成的拖丝的丝 是本发明的优选实施方案。
MaSpI类可以通过氨基酸脯氨酸的含量来从MaSpII中区分出来。在 MaSpII类中，不存在另外的正式的分类。然而，ADF-3和ADF-4彼此在
它们的氨基酸谷氨^y安的含量和在聚丙氨酸区域的间隔和长度中不同。因
此，本领域技术人员可以容易地确定在MaSpII中，分别对应于ADF-3和 ADF-4的区域。
优选地，所述拖丝蛋白的表达通过分泌表达发生。对于进一步的解释， 见实施例章节。备选地，表达通过胞质生产而发生。如在实施例中显示， 在昆虫细胞中用于表达的条件导致令人惊讶的结果-如上提及-蜘蛛丝蛋白 以高产量和良好的品质表达，并且此外，那些蛋白质自装配为线已经在胞 质中发生，而不需要另外的生产步骤。
在本发明的背景中，可以使用用于生产蜘蛛拖丝蛋白的方法，所述方 法包括下列步骤
a) 表达如上所限定的蜘蛛拖丝蛋白，
b) 回收所述蛋白，禾口
c) 通过适合的方法将所述蛋白旋转(spining)为线。 在步骤c)中，可以使用本身为本领域已知的旋转方法。例如，蜘蛛丝
蛋白的粘稠物溶液通过吐丝器挤压形成生物丝。得到的生物丝可以牵引或 伸长。只要分子的晶体和无定形排列存在于生物丝中，牵引或伸长将施加 足以使分子定向使它们更加平行于丝壁的切应力并增加生物丝的拉伸强 度和韧性。
粘稠物溶液可以包含来自一种或多种蜘蛛物种的丝蛋白，或来自不同 产丝种属的丝蛋白的混合物，例如来自蜘蛛和B. mori的丝蛋白的混合物。 在大多数优选的实施方案中，所述的丝蛋白是来自N.clavipes或A. diadematus的拖丝的丝，尤其是蛋白MaSpI, MaSpII， ADF-3，和ADF-4。在 备选实施方案中，粘稠物溶液包含丝蛋白和一种或多种合成聚合物或天然 或合成生物丝蛋白的混合物。
优选地，粘稠物溶液是至少1%， 5%，， 10%， 15X重量/体积(w/v)丝 蛋白。更优选地，所述粘稠物溶液是多到20%, 25%， 30%, 35%, 40%， 45%， 或50。/。w/v的丝蛋白。在优选的实施方案中，粘稠物溶液包含基本纯的蜘 蛛丝蛋白。在优选的实施方案中，粘稠物具有约6.9的pH。
所谓"粘稠物溶液"指包含丝蛋白的任何液体混合物，并且易于挤压 来形成生物丝或薄膜铸塑。除了蛋白质单体之外，粘稠物溶液还可以包含 更高级的团聚体，其包括，例如二聚体，三聚体和四聚体。通常，粘稠物 溶液是pH 4.0-12.0的水溶液并具有少于40%的有机或离液序列高的试剂 (w/v)。优选地，所述粘稠物溶液不包含任何有机溶剂或离液序列高的试剂，
但是可以包括添加剂来增加溶液的防腐性、稳定性或可使用性。
至于"丝"，是指不确定长度的纤维，范围在极微的长度到一英里或
更长的长度。丝(silk)是天然的丝，而尼龙和聚酯作为合成丝的实例。
至于"生物丝"指从蛋白质产生(例如，纺)的丝，所述蛋白质包括重
组产生的蜘蛛丝蛋白。
关于怎样纺织(spin)蜘蛛丝蛋白纤维的另外的信息可以见于
WO03060099 (Karatzas et al.)，其公开于2003年7月24日，将其并入本文
作为参考。
本发明还包括蜘蛛拖丝蛋白质或线，其包括由SEQ ID NO: 1和/或2 的核酸编码的氨基酸序列；或其变体。
在优选的实施方案中，所述蜘蛛拖丝蛋白质/线仅包括野生型ADF-4 或由SEQ IDNO:2的核酸编码的氨基酸作为拖丝蛋白质。
作为备选，所述蜘蛛拖丝蛋白质/线仅包括野生型ADF-3或由SEQ ID NO: 1的核酸编码的氨基酸作为拖丝蛋白质。
按照另一个方面，本发明提供包括上述定义的蛋白质或由其组成的凝 胶或泡沫。作为怎样产生这些泡沫和凝胶的实例可以见于实施例，见下面 的"蜘蛛丝衍生蛋白质的装配"章节。
此外，本发明涉及用于植入物和斯滕特固定模的涂层，所述涂层包含 上述定义的本发明的蛋白质或由其组成。根据不同的用途，所述涂层可以 由可溶的蛋白质、薄膜、凝胶、泡沫、纳米纤维和线制备。 一般而言，在 非生物材料诸如陶瓷、金属、塑料等上的蛋白质涂层"隐藏"非生物表面， 预防炎症反应或身体的排斥。所述蛋白质涂层将容许细胞结合，这将封住 非生物的材料。此外，植入-相关炎症的减少可以通过选择那些移植物材料 来实现，所述移植物材料与以前用在斯滕特固定模-植入物装置中的那些相 比，固有地更具生物相容性。常规移植物材料诸如PET聚酯和尼龙具有高 溶解性因素，其显示所述材料倾向于在天然脉管(vessel)中更高速率地 溶解并因此更易于发生炎症反应。
本发明的材料显示理想的特性，其抑制在其它在斯滕特固定模-移植 物应用中常用的聚合物材料中观察到的炎症反应。
本发明还提供线或纤维，其包括如上定义的蛋白质，线或纤维和非蜘
蛛来源的另外的材料或纤维，优选地是植物来源的材料或纤维。例如，蜘 蛛丝蛋白和棉花的混和的纤维可以是有利的。
待用的另外的纤维包括尼龙、芳族聚酰胺，芳纶，羊毛，碳纤维，胶 原蛋白纤维，纤维素，角蛋白纤维，弹性蛋白纤维，树胶等的一种或多种。
作为另外的方面，本发明提供载体，其包含编码作为唯一的拖丝蛋白
质的野生型ADF-4的核酸或其包含SEQ ID NO: 1禾Q/或SEQ ID NO: 2的 核酸。
在另一个方面中，提供杆状病毒载体，其包含编码一种或多种拖丝蛋 白质的核酸，优选地拖丝蛋白质ADF-3， ADF-4(野生型)，ADF-3(SEQID NO:l)禾口/或ADF-4(SEQIDNO:2)的核酸。
如已经在上面解释，本文定义的蛋白质/线可以用在生物技术和/或药 物的领域中，优选地用于制备伤口闭合或覆盖系统，用在神经外科手术或 眼科外科手术中的缝线材料。
令人惊讶地，证实本发明的蛋白质和由其制备的纤维、线和另外的材 料显示抗微生物，特别是抗细菌的性质。由于它们的固有的可生物降解性， 它们对于在人或动物中的体内应用具有理想的特性。因此，通过使用本发 明的蛋白质和由其衍生的材料，在外科手术中对身体的有害影响可以被最 小化，另外的外科手术可以避免并且可以加速在外科手术后的逐渐康复 (reconvalescence) 0
此外，蛋白质/线可以优选地用于制备替代材料，优选地人造软骨或腱 材料。
另外的应用是人造替换物，优选地人造替换肺的稳定。 另外，本发明的线/纤维可以用于制备医学装置诸如医学粘附带，皮肤 移植物，替代的韧带，和外科手术网眼；和用于制备广泛范围的工业和商 业产品诸如衣服织物，防弹衣衬里，容器织物，包或钱包带，缆，绳，粘 附性结合材料，非粘附性结合材料，皮带材料，交通工具覆盖物和零件， 建筑材料，混凝土，颜料，聚硅氧烷，耐候性材料，柔性分割材料，运动 设备；和事实上高拉伸强度和弹性是需要的特性的纤维或织物的任何应用 中。本发明还意欲以其它形式存在的稳定的纤维产品，诸如干的喷雾剂涂 层，珠子样颗粒的适应性和应用，或在与其它的组合物的混合物中的使用。
除非另外指出，本文所用的所有的技术和科学术语与本发明所属领域 的普通技术人员公知的具有相同的含义。将所有的出版物，专利申请，专 利，和其它的本文提及的参考文献全部内容并入本文作为参考。如有冲突， 本说明书，包括定义将进行控制。此外，所述材料，方法和实施例仅是举 例说明性的，而不倾向于限制。
现在，本发明还通过实施例和附图进行举例说明，所述附图显示如下:


图1 (SEQ NO:l)和(SEQ NO: 2)在^ /P细胞中的表达。(A) ADF-3和ADF-4在合成后的溶解度。细胞裂解物的可溶(S)和不可溶的成 分(P)通过沉降进行分离。用抗-His6抗体通过免疫印迹法来检测蛋白质。(B) 在"#-4表达细胞中的丝，如用光学显微镜(上板)和在进行免疫细胞化学后 用荧光显微镜(中板)观察到的。将另一种细胞的在免疫细胞化学后的另 外的共焦荧光图像显示在下板中。标尺:10Pm。 (C)共合成的ADF-3和 ADF-4的溶解度。可溶(S)的细胞成分通过沉降从不可溶(P)的细胞成分中 分离出来。在蛋白质印迹后，用S-蛋白质-过氧化物酶缀合物检测ADF-3， 并用抗-T7-标记抗体来检测ADF-4。 (D)用me/-/^y6-^^病毒感染在混悬 液中的S/9细胞。在指定的时间(在感染后的天数)，将等价于6X10"细胞 的等分试样取自培养基，将其进行离心来去除细胞并进行SDS-PAGE，随 后进行免疫印迹。(E)将用附￡/-/^6-^//-4病毒感染达3天的细胞进行免疫 荧光。在细胞表面上的分泌小泡能够被清楚地检测到。标尺10Mm。
图2ADF-4丝和团聚体的形态学。(A)在纯化的丝上的扫描电镜观察。 标尺5tai(B)在纯化的丝上的透射电镜观察。标尺:500nm(C)使用小鼠抗 -HiS6抗体，随后用金-缀合的抗-小鼠抗体在纯化的丝上的免疫电镜观察。 标尺:500nm(D，E)原子力显微镜(AFM)观察(D)高度图像(E)偏转图像。 丝的高度是0.7tai。标尺5tai。
图3 ADF-4丝和拖丝丝线的化学稳定性。(A)如指示对ADF-4丝进行 变性。未溶解的丝和团聚体没有进入凝胶。使用抗-HiS6抗体通过免疫印迹 法对溶解的ADF-4进行检测。还对用6M GdmSCN进行处理的样品进行 银染(GdmSCN/S)。 (B)用如指示的 0.1 u 1的每种溶液将在云母上的风干 的ADF-4的丝和在聚丙烯上的拖丝的丝线进行温育达30秒。用水漂洗后， 通过光学显微镜来检查样品。标尺25tai。 图4 (A)通过光学显微镜来观察在Sf9细胞中形成的没有HiS6-标记的
ADF-4的丝。(B)在用扫描电镜研究a,3(SEQNO: 1)禾Q ^/^(SEQNO: 2)的双重表达后获得的丝的形态学。(C)用光学显微镜来使表达 (SEQNO: l)的S/P细胞成像。(D) ADF-3的细胞定位。将被(SEQNO: l)病毒感染3天的细胞进行免疫荧光分析。(E)通过扫描电镜观察到的体 外复性后，ADF-4团聚体形成。(F)体外形成的ADF-4团聚体的化学稳定 性。如所示，在用变性剂处理后，通过免疫印迹法来检测溶解的ADF-3。 标尺5Pm(B,E)和10Pm(A,C，D)。
图5:蜘蛛丝蛋白的装配形式。(A)通过扫描电衛SEM沐观察的由基 于ADF-4的蛋白质形成的球体。(B)通过原子力显微镜观察的由基于 ADF-4的蛋白质形成的纳米纤维(高度信息)。(C， D)通过SEM研究由基 于ADF-3的蛋白质形成的微纤维(C).对于切割纤维并随后观察截面，使用 聚焦的Ca+离子束(D)。 (E)产生自基于ADF-3的蛋白质溶液的泡沫。(F)产 生自基于ADF-4的溶液的泡沬。(G)由ADF-4纳米纤维形成的交联的凝 胶。在图5中描述的ADF- 3和ADF-4分别对应于SEQ ID NO: 1禾口 2。
图6:产生自本发明的蜘蛛丝蛋白的薄膜。将ADF-3衍生的蛋白质以 20 mg/ml的浓度溶解在1，1,1，3,3,3-六氟-2-丙醇中。将200ul的溶液分散 在聚苯乙烯表面上(约20cm2)。在将溶剂蒸发后，可以得到透明的蛋白质 薄膜。
^本文提供的改善基于这样的观念，即同时表达和研究十字园蛛的拖丝 的丝的两种主要的蛋白质成分。由于昆虫属于与蜘蛛相同的门，本发明人 选择昆虫细胞系Sf9(来自秋黏虫Spodoptera frugiperda)，使用杆状病毒作 为载体进行。#-3和的表达。产生包含a^-3和W/一的部分cDNAs
的重组杆状病毒""。为了监测合成，提供具有HiS6-标记的两种蛋白质。 为了排除由所述标记所导致的人工序列，还使用无HiS6-标记的形式。
将重组病毒用于感染S"细胞以在胞质中产生蜘蛛丝蛋白。3天温育 后，通过超声波处理来将昆虫细胞裂解并将不可溶的细胞内容物通过沉降 从可溶的材料中分离出来。在进行免疫印迹分析之前，将所述沉降物溶解
在硫氰酸胍(GdmSCN)中。
尽管发现ADF-3的大量级分是可溶的，在所用条件(图1A)和不存在 His6-标记(图4A)的情况下，在感染后3天ADF-4几乎完全不可溶。令人 惊奇的是，研究在表达a^-4(SEQNO:2)的细胞中的团聚体揭示穿过胞质 巻曲的丝，其中大多数细胞仅包含均一宽度的一条或极少的丝(图1B)。 与此相反，用对照病毒感染的细胞或a^^(SEQNO: l)编码的病毒从不产 生这样的丝(图4C， D)。使用抗His6抗体在被感染的细胞上进行的免疫荧 光显示所述丝的特异性染色因此证实所述丝由ADF-4组成(图1B)。
接下来，本发明人研究ADF-3和ADF-4是否可以共装配成丝。本发 明人使用pFastbacDUAL供体质粒，产生在不同的和独立的启动子下，包 含"#-3(SEQNO: l)和W/-《SEQNO: 2)的重组杆状病毒。用该病毒感染 细胞导致两种蛋白质的合成，并且与单独由ADF-4的合成形成的丝相 比，蛋白质丝的形成显示相似的外观(图4B)。有趣的是，在双重表达系统 中装配的丝全部由ADF-4形成，而没有结合或与其稳定缔合的ADF-3 (图 1C并且数据未显示)。
为了研究表观自装配是否仅基于ADF-4的性质或是否涉及另外的因 素或变化，本发明人产生编码HiS6-ADF-4的分泌形式的重组杆状病毒。 用该病毒感染细胞导致ADF-4在细胞的培养基中的聚集(图1D)。免疫荧 光揭示在被感染的细胞的细胞表面包含ADF-4的分泌小泡的丰度(图1E)。 显著地，本发明人在宿主细胞的区室和在培养基中都没有观察到ADF-4 丝的任何形成。
丝线的形成一般取决于蛋白质的浓度以及另外的因素。有趣的是，在 丝线装配前，Sf9细胞的细胞内pH6.3对应于在纺丝粘稠物中的pH(19)。 在胞质环境中的ADF-4丝装配所需要的另外的因素仍是难以捉摸的。体外 研究ADF-4的自装配的性质强调另外的因素的重要性。通过将丝溶解在6 M GdmSCN中来容易地获得可溶的ADF-4。在通过透析或稀释去除 GdmSCN后，溶解的ADF-4迅速聚集。然而，体外形成的ADF-4团聚体 既没有显示纤维结构，也没有显示在S/P细胞内部形成的ADF-4丝的化学 稳定性(见下面和图4E， F)。上述发现显示特定的胞质环境的重要性，其 可以包括另外的，至今尚未确定的对于控制自装配而言是重要的胞质因
素。
接下来，发明人对ADF-4丝的形态特征进行鉴定。丝的直径范围在
200 nm到lnm，然而对于每条单丝，发现直径是不变的。此外，所述丝 显示多到100um的长度，并且经常终止于结、分支或形成闭合的环(图 2A， D, E)。丝显示平滑的表面并且经常与纳米纤维(直径 5nm)和其它的 蛋白质团聚体(图2)相关。免疫印迹法和免疫电镜显示丝和相关的装配形 式由ADF-4组成(图2C, 3A)。如通过SDS-PAGE分析随后通过银染观察到 的(图3A)，除了ADF-4之外，在丝中不能检测到其它的丰富的蛋白质。 每个细胞的少量的丝和几乎全部的细胞内ADF-4聚集成团聚体显示 ADF-4在S/P细胞中的自装配可能是具核的过程，这在以前也在家蚕蛾 (Bom&x woh)的纺丝过程中被建议(26i;。
在S/P细胞中形成的丝的大小似乎被产生它们的细胞的体积限制得过 短而不能进行对于丝线而言是典型的机械力测量(21)。然而，发明人能够 与十字圆蛛的天然的拖丝的丝线比较来分析湿和干的ADF-4丝的化学稳 定性。已经报道拖丝的线在许多变性剂中是不可溶的(22)。应用2%的十二 烷基硫酸钠(SDS)和8 M的尿素在30秒的暴露后，没有对ADF-4的丝和 拖丝的线的结构产生明显的影响(图3并且数据未显示)。将丝浸没在6M 的氯化胍(GdmCl)中没有导致ADF-4丝或拖丝的线的溶解，尽管其导致拖 丝的丝的溶胀。这种溶胀可能是由于纤维的过收縮所引起(2/)，这以前对 于将蜘蛛丝浸没在水溶液中描述过，并且由在无定形基质中的氢键的再形 成所导致(27)。与上面提及的变性剂相反，小滴的6MGdmSCN在数秒内 将ADF-4丝以及拖丝的线彻底溶解(图3)。结果，发明人得出结论，两 种结构具有分子相互作用，其对针对特定变性剂的化学抗性负责。
方法
质粒构建
将SEQ NO: 1禾卩2的cDNAs克隆入来自Invitrogen的pFastBac 供体
质粒。将编码肽标记的序列于5'末端提供给基因片段。对于扭56-标记的 蛋白质，利用*"/屈0/将基因从宿主载体上切下来并连接以同样消化的 pFastBacTMHTa。对于T7-标记(23)的蛋白质，首先利用屈o/和￡coi /将基
因克隆入pET21。随后用Bg///和lo/切除包括T7-标记编码区的插入片 段并连接以用Sam/77/屈o/消化的pFastBacTMl 。为了共表达(SEQ NO: l)和(SEQ NO: 2)，将两种基因克隆入pFasBacTMDUAL并提供以编 码T7-和S-标记(24)的序列。用6g/// /lo/将(SEQ NO: 2)从 pET21-a#-4 (SEQ NO: 2)上切下来并连接以用TWze/z^w ///裂解的 pFasBacTMDUAL。将两种合成性寡核苷酸(MWG Biotech)进行退火以提供 S-标记编码序列，其得到具有虽J/5謹/7/相容性单链延伸的双链DNA:GCACATGGACAGCGGTCGG-3，(SEQ ID NO: 5)GGTTTCTTTCATCCCGGG-3，(SEQ ID NO:6)用7V/2e//5am///消化pET213(SEQ NO: l)以除去T7-标记编码区。 随后将载体连接以S-标记编码DNA。利用屈o/7Xma/将S-标记的 3(SEQ NO: l)克隆入pFasBacTMDUAL-a#-4 (SEQ NO: 2)。在双重构建 体中，^//^和^/-4在独立的？10(25)和多角体蛋白(26)启动子的控制之 下。利用pMIB/V5-HisA载体(Invitrogen)作为模板和包含Q o/限制酶切 位点的下列引物通过PCR扩增蜜蜂蜂毒肽的分泌信号的编码序列用Q7o/剪切得到的PCR产物并连接入同样消化的pFasBaCTMHTa-"#-4 (SEQ NO: 2)中。通过测序对阳性克隆检查方向和正确性。细胞培养在BIOINSECT-l无血清昆虫细胞培养基(Biological Industries)中于27 。C增殖s/P(5^^o/7tem^M^penfo; ATCC#: CRL-1711)细胞。将s/P细胞作 为单层培养于6孔板中的盖玻片上或生长于80rpm振荡的摇瓶中。包含m//-J(SEQ NO: l)和"#-4 (SEQ NO: 2)的重组杆状病毒的生产根据生产商的方案(Invitrogen)使用包含bacmid (杆状病毒穿梭载体质 粒)和辅助质粒的感受态大肠杆菌DHIOBAC细胞来产生重组bacmids。通
过PCR来证实基因插入bacmid 。在6孔板中用ESCORT转染试剂 (Sigma-Aldrich)以重组bacmid DNA转染s/P细胞。将细胞于27"温育5h， 漂洗，并再温育72h。收集培养基，离心，并通过斑测定法滴定包含病毒 的上清液。fl^/^和fl#-4的表达以0.1-10范围的各种MOIs (感染复数)用重组病毒感染细胞(3 Xl()S细胞/ml)。感染后(PI)三天，通过于500xg离心5min收集细胞。ADF-3和ADF-4的检测和溶解性以1.2x 1()7细胞/ml将细胞重悬于100 mMNaCl, 20 mM,(2-羟基乙基) 哌嗪—iV'-(2-乙磺酸)(HEPES)， pH 7.5中并通过超声波处理进行裂解。通过 于125，000xg离心30min分离可溶的和不可溶的组分。为了进一步的分析， 将沉淀物重悬于6MGdmSCN并针对8M尿素进行透析。将源自1.5x105 细胞的上清液和沉淀物加样在还原性条件下的10% Tris-甘氨酸聚丙烯酰 胺凝胶上并点印到PVDF膜(Millipore)上。使用小鼠抗His6单克隆抗体 (Sigma-Aldrich, 1:10,000)或小鼠抗T7单克隆抗体(Novagen, 1:10，000)和 抗小鼠IgG过氧化物酶缀合物(Sigma-Aldrich, l:5,000)作为二抗来检测蜘 蛛丝蛋白。使用S-蛋白过氧化物酶缀合物(Novagen, 1:5,000)来直接检测S-标记的ADF-3。免疫细胞化学用包含W/-3(SEQ NO: l)或(SEQ NO: 2)的重组病毒于MOI=10 来感染50%汇合的生长在盖玻片上的细胞。感染后(PI)三天将细胞用甲醇 于-2(TC固定。用1: 300稀释的小鼠抗His6单克隆抗体(Roche)温育盖玻片， 随后用1: 500稀释的得克萨斯红缀合的抗小鼠二抗IgG来进行温育。用 Olympus BX51荧光显微镜观察细胞并用Magnafire SP相机照相或通过 共聚焦显微镜进行分析。ADF-4-丝纯化将细胞以1.2xl()7细胞/ml重悬于100 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.5，并通过加入2% w/v十二垸基硫酸钠随后于95。C温育5 min来进行裂 解。将线于5，000xg进行沉降随后用8M尿素和Water bidest洗涤。原子力显微镜(AFM)，扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)将纯化的丝重悬于Waterbidest中并在新裂解的云母(AFM)上温育3 分钟或加载到Thermanox⑧塑料盖玻片(Nalgene Nunc)上(SEM)。对于AFM， 用Waterbid^漂洗样品四次并在利用Multimode SPM (Veeco)连接模式成像 之前进行风干。对于SEM,在除去溶液后将样品风干，真空涂布以金层并 用JSM-5900LV (JEOL Ltd,)于20 kV上进行分析。对于TEM (JEOL Ltd.) 分析，将丝吸附到透明塑胶涂布的载网上并以乙酸双氧铀进行负染色。对 于免疫染色，将纤维与小鼠抗-His6抗体一起温育，随后用18mm金缀合的 山羊抗小鼠IgG进行标记。没有Hi"标记的ADF-4的线形成为了排除His6标记对于丝形成的可能影响，在S 细胞中合成T7-标 记的ADF-4。T7-标记的ADF-4的丝形成显然与His6标记的ADF-4的丝形 成没有区别(图4A)。在flrf/-J(SEQ NO: l)和(SEQ NO: 2)共表达细胞中的线形成在共表达和的Sf9细胞中，与在只产生ADF-4的细胞中 形成的丝相比，可以检测出显示明显无区别形态的丝(图4B)。在Sf9细胞中W/-3(SEQ NO: l)的表达尽管免疫细胞化学揭示了在表达a^^(SEQ NO: l)的细胞中的荧光聚 焦，但并不能观察到丝样的结构(图4C，D)。重要的是，在Sf9细胞中合成 的ADF-3是非常易溶的。所以聚焦形成代表了亚细胞积聚而不是蛋白质聚集。ADF-4的体外装配
ADF-4在通过透析除去变性剂或在稀释入水性缓冲液之后聚集。得到的团聚体并不显示任何纤维状的形态(图4E)。测试化学稳定性显示与在细 胞质中形成的ADF-4丝相反，体外形成的团聚体可溶于2%SDS或8 M 尿素(图4F)。蜘蛛丝来源的蛋白质的装配进行下列实验以证明来自蜘蛛丝序列ADF-3 (SEQ ID NO:l)或ADF-4 (SEQ ID NO:2)的蛋白质能够装配成形态不同的形式。如在B/oc&m&o; 2004 Vol.43 pp.13604-11362 (27)中所述来在水溶液中构建、产生和制备基 于ADF-3和ADF-4的蛋白质。如果没有另外提及，蛋白质溶液包含10mM 的Tris-(羟甲基)-氨基甲烷(Tris)pHS.O。1. 球体通过将0.8 M的硫酸铵加入0.2% (w/v)的基于ADF-4的蛋白质溶液来 产生显示直径范围在0.5到2tai之间(图5a)的蛋白质球体。2. 纳米纤维通过将1% (w/v)基于ADF-4的蛋白质溶液在室温温育2周来形成显 示直径在0.7和4nm之间(图5b)的纳米纤维。3. 微纤维为了形成微纤维，将5-10W的25% (w/v)的基于ADF-3的蛋白质溶液 缓慢注射到0.5M的磷酸钾pH8.0中，形成稳定的蛋白质溶液液滴。在温 育1分钟后，使用镊子将蛋白质液滴从溶液中去除。在空气中再温育1分 钟后，使用第二组镊子可以将蛋白质纤维从蛋白质液滴中以约2cm/s的速 率从蛋白质液滴中抽提。所述纤维显示具有4tai的直径的圆形截面(图 5c,d)。4 .泡沫将蛋白质泡沬(图5e， f)产生自包含2.5 mM的过二硫酸铵(APS)， IOOWV[的tris(2，2'-二吡啶基)二氯钌(n) (Rubpy)和10% (w/v)的基于ADF-3 的蛋白质或2%0/力的基于ADF-4的蛋白质的溶液。所述蛋白质溶液用空 气发泡。为了稳定得到的泡沫结构，将蛋白质通过暴露于来自钨灯的可见 光达1分钟来进行交联(28)。随后在95"C对泡沫进行干燥。5. 凝胶在1。/。(w/v沐度的基于ADF-4的纳米纤维(见节2)显示凝胶样的外观， 其可容易地通过搅拌或剪切而被破坏。为了改善凝胶的机械性质，容许 APS和Rubpy通过扩散进入凝胶来产生10mMAPS禾B 100WVI Rubpy的终 浓度。在光诱导交联后(见，节4)，可以获得在尺寸上稳定的凝胶(图5g)。6. 薄膜将ADF-3衍生的蛋白质以20 mg/ml的浓度溶解在1,1,1,3，3,3-六氟-2-丙醇中。将200iil的溶液分散在聚苯乙烯表面上(约20cm2)。在将溶剂蒸 发后，可以得到透明的蛋白质薄膜(见，图6)。
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权利要求
1一种蜘蛛拖丝蛋白，其包含由SEQ ID NO1或2的核酸序列，或那些核酸序列的变体编码的氨基酸，所述变体每个被限定为与SEQ ID NO1或2的序列比较，具有一个或多个取代，插入和/或缺失，在所述变体在适度严格条件下与包含SEQ ID NO1或2的序列的核酸杂交的条件下，或在所述变体包含由于遗传密码子的简并性所造成的核酸变化的条件下，其编码与SEQ ID NO1或2的核酸序列相同或功能上等价的氨基酸。
2. —种蜘蛛拖丝蛋白质或线，其包含权利要求l的蜘蛛拖丝蛋白。
3. 权利要求1或2的蜘蛛拖丝蛋白质/线，其仅包含野生型ADF-4或由SEQ ID NO:2的核酸编码的氨基酸;或作为拖丝蛋白的SEQ ID NO: 4的氨基酸。
4. 权利要求1或2的蜘蛛拖丝蛋白质/线，其仅包含野生型ADF-3或由SEQ ID NO:l的核酸编码的氨基酸;或作为拖丝蛋白的SEQ ID NO: 3的氨基酸。
5. —种凝胶或泡沫，其包含权利要求1-4中一项或多项的蛋白质或由其组 成。
6. 用于植入物和斯滕特固定模的涂层，其包含权利要求1-4中一项或多项 的蛋白质或由其组成。
7. —种线或纤维，其包含权利要求1-4中一项或多项的蛋白质/线和另外 的纤维，所述纤维不是蜘蛛来源的，并且优选地是植物来源的纤维或合成 纤维。
8. —种薄膜，其包含权利要求l-4中一项或多项的蛋白质或由其组成。
9. 伤口闭合或覆盖系统，缝线材料，替换材料，优选地人造软骨或腱材料， 其可使用权利要求1-4的一项或多项的线/蛋白质获得。
10. —种载体，其包含编码作为唯一的拖丝蛋白的野生型ADF-3禾口/或 ADF-4的核酸或包含SEQ ID NO: 1禾口/或SEQ ID NO: 2的核酸。
11. 一种杆状病毒载体，其包含编码一种或多种拖丝蛋白的核酸，优选地拖 丝蛋白ADF-3, ADF-4 (野生型)，ADF-3 (SEQ ID NO:l)和/或ADF-4 (SEQ ID NO:2)的核酸。
12. 权利要求1-4的一项或多项的蛋白质/线在技术、生物技术和/或药物领域的应用。
13. 权利要求1-4中一项或多项的蛋白质/线用于制备伤口闭合或覆盖系统， 优选地用于制备缝线材料的应用，所述缝线材料更优选地倾向于用在神经 外科手术或眼外科手术中。
14. 权利要求l-4中一项或多项的蛋白质/线用于制备替换材料，优选地人 造软骨或腱材料的应用。
15. 权利要求l-4中一项或多项的蛋白质/线用于稳定人造替换物，优选地人造替换肺的应用。
全文摘要
本发明涉及天然来源的蛋白质和由其制备的材料，特别是由其衍生的线、纤维、泡沫和凝胶。本发明还提供将这些蛋白质/线和材料用在技术、生物技术和/或药物领域中，特别是用在制备伤口闭合系统或覆盖系统，缝线材料中和在制备替换材料，优选地人造软骨或腱材料以及其它的商业应用中的应用。
文档编号D01F4/02GK101133080SQ200580024375
公开日2008年2月27日 申请日期2005年6月23日 优先权日2004年6月25日
发明者D·许梅里希, T·沙伊贝尔 申请人:慕尼黑技术大学