抑制凝血因子vii基因的表达的组合物和方法

专利名称：:抑制凝血因子vii基因的表达的组合物和方法抑制凝血因子VlI基因的表达的组合物和方法本发明涉及双链核糖核酸(dsRNAs)，及其介导RNA干扰来抑制凝血因子VII基因的表达、具体地抑制肝中凝血因子VII酶原表达并且随后降低凝血因子VII酶原血浆水平的应用。此外，将所述dsRNAs用于治疗/预防与凝血因子VIIa、IXa、)(a、Xna、凝血酶的激活相关的广泛范围的血栓栓塞疾病/病症，如动脉和静脉血栓形成、炎症、动脉硬化和癌症的应用是本发明的部分。凝血因子VII(FVII)是依赖于维生素K的糖蛋白，其参与血液凝固的外部途径的启动。FVII在肝中合成并且主要在血浆中作为无活性的单链酶原循环。在结合于由血管损伤暴露的组织因子(TF)之后，FVII通过单肽键的裂解形成20-kDa的轻链和30_kDa的重链而被裂解为其双链活性形式(FVIIa)。FVIIa的轻链包含两个表皮生长因子-样(EGF-1，EGF-2)结构域和Y-羧基谷氨酸(Gla)结构域，其允许结合钙从而导致分子的构象变化，暴露新的表位并促进其随后与TF的结合。重链包含在结构上与凝固作用的其它丝氨酸蛋白酶同源的催化结构域。TF:FVIIa复合物又通过有限的蛋白水解裂解激活FIX和FX，导致形成凝血酶并最终形成血纤蛋白凝块。人FVII基因在肝细胞中表达，但是FVIImRNA的稳态水平非常低。人FVII的完整序列已经从全长cDNA克隆推知(HagenF.S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)(1986)83=2412-2416)。升高水平的FVII与发展心血管疾病的独立风险因子相关。在高胆固醇血症患者中，FVII水平独立地与促炎性变量如C-反应性蛋白(CRP)或细胞因子(IL-6)相关。然而，并非所有的研究都证实FVII是冠状动脉心脏疾病中的独立风险因子(LoweG.D.O.等，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.(2004)24:1529-1534)所述TF:FVIIa复合物在凝固作用和炎性反应之间的复杂串扰(crosstalk)中具有关键作用。除了其在凝固作用中的充分已知的作用之外，TF:FVIIa复合物还诱导细胞内变化如信号转导，所述信号转导影响细胞过程如炎症、血管发生和癌症的病理生理学和动脉粥样硬化。动物模型中的概念实验证据已经显示对FVIIa的特异性抑制或血浆中FVII酶原水平的减少导致抗血栓形成作用和抗炎作用，而不会增加出血倾向(XuH.，等，J.Pathol.(2006)210=488-496)0在败血症模型中，在用活性部位-失活的FVIIaCTaylorF.等，Blood.(血液)(1998)91:1609-1615)或针对FVII/VIIa的单克隆Fab片段(BiemondB.J.等，Thromb.Haemost.(1995)73=223-230)处理的猴中观察到对内毒素-诱导的凝固作用激活的抑制、炎性介质白细胞介素-6(11-6)、IL-8的表达的减少和对死亡率的预防。活性部位失活的FVIIa还在实验性急性胰腺炎(AnderssonE.等，Scand.J.Gastroenterology(2007)42:765-770)，防止嗜中性粒细胞在肺、回肠和结肠中的组织浸润并减少炎性标记如IL-6和巨噬细胞炎性蛋白-2(MIP-2)中显示有利的抗炎性质。而且，TF:FVIIa复合物在小鼠内的关节内注射诱导单核细胞浸润到滑膜组织，随后发生软骨和骨的破坏。关节炎严重性在TF突变体小鼠中大大减少，说明在类风湿关节炎患者的关节中频繁关节内发现的TF/FVII复合物是慢性破坏性关节炎的诱导和进展中的重要因素(YangY.H.等，Am.J.Pathol.(2004)164:109-117)。[0007]通过抗-TF单克隆抗体(MuellerB.Μ.等，Proc.Natl.Acad.ki.USA(美国国家科学院学报)(1992)89:11832-11836),组织因子途径抑制剂(AmirkhosraviA.等，Semin.Thromb.Hemost.(2007)33:643-652)封闭TFiFVIIa复合物或由特异性TFsiRNA击倒TF表达抑制了实验性肺转移(AmarzguiouiM.等，Clin.CancerRes(临床癌症研究).(2006)12:4055-4061)，提示TF:FVIIa复合物也涉及促进肿瘤生长和转移，并且进一步说明对TF:FVIIa复合物的抑制是治疗癌症的临床可行的策略。尽管在治疗血栓形成和炎性疾病上取得了明显的进展，目前关于例如冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、增生性疾病如癌症/转移的理解说明具有抗-血栓形成和抗炎性质的治疗活性和安全物质针对标准疗法是一种改善。已经显示双链RNA分子(dsRNA)在已知为RNA干扰(RNAi)的高度保守的调节机制中阻断基因表达。本发明提供双链核糖核酸分子(dsRNAs)，其能够选择性地和有效地减少FVII的表达。FVIIRNAi的应用提供了关于这样的疾病/病症的治疗和/或预防性治疗的方法，所述疾病/病症与下述物质的形成相关FVIIa，TF-FVIIa复合物，凝血因子如IXa、Xa,XIIa和凝血酶，炎性因子如细胞因子和C-反应性蛋白(CRP)，直接地或间接地被FVIIa和TF激活。特定的疾病/病症状态包括对下列疾病的治疗和/或预防性治疗动脉和静脉血栓形成(arterialandvenousthrombosis)、深静脉血栓形成(deepvenousthrombosis)>^11^^^(unstableanginapectoris)>^fiS^sjjJgc^合征(acutecoronarysyndrome)、心肌梗塞(myocardialinfarction)、心房纤维亶员动导致的中风(strokeduetoatrialfibrillation)、肺检塞(pulmonaryembolism)、脑栓塞(cerebralembolism)、肾栓塞(kidneyembolism)、重症肢体缺血(criticallimbischemia)、急性肢体缺血(acutelimbischemia)、播散性血管内凝固作用(disseminatedintravascularcoagulation)(例如由细菌、病毒性疾病、癌症、败血症、多处创伤引起)、坏疽(gangrene)、镰状细胞疾病(Sicklecelldisease)、动脉外膜炎(periateritisnodosale)、川崎综合症(Kawasakisyndrome)、血栓闭塞性脉管炎(Buergerdisease)、抗磷脂综合征(antiphospholipidsyndrome)、炎性反应包括，但不限于急性或慢性动脉粥样硬化(atherosclerosis)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、±曾生性疾病如癌症/转移、胰腺炎(pancreatitis)，所述方法包括施用靶向FVII的dsRNA给人或动物。当血液与体内的医学装置(例如机械和生物学假体心脏瓣膜、血管支架、血管导管、血管移植物)接触或与体外的医学装置(例如，血液透析治疗、心肺机)接触时，本发明的化合物也可以用于预防血栓形成。本发明提供这样的双链核糖核酸分子(dsRNAs)，其能够通过使FVII基因沉默而选择性和有效地减少肝细胞中的FVII的表达，由此减少在肝中合成的FVII蛋白的水平，并最终减少血浆中的FVII活性。在一个优选的实施方案中，所述的dsRNA分子能够抑制FVII基因的表达达至少70%。本发明还提供用FVIIdsRNA特异性靶向肝的组合物和方法，用于治疗由FVII基因的表达导致的病理性病症和疾病，包括上述那些的组合物和方法。在一个实施方案中，本发明提供这样的双链核糖核酸(dsRNA)分子，其用于抑制凝血因子VII的表达，具体地抑制哺乳动物或人凝血因子VII基因的表达。dsRNA包括彼此互补的至少两种序列。dsRNA包括包含第一序列的有义链，并且反义链可以包含第二序列，还见在后附的表1，4，6和7中提供的具体dsRNA对。在一个实施方案中，有义链包含与编5码FVII的mRNA的至少一部分具有至少90%的同一性的序列。所述序列位于有义链与反义链的互补性区域中。在一个优选的实施方案中，所述dsRNA特别靶向人凝血因子VII基因，在又一个优选的实施方案中，所述dsRNA靶向豚鼠(guineapig,Caviaporcellus)或大鼠(褐家鼠(Rattusnorvegicus))凝血因子VII基因。在一个实施方案中，反义链包含这样的核苷酸序列，其与编码所述凝血因子VII基因的mRNA的至少部分基本互补，并且互补性区域最优选长度为少于30个核苷酸。此外，优选本文所述的本发明的ds分子的长度(双链体长度)在约16-30个核苷酸范围内，特别地在约18-个核苷酸的范围内。在本发明的背景下特别有用的是约19，20，21，22，23或M个核苷酸的双链体长度。最优选19，21或23个核苷酸的双链体序列。在与表达凝血因子VII基因的细胞接触后，dsRNA抑制凝血因子VII基因的体外表达达至少70%。在后附的表6和7中提供选择的dsRNA分子，优选的dsRNA分子包含SEQIDNos413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436，437和438的核苷酸1-19。在一个实施方案中，所述dsRNA分子包含具有1-5个核苷酸长度，优选1_2个核苷酸长度的3’突出端的反义链。优选地，所述反义链的突出端包含尿嘧啶或与编码凝血因子VII的mRNA至少90%互补的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述dsRNA分子包含具有1-5个核苷酸长度，优选1-2个核苷酸长度的3’突出端的有义链。优选地，所述有义链的突出端包含尿嘧啶或与编码凝血因子VII的mRNA具有至少90%同一性的核苷酸。在另一个优选的实施方案中，所述dsRNA分子包含具有1-5个核苷酸长度，优选1-2个核苷酸长度的3’突出端的有义链，以及具有1-5个核苷酸长度，优选地1-2个核苷酸长度的3’突出端的反义链。优选地，所述有义链的突出端包含尿嘧啶或与编码凝血因子VII的mRNA具有至少90%同一性的核苷酸，并且所述反义链的突出端包含尿嘧啶或与编码凝血因子VII的mRNA具有至少90%互补的核苷酸。在优选的dsRNA分子中，特别地和优选地，有义链选自由下列各项组成的组中在SEQIDNos:413，415，417，419，421，423，425，427，429，431，433，435，和437中所述的核酸序列，并且反义链选自由下列各项组成的组中在SEQIDNos=414,416,418,420,422,424，426，428，430，432，434，436和438中所述的核酸序列。因此，本发明的dsRNA分子可以特别包含选自由下列各项组成的组中的序列对=SEQIDNos:413/414，415/416，417/418，419/420，421/422，423/424，425/426，427/428，429/430，431/432，433/434，435/436和437/438。在本文提供的特异性dsRNA分子的情形中，SEQIDNos的对涉及相应的有义链序列和反义链序列(5’-3’)，也如在附表中所显示。此外，本文还提供修饰的dsRNA分子，并且其特别在附表1和4中公开，提供本发明的修饰的dsRNA分子的例示性实例。表2和3提供本发明某些dsRNA分子的选择性生物、临床和药物相关参数。如本文上面指出，表1提供本发明的修饰的dsRNA的例示性实例(其中在该表中提供相应的有义链和反义链)。此外，本文还提供本发明dsRNAs的这些构成部分的例示性修饰作为修饰的实例。此外，本发明的一个实施方案还包括这些dsRNAs(以及它们的构成部分)的其它修饰。在本发明的更详细描述中还提供相应的实例。[0021]附表4和7还提供在本发明背景下有用的其它的SiRNA分子/dsRNA，其中表4提供如在表7中所显示的本发明修饰的siRNA分子/dsRNA分子的某些生物学和/或临床相关的令人惊奇的特征。这些RNA分子包含举例说明的核苷酸修饰。最优选的dsRNA分子在附表1和4中提供，并且特别地和优选地，其中有义链选自由下列各项组成的组中在SEQIDNos:1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23和25中所显示的核酸序列，并且反义链选自由下列各项组成的组中在SEQIDNos=2,4,6,8,10,12,14,16，18，20，22，24和沈中所述的核酸序列。因此，本发明的dsRNA分子可以，特别地包含选自由SEQIDNos:1/2,3/4,5/6,7/8,9/10,11/12,13/14,15/16,17/18,19/20,21/22,23/24和25/组成的组中的序列对。最优选的dsRNA分子包含序列对19/20和11/12。在本文提供的具体dsRNA分子的情形中，SEQIDNos的对涉及也如在后附和包含的表中所显示的相应有义链序列和反义链序列(5’-3’)。在一个实施方案中，本发明的dsRNA分子包含有义链和反义链，其中所述链的至少一种具有至少M小时的半衰期。在另一个实施方案中，本发明的dsRNA分子是非-免疫刺激性的，例如不体外刺激INF-α和TNF-α。本发明的dsRNA分子可以包含天然存在的核苷酸或可以包含至少一种修饰的核苷酸，如2'-0-甲基修饰的核苷酸，包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸，和与胆留醇衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。2’修饰的核苷酸可以具有另外的优势，即当将本发明的dsRNA分子体内应用，例如用于医疗装置时某些免疫刺激性因子或细胞因子被抑制。备选地和非限制性地，修饰的核苷酸可以选自下列各项的组2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁定核苷酸、脱碱基核苷酸、2’-氨基-修饰的核苷酸、2’-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、和包含非天然碱基的核苷酸。在一个优选的实施方案中，dsRNA分子包含至少一种下列修饰的核苷酸2’-0-甲基修饰的核苷酸，包含5’-硫代磷酸酯基团和脱氧胸苷的核苷酸。在表1和4中提供优选的包含修饰的核苷酸的dsRNA分子。本发明还提供包含至少一种本发明的dsRNA的细胞。所述细胞优选地是哺乳动物细胞，如人细胞。此外，在本发明中还包括包含本文定义的dsRNA分子的组织和/或非人生物，其中所述非人生物特别用于研究目的或作为研究工具，例如也用在药物测试中。另外，本发明涉及在细胞、组织或生物体中抑制FVII基因的表达，具体地哺乳动物或人FVII基因的表达的方法，所述方法包括下列步骤(a)将如本文定义的双链核糖核酸(dsRNA)引入细胞、组织或生物体中；(b)在足以获得FVII基因的mRNA转录体降解的时间内维持在步骤(a)中产生的所述细胞、组织或生物体，由此在给定的细胞中抑制FVII基因的表达。本发明还涉及包含本发明的创造性dsRNAs的药物组合物。这些药物组合物特别用于抑制细胞、组织或生物体中的FVII基因的表达。包含本发明的一种或多种dsRNA的药物组合物也可以包含药用载体、稀释剂和/或赋形剂。在另一个实施方案中，本发明提供治疗、预防或处理血栓形成疾病的方法，所述血栓形成疾病与凝血因子的激活、炎症或增生性疾病相关，所述方法包括向需要所述治疗、预防或处理的受试者施用治疗或预防有效量的本发明一种或多种dsRNAs。优选地，所述受试者是哺乳动物，最优选地是人患者。7[0031]在一个实施方案中，本发明提供治疗患有由凝血因子VII基因的表达介导的病理学病症的受试者。所述病症包括疾病，如血栓栓塞性疾病、不合需要的炎症事件或增生性疾病以及上述的那些。在该实施方案中，dsRNA用作控制凝血因子VII基因表达的治疗剂。所述方法包括向患者(例如人)施用本发明的药物组合物，从而使凝血因子VII基因的表达沉默。因为它们的高度特异性，本发明的dsRNAs特异性靶向凝血因子VII基因的mRNAs。在一个优选的实施方案中，所述dsRNAs特异性减少FVIImRNA水平并且不直接影响细胞中的脱靶(off-target)基因的表达和/或mRNA水平。在一个优选的实施方案中，所述dsRNA体内减少肝中的凝血因子VIImRNA水平达至少80%，并且体内减少血浆中的凝血因子VII酶原水平达至少95%。在另一个实施方案中，所述dsRNAs延长凝血酶原时间并且抑制体内凝血酶产生和血栓形成。在另一个优选的实施方案中，由所述的dsRNA分子介导的这些抗血栓形成作用与减少的体内血浆FVII水平和减少的体内肝FVIImRNA水平相关。在一个实施方案中，所述dsRNA分子增加体内的血液凝固时间达至少两倍。关于治疗性dsRNAs特别有用的是靶向豚鼠凝血因子VII的dsRNAs组，其可以用于估计豚鼠或细胞培养模型中的各种dsRNAs的毒性、治疗功效和有效剂量以及体内半衰期。在另一个实施方案中，本发明提供用于抑制细胞中的凝血因子VII基因表达的载体，具体地这样的凝血因子VII基因，其包含与编码本发明的一种dsRNA的至少一条链的核苷酸序列可操纵连接的调节序列。在另一个实施方案中，本发明提供包含用于抑制细胞中凝血因子VII基因的表达的载体的细胞。所述载体包含与编码本发明的一种dsRNA的至少一条链的核苷酸序列可操纵连接的调节序列。此外，优选地，除了所述调节序列之外，所述载体包含编码本发明的dsRNA的至少一条“有义链”和所述dsRNA的至少一条“反义链”的序列。还意欲所要求保护的细胞包含两种以上的载体，所述载体除了所述调节序列之外，还包含本文定义的编码本发明的一种dsRNA的至少一条链的序列。在一个实施方案中，所述方法包括施用包含dsRNA的组合物，其中所述dsRNA包含与待治疗的哺乳动物的凝血因子VII基因的RNA转录体的至少一部分互补的核苷酸序列。如上面所指出，还可以将包含编码本文定义的dsRNA分子的至少一条链的核酸分子的载体和细胞用作药物组合物，并且其因此也可以用于本文公开的治疗需要医学干预的受试者的方法。要注意，涉及药物组合物并涉及相应治疗(人)受试者的方法的这些实施方案也涉及如基因治疗方案的方案。还可以将本文提供的凝血因子VII特异性dsRNA分子或编码这些本发明dsRNA分子的各个链的核酸分子插入载体中并将其用作人患者的基因治疗载体。可以通过例如，静脉内注射、局部施用(见美国专利5，328，470)或通过立体定位(stereotactic)注射(见例如Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(美国国家科学院学报)91:30M-3057)将基因治疗载体递送给受试者。基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或可以包含埋入基因递送载体的缓慢释放基质。备选地，如果完整的基因递送载体可以完整地从重组细胞中产生，例如反转录病毒载体，所述药物制剂可以包括产生基因递送系统的一种或多种细胞。在本发明的另一个方面中，调节凝血因子VII基因表达活性的凝血因子VII特异性dsRNA分子自被插入DNA或RNA载体的转录单位表达(见，例如Skillern，Α.，等，国际PCT公开号WO0(V22113)。这些转基因可以作为直链构建体、环状质粒或病毒载体引入，其可以被整合并且作为整合到宿主基因组中的转基因遗传。还可以构建转基因从而使其作为染色体外质粒进行遗传(Gassmann，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)(1995)921292)。可以通过在两个单独表达载体上的启动子转录dsRNA的各条链并且将其共转染到靶细胞中。备选地，dsRNA的每条链可以通过都位于同一表达质粒上的启动子进行转录。在一个优选的实施方案中，dsRNA作为通过接头多核苷酸序列连接的反向重复序列表达从而使dsRNA具有茎和环结构。重组dsRNA表达载体优选地是DNA质粒或病毒载体。可以基于，但不限于下列物质来构建表达dsRNA的病毒载体腺伴随病毒(综述，见Muzyczka，等，Curr.TopicsMicro.Immunol.(1992)158:97-129))；腺病毒(见，例如，Berkner，等，BioiTechniques(生物技术)(1998)6616),Rosenfeld等(1991，Science(科学)252:431-434)，和Rosenfeld等(1992)，Cell(细胞)68:143-155))；或甲病毒属(alphavirus)以及本领域已知的其它病毒载体。将反转录病毒用于将各种基因体外和/或体内引入许多不同的细胞类型中，包括上皮细胞中(见例如，Danos和Mulligan，Proc.Natl.Acad.ki.USA(美国国家科学院学报)(19985=6460-6464)。可以通过将重组反转录病毒基因组转染到适合的包装细胞系如PA317和I^si-CRIP中来产生能够转导和表达被插入细胞的基因组中的基因的重组反转录病毒载体(Comette等，1991,HumanGeneTherapy(人基因疗法)2:5-10；Cone等，1984，Proc.Natl.Acad.ki.USA(美国国家科学院学报)81:6349)。可以将重组腺病毒载体用于感染敏感宿主(例如，大鼠、仓鼠、狗和猩猩)中的广泛多样的细胞和组织(Hsu等，1992，J.InfectiousDisease(传染病杂志)，166:769)，并且还具有不需要有丝分裂活性细胞进行感染的优势。在本发明的DNA质粒或病毒载体中驱动dsRNA表达的启动子可以是真核生物RNA聚合酶I(例如，核糖体RNA启动子)、RNA聚合酶II(例如，CMV早期启动子或肌动蛋白启动子或UlsnRNA启动子)或优选地RNA聚合酶III启动子(例如，U6snRNA或7SKRNA启动子)或原核生物启动子，例如T7启动子，如果所述表达质粒也编码从T7启动子转录所需要的T7RNA聚合酶。所述启动子也可以将转基因表达定位于胰腺(见，例如，关于胰腺的胰岛素调节序列(Bucchini等，1986，Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)832511-2515))。此外，转基因的表达可以例如通过使用可诱导的调节序列和表达系统如对某些生理调节剂例如循环葡萄糖水平、或激素敏感的调节序列(Docherty等，1994，FASEBJ.820-24)进行精确地调节。适合控制细胞或哺乳动物中的转基因表达的这些可诱导的表达系统包括通过蜕皮素、通过雌激素、通过孕激素、通过四环素、通过二聚作用的化学诱导剂以及通过异丙基-β-Dl-硫代半乳糖吡喃糖苷(EPTG)进行调节。本领域技术人员能够基于dsRNA转基因的意欲应用选择适合的调节/启动子序列。优选地，能够表达dsRNA分子的重组载体如下所述递送，并且在靶细胞中持续。备选地，可以使用提供dsRNA分子的瞬时表达的病毒载体。所述载体可以根据需要重复地进行施用。一旦被表达，所述dsRNAs结合靶RNA并且调节其功能或表达。表达dsRNA的载体的递送可以是全身性的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用从患者移出随后再引入患者的靶细胞，或通过允许引入到需要的靶细胞的任何其它手段进行。典型地，将dsRNA表达DNA质粒作为与阳离子脂质载体(例如，Oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(例如，Transit-TKO)的复合物转染到靶细胞中。本发明还预期在一周以上的时期内进行关于靶向单一A凝血因子VII基因或多种A凝血因子VII基因的不同区域的dsRNA-介导的击倒的多种脂质转染。可以使用多种不同的已知方法来监测本发明的载体向宿主细胞中的成功引入。例如，瞬时转染可以用报道分子来发信号，所述报道分子如荧光标记，如绿色荧光蛋白(GFP)。可以使用这样的标记来确保先体外后体内细胞的稳定转染，所述标记给转染的细胞提供对特定的环境因子的抗性(例如，抗生素和药物)，如潮霉素B抗性。下列详细的描述公开了怎样制备和使用dsRNA和包含dsRNA的组合物从而抑制靶凝血因子VII基因的表达，以及用于治疗由所述凝血因子VII基因的表达所导致的疾病和病症的组合物和方法。定义为了方便，在下面提供在说明书、实施例和后附的权利要求中所用的某些术语和短语的含义。如果该术语在本说明书的其它部分中的使用和其在本小节中提供的定义之间有明显的歧义，则以在本小节的定义为准。“G，““C，““A"，“U"和“T”或“dT”分别地，每种一般代表分别包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶和脱氧胸苷作为碱基的核苷酸。然而，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指修饰的核苷酸，如下进一步详述，或替代置换结构部分。包含所述置换结构部分的序列是本发明的实施方案。如下所述，本文所述的dsRNA分子也可以包含“突出端”，即未配对的悬垂的核苷酸，其不直接包含在正常情况下由本文定义的“有义链”和“反义链”对形成的RNA双螺旋结构内。通常，这样的悬垂序列在3’端包含脱氧胸苷核苷酸，在大多数实施方案中，包含2脱氧胸苷。所述突出端将在下面详细描述和举例说明。术语“凝血因子VII”或“FVII”用于本文时，特别涉及凝固作用凝血因子VII，其在以前描述为“前转变素”或“血清凝血酶原转化加速剂”并且所述术语涉及相应的基因，编码的mRNA，编码的蛋白/多肽及其功能片段。术语“凝血因子VII基因/序列”不仅涉及野生型序列，还涉及包含在所述基因/序列内的突变和变更。因此，本发明不限于本文提供的特定的dsRNA分子。本发明还涉及包含这样的反义链的dsRNA分子，所述反义链与包含这样的突变/变更的凝血因子VII基因的RNA转录体的相应核苷酸序列至少85%互补。用于本文时，“靶序列”指在凝血因子VII基因的转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。用于本文时，术语“包含链的序列”指包含核苷酸链的寡核苷酸，其由使用标准核苷酸命名法所提及的序列描述。然而，如本文所述时，所述“包含链的序列”也可以包含修饰，如修饰的核苷酸。用于本文时，并且除非另外指出，术语“互补的”，当用于与第二核苷酸序列相关描述第一核苷酸序列时，指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力。用于本文时，“互补”序列也可以包括非-沃森-克里克碱基对和/或从非天然的和修饰的核苷酸形成的碱10基对，或完全由其形成，只要满足了上述关于它们杂交能力的要求。被称为“完全互补”的序列包括在第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的完整长度上，包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。然而，当在本文称第一序列与第二序列为“基本互补”时，所述两条序列可以完全互补，或它们在杂交后可以形成一个以上，但是优选地不超过4个，3个或2个不匹配的碱基对。在本文术语“互补的”，“完全互补的”和“基本互补的”可以关于在dsRNA的有义链和反义链之间，或在dsRNA的反义链和靶序列之间的碱基配对使用，如从它们使用的情形中所理解的。术语“双链RNA”或“dsRNA”，用于本文时，指这样的核糖核酸分子或核糖核酸分子复合物，其具有包含两条反向平行并且基本互补的核酸链的双链体结构。形成所述双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或它们可以是单独的RNA分子。如果两条链是一个较大分子的部分，并且因此通过形成双链体结构的在一条链的3’-端和各自的另一条链的5’-端之间的连续核苷酸链连接时，将所述连接RNA链称为“发夹环”。如果两条链通过除了形成双链体结构的在一条链的3’-端和各自的另一条链的5’-端之间的连续的核苷酸链之外的其它方式共价连接时，将所述连接结构称为“接头”。所述RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。除了双链体结构之外，dsRNA可以包含一个或多个核苷酸突出端。在所述“突出端”中的核苷酸可以包含0-5个核苷酸，其中“0”意为没有形成“突出端”的另外的核苷酸，而“5”意为在dsRNA双链体的每条链上的5个另外的核苷酸。这些任选的“突出端”位于每条链的3’端。如下所详述，仅在两条链中的一条中包含“突出端”的dsRNA分子也可以是有用的，并且甚至在本发明的情形中是有利的。所述“突出端”优选地包含0-2个核苷酸。最优选地，在dsRNA的两条链的3’端可见2个“dT”(脱氧胸苷)核苷酸。因此，“核苷酸突出端”指当dsRNA的一条链的3'-端延伸出另一条的5'-端时，或反之亦然，从dsRNA的双链体结构突出的未配对的一个或多个核苷酸。“平的”或“平端”意为在dsRNA的该末端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。“平端”dsRNA是在其完整长度上都是双链，即在所述分子的任一端都没有核苷酸突出端。术语“反义链”指这样的dsRNA链，其包含与靶序列基本互补的区域。用于本文时，术语“互补性区域”指与序列，例如靶序列基本互补的反义链上的区域。如果互补性区域未与所述靶序列充分互补，则错配最常见于末端区域中，并且其如果存在，优选地存在于末端一个或多个区域中，例如在5’和/或3’末端的6，5，4，3，或2个核苷酸内。术语“有义链”用于本文时，指包含与反义链的区域基本互补的区域的dsRNA的链。“基本互补的”意为优选地在有义链和反义链中的重叠核苷酸的至少85%是互补的。“引入细胞中”，当涉及dsRNA时，意为促进摄取或吸收到细胞中，如由本领域技术人员所理解的。dsRNA的吸收或摄取可以通过独立的扩散性或主动的细胞过程，或通过辅助试剂或装置来进行。该术语的含义不限于体外细胞；dsRNA也可以“被引入细胞中”，其中所述细胞是活生物体的部分。在这样的情形中，引入细胞中包括递送到生物体中。例如，对于体内递送，可以将dsRNA注射到组织位点或全身性施用。例如，设想将本发明的dsRNA分子施用于需要医疗干预的受试者。这样的施用可以包括将本发明的dsRNA、载体或细胞注射到所述受试者的患病侧，例如注射到肝组织/细胞或注射到癌组织/细胞，如肝癌组织中。然而，还设想在患病组织紧邻处的注射。体外引入细胞中包括本领域已知的方法如电穿孔和脂转染。术语“沉默”，“抑制…的表达”和“击倒”，只要它们涉及凝血因子VII基因，在本文都是指至少部分抑制凝血因子VII基因的表达，如通过可以从第一细胞或细胞组(其中凝血因子VII基因被转录并且已经进行了处理从而使凝血因子VII基因的表达被抑制)分离的凝血因子VII基因转录的mRNA与第二细胞或细胞组(基本与第一细胞或细胞组相同，但是其没有进行处理(对照细胞))比较在量上的减少所证实的。抑制的程度通常用下式表示(在对照细胞中的mRNAM在处理的细胞中的mRNA)_·100%(在对照细胞中的mRNA)备选地，抑制的程度可以根据与凝血因子VII基因转录函数相关的参数的减少来确定，所述参数例如是由细胞分泌的由凝血因子VII基因编码的蛋白的量，或显示某些表型的细胞的数量。如在本文提供的后附的实施例和后附的表中所举例说明的，本发明的dsRNA分子在体外测定法中，即在体外能够抑制人凝血因子VII的表达达至少约70%。在另一个实施方案中，本发明的dsRNA分子能够抑制豚鼠凝血因子VII的表达达至少70%，这也导致体内显著的抗血栓形成作用。本领域技术人员能够容易地确定这样的抑制率以及相关作用，特别是与本文提供的测定法结合。例如在附表1，特别是在1-13行中提供特别优选的dsRNA(其中提供的有义链和反义链序列以5’到3’取向)。术语“脱靶(off-target)”用于本文时指由在计算机芯片上(insilico)方法基于序列互补性预期与所述dsRNAs杂交的转录组的所有非靶mRNAs。本发明的dsRNAs优选地特异性抑制凝血因子VII的表达，即不抑制任何脱靶的表达。术语“半衰期”用于本文时，是化合物或分子的稳定性的量度，并且可以通过本领域技术人员已知的方法进行评估，尤其是结合本文提供的测定法进行评估。术语“非免疫刺激性”用于本文时，指本发明的dsRNA分子缺乏对免疫应答的任何诱导。确定免疫应答的方法是本领域技术人员公知的，例如通过评估细胞因子的释放进行，如本文实施例部分所述。术语〃治疗(treat)"，“治疗(treatment)"，等在本发明的情形中，意指涉及凝血因子VII表达的疾病，如血栓栓塞性疾病/病症、炎症或增生性疾病的减轻或缓和。用于本文时，“药物组合物”包含药用有效量的dsRNA和药用载体。然而，所述“药物组合物”也可以包含所述dsRNA分子的每条链或本文所述的包含与编码包含在本发明的dsRNAs中的有义链或反义链的至少一条链的核苷酸序列可操纵连接的调节序列的载体。还设想，可以将表达或包含本文定义的dsRNAs的细胞、组织或分离的器官用作“药物组合物”。用于本文时，“药用有效量，”“治疗有效量”或简单地，“有效量”指有效产生意欲的药理学、治疗或预防结果的RNA的量。12[0069]术语“药用载体”指施用治疗剂的载体。所述载体包括，但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。术语特别排除了细胞培养基。关于口服施用药物，药用载体包括，但不限于药用赋形剂，如本领域技术人员已知的惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、风味剂、着色剂和防腐剂。特别设想药用载体允许全身施用本发明的dsRNAs，载体或细胞。而除了设想肠道施用之外，肠胃外施用以及透皮或透粘膜(例如吹入、颊含、阴道、直肠)施用以及吸入药物也是向需要医疗干预的患者施用本发明的化合物的便利方式。当使用肠胃外施用时，这可以包括将本发明的化合物直接注射到患病组织或至少注射在其紧邻处。然而，本发明化合物的静脉内、动脉内、皮下、肌内、腹膜内、皮内、鞘内和其它施用也在技术人员，例如主治医师的技术之内。关于肌内、皮下和静脉内应用，本发明的药物组合物通常在被缓冲到适合的PH和等渗性的无菌水溶液或混悬液中提供。在优选的实施方案中，载体只由缓冲水溶液组成。在该情形中，“只”意指无可能影响或介导dsRNA在表达凝血因子VII基因的细胞中的摄取的辅助试剂或包封物质存在。根据本发明的水性混悬液可以包括悬浮剂如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚乙烯-吡咯烷酮和黄芪胶，和湿润剂如卵磷脂。用于水性混悬液的适合的防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。根据本发明使用的药物组合物还包括包封的制剂以保护dsRNA免于被身体快速去除，如控制释放的制剂，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备所述制剂的方法对于本领域技术人员是显而易见的。还可以将脂质体混悬液用作药用载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法进行制备，例如如在PCT公开WO91/06309中所述，将其结合在本文作为参考。用于本文时，“转化的细胞”是其中引入了至少一种载体的细胞，dsRNA分子或所述dsRNA分子的至少一条链可以在其中表达。所述载体优选地是包含调节序列的载体，所述调节序列与编码包含在本发明的dsRNAs中的有义链或反义链的至少一条的核苷酸序列可操纵地连接。可以合理地预期包含在一端或两端仅减去数个核苷酸的表1和4的序列之一的更短dsRNAs与上述dsRNAs比较可以具有类似的效果。如上指出，在本发明的大多数实施方案中，本文提供的dsRNA分子包含约16-约30个核苷酸的双链体长度(即没有“突出端”)。特别有用的dsRNA双链体长度是约19-约25个核苷酸。最优选的是具有19个核苷酸长度的双链体结构。在本发明的dsRNA分子中，所述反义链与有义链至少部分互补。本发明的dsRNA可以包含与靶序列的一个或多个错配。在优选的实施方案中，本发明的dsRNA包含不超过3个错配。如果dsRNA的反义链包含与靶序列的错配，那么优选地，错配区不位于互补性区域的中心。如果dsRNA的反义链包含与靶序列的错配，那么优选地，所述错配局限于末端区域，优选地在5’和/或3’末端的6，5，4，3或2个核苷酸内。例如，关于与凝血因子VII基因的区域互补的23个核苷酸dsRNA链，所述dsRNA优选地不包含在中央13核苷酸中的任何错配。如上提及，所述dsRNA的至少一个末端/链可以具有1-5个，优选地1或2个核苷酸的单链核苷酸突出端。与它们的平端对应物相比，具有至少一个核苷酸突出端的dsRNAs具有出人意料的优越的抑制性质。而且，发明人发现仅一个核苷酸突出端的存在加强了dsRNA的干扰活性，而不会影响其总的稳定性。仅具有一个突出端的dsRNA已经证实了在体内，以及在多种细胞、细胞培养基、血液和血清中是特别稳定和有效的。优选地，单链突出端位于反义链的3'-端末端，或备选地，位于有义链的3'-端末端。dsRNA也可以具有平末端，其优选地位于反义链的5’-端。优选地，所述dsRNA的反义链在3’端具有核苷酸突出端，并且5’-端是平的。在另一个实施方案中，在突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯取代。还可以对本发明的dsRNA进行化学修饰以增强稳定性。可以通过本领域充分建立的方法合成和/或修饰本发明的核酸，如在〃Currentprotocolsinnucleicacidchemistry(目前在核酸化学中的方案)〃，Beaucage，S.L.等(Edrs.)，JohnWiley&Sons,Inc.，NewYork,NY,USA中所述的那些，将其特此结合在本文作为参考。化学修饰可以包括，但不限于2’修饰，引入非天然碱基、与配体共价连接和用硫代磷酸酯连接取代磷酸酯连接。在该实施方案中，双链体结构的完整性被至少一个，优选地两个化学连接所加强。化学连接可以通过多种公知的技术的任一种来实现，例如通过引入共价键、离子键或氢键；通过疏水相互作用、范德华相互作用或堆积相互作用(stackinginteractions)；通过金属-离子配位的方式，或通过使用嘌呤类似物来实现。优选地，可以用于修饰dsRNA的化学基团包括，但不限于亚甲蓝、双官能基团，优选地双-(2-氯乙基)胺；N-乙酰基N'-(ρ-乙醛酰苯甲酰)胱胺；4-硫代尿嘧啶；和补骨脂素。在一个优选的实施方案中，所述接头是六甘醇接头。在该情形中，所述dsRNA通过固相合成产生，并且所述六甘醇接头根据标准方法(例如，，Williams，D.J.，和K.B.Hall，Biochem.(1996)35:14665-14670)结合。在具体的实施方案中，反义链的5'-端和有义链的3'-端通过六甘醇接头化学连接。在另一个实施方案中，dsRNA的至少一个核苷酸包含硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯基团。在dsRNA的末端的化学键优选地通过三股螺旋键形成。在某些实施方案中，化学键可以通过一个或多个键合基团形成，其中所述键合基团优选地是聚-(氧基磷酸亚基氧基-1，3-丙二醇)-和/或聚乙二醇链。在其它实施方案中，化学键也可以通过被引入双链结构中取代嘌呤的嘌呤类似物的方式来形成。在其它实施方案中，化学键可以通过被引入双链结构中的氮杂苯单位(azabenzeneunits)来形成。在另一些实施方案中，化学键可以通过被引入双链结构中的核苷酸的替代物-支链核苷酸类似物来形成。在某些实施方案中，化学键可以由紫外线诱导。在又一个实施方案中，在两条单链的一条或两条处的核苷酸可以被修饰从而防止或抑制细胞酶，例如某些核酸酶的激活。用于抑制细胞酶的激活的技术是本领域已知的，包括，但不限于，2’-氨基修饰、2’-氨基糖修饰、2’-F糖修饰、2’-F修饰、2’-烷基糖修饰、不带电荷的骨架修饰、吗啉代修饰、2’-0-甲基修饰和氨基磷酸酯(见，例如，Wagner，Nat.Med.(1995)1:1116-8)0因此，在dsRNA上的核苷酸的至少一个2，-羟基被化学基团取代，优选地被2’-氨基或2’-甲基取代。此外，可以将至少一个核苷酸进行修饰从而形成锁定核苷酸。所述锁定核苷酸包含亚甲基桥接，其连接核糖的2’-氧与核糖的4’-碳。将锁定核苷酸引入寡核苷酸中改善了对于互补序列的亲和性，并且将解链温度提高了几度。本文提供的dsRNA分子的修饰可以正向影响它们的体内以及体外稳定性并且还可以改善它们向(患病的)靶侧的递送。此外，所述结构和化学修饰可以正向影响针对施用后的dsRNA分子的生理反应，例如优选地被抑制的细胞因子释放。这些化学和结构修饰是本领域中已知的，并且特别在NawrotQ006)CurrentTopicsinMedChem，6，913-925中举例说明。配体与dsRNA的缀合可以增强其细胞吸收以及向特定的组织的靶向。在某些情形中，将疏水配体与所述dsRNA缀合以促进细胞膜的直接渗透。备选地，与dsRNA缀合的配体是受体-介导的内吞作用的底物。已经将这些方案用于促进反义寡核苷酸的细胞渗透。例如，已将胆固醇与各种反义寡核苷酸缀合，导致形成这些的化合物，其与它们的非缀合类似物比较具有实质上更强的活性。见M.ManoharanAntisense&NucleicAcidDrugDevelopment反义和核酸药物开发)2002，12，103。已缀合于寡核苷酸的其它亲脂性化合物包括1-芘丁酸、1，3-双-0-(十六烷基)甘油和甲醇。用于受体介导的内吞作用的配体的一个实例是叶酸。叶酸通过叶酸-受体-介导的内吞作用进入细胞。携带叶酸的dsRNA化合物将通过叶酸-受体介导的内吞作用有效地被运输进入细胞。将叶酸连接于寡核苷酸的3，-末端导致寡核苷酸的增加的细胞摄取(Li，S.；Deshmukh,H.M.；Huang,L.Pharm.Res.1998，15，1540)。已经被缀合于寡核苷酸的其它配体包括聚乙二醇、碳水化合物簇、交联剂、吓啉缀合物和递送肽。在某些情形中，阳离子配体与寡核苷酸的缀合通常导致对核酸酶的提高的抗性。阳离子配体的代表性实例是丙基铵和二甲基丙基铵。有趣的是，当阳离子配体分散到整个寡核苷酸中时，反义寡核苷酸被报道保持了它们对于mRNA的高结合亲和性。见M.ManoharanAntisense&NucleicAcidDrugDevelopment(反义禾口核酸药物开发)2002，12，103以及其中的参考文献。本发明的配体-缀合的dsRNA可以通过使用这样的dsRNA进行合成，所述dsRNA具有悬垂(pendant)的反应官能度(functionality)，如由连接分子连接到dsRNA上所衍生的那些官能度。这种反应性寡核苷酸可以直接与商购配体、具有多种保护基的任一种的合成的配体或具有连接于其上的连接结构部分的配体进行反应。本发明的方法在一些优选的实施方案中，通过使用这样的核苷单体来促进配体-缀合的dsRNA合成，所述核苷单体已经适当地与配体缀合并且可以进一步连接于固体-支持物物质。任选地与固体-支持物物质连接的这些配体-核苷缀合物根据本发明方法的一些优选实施方案，通过选定的血清-结合配体与位于核苷或寡核苷酸5'位置上的连接结构部分的反应进行制备。在某些情形中，具有连接于dsRNA的3’-末端的芳烷基配体的dsRNA通过首先将单体结构单元与可控孔度玻璃支持物通过长链氨基烷基基团进行共价连接来进行制备。接着，将核苷酸通过标准的固相合成技术与结合于固体支持物的单体结构单元结合。单体结构单元可以是核苷或其它与固相合成相容的有机化合物。在本发明的缀合物中所用的dsRNA可以通过固相合成的公知技术方便和常规地制备。还已知使用类似的技术来制备其它的寡核苷酸，如硫代磷酸酯和烷基化的衍生物。关于特定修饰的寡核苷酸的合成技术可以见于下列美国专利美国专利号5，218，105，涉及多胺缀合的寡核苷酸；美国专利号5，541,307，涉及具有修饰的骨架的寡核苷酸；美国专利号5，521，302，涉及用于制备具有手性磷连接的寡核苷酸；美国专利号5，539，082，涉及肽核酸；美国专利号5，554，746，涉及具有β-内酰胺骨架的寡核苷酸；美国专利号5，571，902，涉及用于合成寡核苷酸的方法和物质；美国专利号5，578，718，涉及具有烷硫基的核苷，其中所述基团可以用作针对在核苷的多个位置中任一处连接的其它结15构部分的接头；美国专利号5，587，361，涉及具有高手性纯度的硫代磷酸酯连接的寡核苷酸；美国专利号5，506，351，涉及制备2'_0_烷基鸟苷和相关化合物(包括2，6_二氨基嘌呤化合物)的工艺；美国专利号5，587，469，涉及具有N-2取代的嘌呤的寡核苷酸；美国专利号5，587，470，涉及具有3-脱氮嘌呤的寡核苷酸；美国专利号5，608，046，两者都涉及缀合的4'-脱甲基核苷类似物；美国专利号5，610，观9，涉及骨架修饰的寡核苷酸类似物；美国专利号6，262,M1，特别涉及合成2'-氟-寡核苷酸的方法。在本发明的具有序列-特异性连接的核苷的配体-缀合的dsRNA和配体-分子中，所述寡核苷酸和寡核苷可以使用标准的核苷酸或核苷前体或已经具有连接结构部分的核苷酸或核苷缀合物前体，已经具有配体分子的配体-核苷酸或核苷-缀合物前体，或具有结构单元的非核苷配体，在适合的DNA合成仪上进行装配。当使用已经具有连接结构部分的核苷酸-缀合物前体时，序列特异性连接的核苷的合成典型地完成，并且接着将配体分子与连接结构部分反应以形成配体-缀合的寡核苷酸。已经在前描述了具有多种分子如类固醇、维生素、脂质和报道分子的寡核苷酸缀合物(见Manoharan等，PCT申请WO93/07883)。在优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过使用衍生自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺以及商购的亚磷酰胺，在自动合成仪上合成。在寡核苷酸的核苷中结合2'-0-甲基、2'-0-乙基、2'_0_丙基、2'_0_烯丙基、2'-0-氨基烷基或2'-脱氧-2'-氟基团给所述寡核苷酸赋予增强的杂交性质。此外，包含硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸具有增强的核酸酶稳定性。因此。本发明的官能化，连接的核苷可以被加强以包含任一或两种的硫代磷酸酯骨架，或2'-0-甲基、2'-0-乙基、2'-0-丙基、2'-0-氨基烷基、2'-0-烯丙基或2'-脱氧-2'-氟基团。在一些优选的实施方案中，在5'-末端具有氨基基团的本发明官能化核苷序列使用DNA合成仪进行制备，并且接着将其与选定配体的活化酯衍生物反应。活化酯衍生物是本领域技术人员公知的。代表性活化酯包括N-氢琥珀酰亚胺酯、四氟酚酯、五氟酚酯和五氯酚酯。氨基基团与活化酯的反应产生这样的寡核苷酸，其中所述选定的配体与5'-位置通过连接基团连接。在5'-末端的氨基基团可以使用5'-氨基-改性物C6试剂进行制备。在优选的实施方案中，配体分子可以通过使用配体-核苷亚磷酰胺缀合于寡核苷酸的5'-位置，在所述配体-核苷亚磷酰胺中配体通过接头直接或间接连接于5'-羟基基团。所述配体-核苷亚磷酰胺典型地在自动合成程序结束时使用从而提供在5'-末端具有配体的配体-缀合的寡核苷酸。在本发明方法的一个优选的实施方案中，选择在其上构建配体分子的适合的前体分子开始制备配体缀合的寡核苷酸。典型地，所述前体是常用核苷的适当保护的衍生物。例如，用于合成本发明的配体-缀合的寡核苷酸的合成前体包括，但不限于2'-氨基烷氧基-5'-ODMT-核苷，2'-6-氨基烷基氨基-5'-ODMT-核苷，5'_6_氨基烷氧基-2'-脱氧-核苷，5'-6-氨基烷氧基-2-保护的-核苷，3'-6-氨基烷氧基-5'-ODMT-核苷，和可以在分子的核苷碱基部分被保护的3'-氨基烷基氨基-5'-ODMT-核苷。合成所述氨基-连接保护的核苷前体的方法是本领域那些技术人员已知的。在许多情形中，在制备本发明化合物的过程中使用保护基。用于本文时，术语"保护的"意为指定的结构部分具有附着于其上的保护基。在本发明的一些优选实施方案中，化合物包含一个或多个保护基。可以将广泛多样的保护基用于本发明的方法中。通常，保护基使化学官能度对于特定的反应条件呈惰性，并且其可以附着于分子中的所述官能度或从其中去除，而不会明显损害分子的其它部分。代表性羟基保护基，以及其它代表性保护基在Greene和mits，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(在有机合成中的保护基)，第2章，第2版，JohnWiley&Sons,NewYork,1991,禾口OligonucleotideAndAnaloguesAPracticalApproach(寡核苷酸禾口类似物，一种实践的方法)，Ekstein,F.Ed.，IRLPress,N.Y，1991中公开。对于酸处理稳定的氨基-保护基选择性地用碱处理去除，并且用于制备选择性进行取代的反应性氨基。所述基团的实例是Fmoc(E.Atherton和R.C.Sheppard在ThePeptides(Ii)中，S.Udenfriend,J.Meienhofer,编辑，AcademicPress,Orlando,1987,卷9，p.1)以及由Nsc基团作为举例的各种取代的磺酰基乙基氨基甲酸酯(Samukov等，TetrahedronLett.(四面体通讯)，1994,35:7821。另外的氨基-保护基包括，但不限于氨基甲酸酯保护基，如2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(Teoc)U-甲基-1-(4-联苯基)乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9_芴基甲氧基羰基(Fmoc)和苄氧基羰基(Cbz)；酰胺保护基，如甲酰基、乙酰基、三卤代乙酰基、苯甲酰基和硝基苯基乙酰基；磺酰胺保护基，如2-硝基苯磺酰基；和亚胺和环状二酰亚胺保护基如，苯二甲酰亚氨基和二硫代琥珀酰基。这些氨基-保护基的等价物也涵盖在本发明的化合物和方法中。许多固体支持物是商购的，并且本领域技术人员可以容易地选择固体支持物用于固相合成步骤中。在某些实施方案中，使用通用的支持物。通用的支持物允许制备具有位于寡核苷酸的3’-末端的罕见或修饰的核苷酸的寡核苷酸。关于通用支持物的进一步详1"青见Scott等，InnovationsandPerspectivesinsolid-phaseSynthesis(在固才目合成中的创新和远景)，第3届国际讨论会，1994，编辑RogerEpton，MayflowerWorldwide,115-124]。此外，已经报道当寡核苷酸通过更容易进行碱性水解的syn-l，2-乙酰氧基磷酸酯基团结合于固体支持物时，所述寡核苷酸可以在更温和的反应条件下从通用支持物上裂解下来。见Guzaev，Α.I.；Manoharan，M.J.Am.Chem.Soc.2003，125，2380。核苷通过含磷或不含磷的共价核苷间连接进行连接。为了鉴定的目的，所述缀合的核苷可以表征为具有配体的核苷或配体-核苷缀合物。在它们的序列中具有缀合于核苷的芳烷基配体的连接的核苷当与未缀合的类似dsRNA化合物比较时显示增强的dsRNA活性。本发明的芳烷基-配体-缀合的寡核苷酸还包括寡核苷酸和连接的核苷的缀合物，其中所述配体直接连接于核苷或核苷酸，而不需要中间存在接头基团。配体可以优选地在配体的羧基、氨基或氧代基团通过连接基团连接。典型的连接基团可以是酯、酰胺或氨基甲酸酯基团。设想用于本发明的配体-缀合的寡核苷酸中的优选修饰的寡核苷酸的具体实例包括包含修饰的骨架或非天然核苷间连接的寡核苷酸。如本文定义，具有修饰的骨架或核苷间连接的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。对于本发明的目的，在它们的糖间骨架间不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以被认为是寡核苷。17[0098]在下面描述特定的寡核苷酸化学修饰。不需要对于给定化合物中的所有位置进行均一地修饰。相反地，可以将一个以上的修饰插入单一dsRNA化合物中，或甚至插入其单一核苷酸中。优选修饰的核苷间连接或骨架包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯，氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氛基憐酸酉旨(thionophosphoramidates)、it撰烧基月粦酸酉旨(thionoalkylphosphonates)、硫羰烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)和具有正常3'-5'连接的硼烷磷酸酯(boranophosphates)，这些的2'-5'连接的类似物，和具有反向极性的那些，其中核苷单位的邻近对是3'-5'与5'-3'连接或2'-5'与5'-2'连接。还包括各种盐、混合的盐以及游离酸形式。涉及制备上述含磷原子的连接的代表性美国专利包括，但不限于美国专利号4，469，863；5，023，243；5，264，423；5，321，131；5，399，676；5，405，939；5，453，496；5，455，233和5，466，677，将其每个结合在本文作为参考。其中不包含磷原子的优选修饰的核苷间连接或骨架(即寡核苷)具有由短链烷基或环烷基糖间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间连接或一个或多个短链杂原子或杂环糖间连接形成的骨架。这些包括具有吗啉代连接(由核苷的糖部分部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；包含链烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基胼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架的那些；和具有混合的N，0，S和CH2成分的其它种类。涉及制备上述寡核苷的代表性美国专利包括，但不限于美国专利号5，034，506；5，214，134；5，216，141；5，264，562；5，466，677；5，470，967；5，489，677；5，602，240和5，663，312，将其每个结合在本文中作为参考。在其它优选的寡核苷酸模拟物中，将核苷单位的糖和核苷间连接，即骨架两者都用新基团替换。保持核苷碱基单位用于与适合的核酸靶化合物的杂交。将已经显示具有优越的杂交性质的一种这样的寡核苷酸，寡核苷酸模拟物称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，将寡核苷酸的糖骨架用包含酰胺的骨架，具体地氨基乙基甘氨酸骨架替换。核苷碱基保留并直接或间接与骨架的酰胺部分的原子结合。关于PNA化合物的教导可以见于例如美国专利号5，539，082中。本发明的一些优选实施方案使用具有硫代磷酸酯连接的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷，并且具体为上述提及的美国专利号5，489，677的--CH2--NH--O--CH2-,-CH2—N(CH3)—O-CH2-[已知为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]，一CH2-O--N(CH3)-CH2--，-CH2-N(CH3)—N(CH3)-CH2-和一0—N(CH3)-CH2-CH2-[其中天然的磷酸二酯骨架表示为--O--P--O--CH2--]，以及上述提及的美国专利号5，602，240的酰胺骨架。还优选具有在上述美国专利号5，034，506中的吗啉代骨架结构的寡核苷酸。在本发明的配体-缀合的寡核苷酸中使用的寡核苷酸可以另外或备选地包含核苷碱基(经常在本领域中简称为“碱基”)修饰或取代。用于本文时，“未修饰的"或"天然的"核苷碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核苷碱基包括其它合成的和天然核苷碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟基甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-烷硫基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代具体地5-溴，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核苷碱基包括在美国专利号3，687，808中公开的那些，在ConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering(聚合物科学和工程化的简明百科全书)，858-859页，Kroschwitz，J.I.，编辑JohnWiley&Sons，1990中公开的那些，由Englisch等，AngewandteChemie,InternationalEdition,1991，30，613公开的那些，和由Sanghvi,Y.S.,第15章，AntisenseResearchandApplications(反义石if究禾口应用),289-302页，Crooke,S.T.和Lebleu，B.，编辑，CRCPress,1993公开的那些。这些核苷碱基中的某些种类特别用于增加本发明的寡核苷酸的结合亲和性。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2，N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示增加核酸双链体稳定性达0.6-1.2°C(Id.,276-278页)并且是目前优选的碱基取代，当与2'-甲氧基乙基糖修饰结合时是更特别优选的。涉及制备某些上述指出的修饰的核苷碱基以及其它修饰的核苷碱基的代表性美国专利包括，但不限于上述指出的美国专利号3，687，808，以及美国专利号5，134，066；5，459，255；5,552，540；5,594，121和5，596，091，将其全部特此并入本文作为参考。在某些实施方案中，在本发明的配体-缀合的寡核苷酸中使用的寡核苷酸可以另外或备选地包含一个以上取代的糖结构部分。优选的寡核苷酸在2'位置包含下列之一OH；F；0-,S-,或N-烷基，0-，S-,或N-烯基，或0，S-或N-炔基，其中所述烷基，烯基和炔基可以是取代或未被取代的C1-Cltl烷基或C2-Cltl烯基和炔基。特别优选0[(CH2)n0]mCH3,0(CH2)n0CH3，0(CH2)nNH2，0(CH2)nCH3，0(CH2)η0ΝΗ2，和0(CH2)n0N[(CH2)nCH3)]2，其中η和m是1-约10。其它优选的寡核苷酸在2'位置包含下列之一C1到Cltl低级烷基，取代的低级烷基，烷芳基，芳烷基，0-烷芳基或0-芳烷基，SH,SCH3,OCN，Cl，Br,CN,CF3,OCF3,SOCH3,SO2CH3,ONO2,NO2,N3,NH2,杂环烷基，杂环烷芳基，氨基烷基氨基，聚烷基氨基，取代的甲硅烷基，和RNA裂解基团，报道基团，嵌入剂，用于改善寡核苷酸药物代谢动力学性质的基团，或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团，和具有类似性质的其它取代基。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基[2'-O-CH2CH2OCH3,也称为2'_0_(2-甲氧基乙基)或2‘_M0E]，g卩，烷氧基烷氧基基团。其它优选的修饰包括2'其它优选的修饰包括2'-甲氧基O'-O-CH3),2‘-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-F)。还可以在寡核苷酸上的其它位置上进行类似的修饰，特别是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置，或在2'-5'连接的寡核苷酸中。[0110]用于本文时，术语"糖取代基"或"2'-取代基基团"包括具有或不具有氧原子的连接于呋喃核糖基结构部分的2'-位置的基团。糖取代基包括，但不限于氟，0-烷基，0-烷基氨基，0-烷基烷氧基，保护的0-烷基氨基，0-烷基氨基烷基，0-烷基咪唑，和式(0-烷基)m的聚醚，其中m是1-约10。在这些聚醚中特别优选直链和环状聚乙二醇(PEGs)，以及包含(PEG)的基团，如冠醚，和特别地由Delgardo等公开的那些(CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems(在治疗药物载体系统中的关键综述)1992，9:249)，将其完整内容结合在本文作为参考。另外的糖修饰由CooHAnti-fibrosisDrugDesign(抗纤维变性药物设计)，1991，6=585-607)公开。氟，0-烷基，0-烷基氨基，0-烷基咪唑，0-烷基氨基烷基，和烷基氨基取代在题为〃OligomericCompoundshavingPyrimidineNucleotide(s)with2'and5'Substitutions(具有含有2‘和5'取代的嘧啶核苷酸的低聚化合物)的美国专利6，166，197中描述，将其全部内容结合在本文作为参考。本发明可使用的其它糖取代基基团包括2'-SR和2'412基团，其中每个R独立地为氢、保护基或取代或未被取代的烷基、烯基或炔基。2'-SR核苷在美国专利号5，670，633中公开，将其全部内容结合在本文作为参考。2'-SR单体合成子的结合由Hamm等(J.Org.Chem.，1997,62:3415-3420)公开。2‘-NR核苷由Goettingen,M.，J.Org.Chem.，1996，61,6273-6281；和Polushin等，^TetrahedronLett.(四面体通讯)，1996，37，3227-3230公开。本发明可使用的另外的代表性2‘_取代基团包括具有式I或式II之一的那些权利要求1.双链核糖核酸分子，其能够体外抑制凝血因子VII基因的表达达至少70%。2.权利要求1的双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子包含有义链和反义链，所述反义链与所述有义链至少部分互补，其中所述有义链包含这样的序列，所述序列与编码凝血因子VII的mRNA的至少部分具有至少90%的同一性，其中所述序列(i)位于所述有义链与所述反义链的互补性区域中；和(ii)其中所述序列的长度少于30个核苷酸。3.权利要求1或2任一项的双链核糖核酸分子，其包含SEQIDNos:413，414，415，416，417，418，419，420，421，422，423，424，425，426，427，428，429，430，431，432，433，434，435，436,437和438的核苷酸1-19。4.权利要求3的双链核糖核酸分子，其中所述反义链还包含1-5个核苷酸长度的3’突出端，优选地1-2个核苷酸长度的3’突出端。5.权利要求3或4的双链核糖核酸分子，其中所述反义链的突出端包含尿嘧啶或与编码凝血因子VII的mRNA至少90%互补的核苷酸。6.权利要求3-5中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述有义链还包含1-5个核苷酸长度的3’突出端，优选地1-2个核苷酸长度的3’突出端。7.权利要求3-6中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述有义链的突出端包含尿嘧啶或与编码凝血因子VII的mRNA至少90%相同的核苷酸。8.权利要求1-7中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述有义链选自由在SEQIDNos413,415,417,419,421,423,425,427,429,431,433,435,^P437中描述的核酸序列组成的组，并且所述反义链选自由在SEQIDNos414,416，418，420，422，424，426，428，430，432，434，436和438中描述的核酸序列组成的组，其中所述双链核糖核酸分子包含选自由SEQIDNOs:413/414,415/416,417/418,419/420,421/422,423/424,425/426,427/428,429/430，431/432，433/434，435/436和437/438组成的组中的序列对。9.权利要求1-8中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子的至少一条链具有至少M小时的半衰期。10.权利要求1-9中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子是非免疫刺激性的。11.权利要求1-10中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子包含至少一个修饰的核苷酸。12.权利要求11的双链核糖核酸分子，其中所述修饰的核苷酸选自由下列各项组成的组中2'-0-甲基修饰的核苷酸，包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸，和与胆留醇衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸，2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸，2'-脱氧-修饰的核苷酸，锁定核苷酸，脱碱基核苷酸，2’-氨基-修饰的核苷酸，2’-烷基-修饰的核苷酸，吗啉代核苷酸，氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。13.权利要求11和12中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述修饰的核苷酸是2'-0-甲基修饰的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸和脱氧胸苷。14.权利要求1-13中任一项的双链核糖核酸分子，其中所述有义链选自由在SEQIDNos:1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23和25中描述的核酸序列组成的组，并且所述反义链选自由在SEQIDNos:2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24和26中描述的核酸序列组成的组，其中所述双链核糖核酸分子包含选自由SEQIDNOs1/2，3/4，5/6，7/8，9/10，11/12，13/14，15/16，17/18，19/20，21/22，23/24和25/26组成的组中的序列对。15.核酸序列，其编码包含在权利要求1-14中任一项所定义的双链核糖核酸分子中的有义链和/或反义链。16.载体，其包含调节序列或包含权利要求15的核酸序列，所述调节序列与编码包含在权利要求1-14中任一项所定义的双链核糖核酸分子中的有义链或反义链的至少一种的核苷酸序列可操纵地连接。17.细胞、组织或非人生物体，其包含权利要求1-14中任一项所定义的双链核糖核酸分子，权利要求15的核酸分子或权利要求16的载体。18.药物组合物，其包含权利要求1-14中任一项定义的双链核糖核酸分子，权利要求15的核酸分子，权利要求16的载体或权利要求17的细胞或组织。19.权利要求18的药物组合物，其还包含药用载体、稳定剂和/或稀释剂。20.抑制细胞、组织或生物体中凝血因子VII基因表达的方法，所述方法包括下述步骤(a)将权利要求1-14中任一项定义的双链核糖核酸分子，权利要求15的核酸分子，权利要求16的载体引入所述细胞、组织或生物体中；和(b)在足以获得凝血因子VII基因的mRNA转录体降解的时间内维持在步骤(a)中产生的细胞、组织或生物体，由此抑制凝血因子VII基因在所述细胞中的表达。21.治疗、预防或处理由FVII基因表达导致的病理性病症和疾病的方法，所述方法包括向需要所述治疗、预防或处理的受试者施用治疗有效量或预防有效量的权利要求1-14中任一项定义的双链核糖核酸分子，权利要求15的核酸分子，权利要求16的载体和/或权利要求18或19所定义的药物组合物。22.权利要求21的方法，其中所述受试者是人。23.权利要求1-14中任一项定义的双链核糖核酸分子，权利要求15的核酸分子，权利要求16的载体和/或权利要求18或19所定义的药物组合物，用于治疗血栓栓塞性病症/疾病、炎症或增生性疾病。24.权利要求1-14中任一项定义的双链核糖核酸分子，权利要求15的核酸分子，权利要求16的载体和/或权利要求17的细胞或组织用于制备药物组合物的应用，所述药物组合物用于治疗血栓栓塞性病症/疾病、炎症或增生性疾病。专利摘要本发明涉及用于抑制凝血因子VII基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)。本发明还涉及包含dsRNA或编码其的核酸分子或载体以及药用载体的药物组合物；使用所述药物组合物治疗由凝血因子VII基因的表达导致的疾病的方法；和用于抑制凝血因子VII在细胞中的表达的方法。文档编号C12N15/11GKCN102216457SQ200980145933公开日2011年10月12日申请日期2009年11月10日发明者帕梅拉·坦,比吉特·布拉姆利奇,汉斯-彼得·沃尔罗切尔,赖纳·康蒂恩,雅克·欣贝,马尔库斯·霍斯巴赫申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan