免疫偶联物的制作方法

专利名称：免疫偶联物的制作方法
所提请的发明涉及新型融合蛋白，它含有与肿瘤相关的靶向成分和一个生物活性配基。前者首选单克隆抗体或其片段。它可以识别一个优先在人肿瘤细胞如人表皮生长因子受体(EGFR)上表达的分子；后者从趋化因子蛋白组，最好从C-X-C族中选择。产生的融合蛋白可以转送生物活性配基到特定的靶细胞或组织中，这个新的免疫偶联物可被用于肿瘤治疗。
多种治疗概念已被用于对癌症患者的治疗中。过去，临床实验的进行使用可特异性或选择性识别表达于恶性细胞表面上的分子的单克隆抗体。这种方法的目的是诱导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)或补体介导的细胞毒性以消除肿瘤细胞。另一种方法是细胞素介导的免疫应答的激活作用。细胞素诱导的抗肿瘤活性可被如下介导(1)细胞素对肿瘤生长的直接的细胞毒性/细胞抑制作用(2)肿瘤抗原的非特异性机理，例如LAK活性或单核细胞/粒细胞介导的细胞毒性(3)由CD-4和CD-8阳性T-细胞介导的肿瘤抗原特异性免疫应答。
在这种情况下，一种抗肿瘤的系统免疫已在动物模型中观测到。
然而，高剂量细胞素的细胞毒性及原位存在量的不足引出了靶向肿瘤治疗的概念。靶向肿瘤治疗的原理是以靶分子，如对肿瘤相关抗原特异的单克隆抗体与生物活性效应分子的物理结合为基础的。由靶分子传递的效应分子应增加肿瘤中细胞素浓度并减少所需最大剂量。在动物模型中，已表明，由瘤内注射或被转染瘤细胞分泌作用而得到的细胞素在原位的存在可导致肿瘤细胞的消退(见综述Colombo and Forni，Inmmunology Today 1548-51，1994)。在这些系统中，细胞素不减弱肿瘤的增生，但具有激活一个快速，强力的抗肿瘤反应的能力。因此，效应分子和靶向成分的物理结合代表了一种降低生物活性配基的外周存在和增强其瘤内的可利用性的方式。而且，单个肿瘤细胞或微转移瘤也可被这些分子所定向。
抗体直接导向的生物活性配基应可直接或产生一个靶细胞致死环境素而诱导对靶细胞的破坏作用。这可由细胞素如IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-10，IL-13，IFNS，TNFα和CSFS来完成。这些细胞因子已被表明可直接或通过激活宿主防御机制间接地引起抗肿瘤作用(Mire-Sluis，TIBTECH 1174K—77，1993；Colombo etal.，Cancer Res.524853-4857,1992；Thomas & Balkwill，Phar-mac，Ther.52307-330，1991)。
然而，这些细胞素的绝大多数虽然可激活效应细胞，但对其没有或只有很弱的趋化活性，因此，当肿瘤组织中缺乏适量的效应细胞时，抗肿瘤活性会很弱。
然而，趋化因子对许多效应细胞是具趋化活性的，因而会提高其在肿瘤位点的存在量，其次，它们诱导了大量的效应细胞的功能(见例Miller and Krangel，1992)，“Biology and Biochemistry ofthe ChemokinesA Novel Family of Chemotactic and Inflammato-ry Cytokines”，Critical Reviews in Immunology 12，17)。
IL-8，MIP2α(也称作GRO-β)和MIP2β(GRO-γ)是C-X-C趋化因子总科的成员。它们作为趋化因子并激活效应细胞的各项功能。因此可代表最优的效应物。这个C-X-C趋化因子家族是一个最近被认为是小分子量(8-10KD)的蛋白质组，其氨基酸序列显示出20—50％的同源性并具有趋化和助类活性。IL-8具有一个极其确定的三维结构(Clore et al.，Biochemistry 291689-1696，1990)并与一些CXC趋化因子共有一个N-末端ELR基本结构。可以预期，由于CXC趋化因子中的序列因源性，其三维结构将会是非常相似的，这已经在MCAF/MCP-1的结构中得到证明(Gronenborn & CloreProt.Eng.4，263-269，1991)。
在溶液中，IL-8形成稳定的二聚物(Clore et al.，Biochemistry291689-1696，1990)，并且F(ab’)IL-8融合蛋白通过两个IL-8单体的相互作用而二聚成一个二价的免疫偶联物是可能的。这将增强融合蛋白与抗原的相互作用。
到目前已描述过的C-X-C组的成员主要作用于嗜中性粒细胞。基因定位于第四号染色体。这一组的成员是PF4，血小板基础蛋白，hIP10，IL-8，MIP2α和MIP2β。这些蛋白在中性粒细胞上的作用是趋化活性，脱颗粒作用和呼吸性突放(Sherry and Cerami，Currentoption in Immunology 356-60，1991；Oppenheim et al.，Annu.Rev.Immunol.9617-648，1991；Miller and Krangel，CriticalReviews in Immunology 1217-46 1992；Clark-Lewis et al.，J.Bi-ol.Chem.26623128—23134，1991)。
与C-C家族密切相关的趋化因子的成员主要作用于单核细胞。基因都定位于17号染色体。这些蛋白是LD78，Act-2，MCAF，1309和RANTES。这些分子在单核细胞上显示出强大的趋化活性，(Matsushima et al.，Chem.Immunol.51236-265，1992；Oppen-heim et al.，Annu.Rev.Immunol.9617-648，1991)。
表皮生长因子(EGF)是一种致表皮及上皮细胞有丝分裂的多肽激素。当EGF与敏感细胞相互作用时，它结合于膜受体(EGFR)。EGFR是一个大约170KD的跨膜糖蛋白，是Cerb-B原癌基因的基因产物。
鼠的单克隆抗体MAb425用来抗人A431肿瘤细胞系(ATCCCRL 1555)，并发现其结合于EGFR外部功能区的多肽表位。已经发现，它抑制EGF的结合，体外介导肿瘤细胞毒性，并且体外抑制上皮及直肠、结肠肿瘤源细胞系的肿瘤细胞的生长。MAb425的人化或嵌合体的转型从WO 92/15683得知。
因此，本发明的目的之一是制成这样一些抗体及其片段它包含有导向肿瘤细胞表面EGFR抗原的表位和对其效应细胞具有高度趋化活性，并因此导致低毒性靶向肿瘤治疗的生物活性配基。因此，这种免疫偶联物体现了类似的原有细胞素-抗体免疫偶联物的改进，在引起肿瘤溶解的能力方面二者具有相似的效果，但由于其趋化性质，在有效吸引效应细胞到特异性位点的能力方面与原偶联物不同。
本发明涉及一种融合蛋白，此蛋白把单克隆抗体的一部分，至少是抗原识别位点或识别EGFR表位的完整单克隆抗体和生物活性配基连接起来，该配基选自趋化因子族，优选C-X-C族，尤其是IL-8。编码这些蛋白的结构是通过DNA重组技术获得的。融合蛋白包括抗体重链的可变区和恒定区的CH1段(CH1-偶联物，Fab-片段)及合适的轻链，或者抗体重链的可变区和稳定区的CH1及CH2段，或者，抗体重链可变区和稳定区的CH1，CH2，CH3段，每一种情况下，各部位都融合在生物活性配基上。通过与合适轻链的共同表达，可以产生以抗原承载细胞为靶，并在体内转运活性配基到特异位点的融合蛋白。
与此类似，另一个免疫偶联物可由将趋化因子融合到抗体FV片段的C-末端而得到。这样的情况下，重、轻链可在一个多肽上表达，在此多肽上，两种成分通过合适的连接序列结合起来以确保抗原结合位点的适当折叠。不同的结构在

图1中表明。
免疫偶联物的表在产生新的分子，它们结合有两种功能首先它们以抗原承载细胞(EGFR)为靶，其次，它们在体内转运活性配基到特异位点。这些配基是强化学诱引剂和活性物质，并导致在肿瘤位点的效应细胞浸润，并可引起随后的肿瘤破坏作用。
通过使用本发明的免疫偶联物、肿瘤、如黑色素瘤、神经胶质瘤和癌可被检测出来并可在无大量一般毒性作用的情况下得到成功的治疗。
因此，本发明的目的之一是为了提供一个免疫偶联物，它含有一个单克隆抗体或其片断，它们可被导向带有表皮生长因子受体(EGFR)抗原决定基的肿瘤细胞；还含有融合于上述抗体或抗体片断的趋化因子蛋白配基。
有几组不同的趋化因子，如C-X-C和C-C趋化因子。
这样，依照本发明的优选方案是从C-X-C族中选择趋化因子。
在C-X-C族中，IL-8是本发明所倾向的选择。
因此，本发明的目的之一是提供一个免疫偶联物，其趋化因子选自C-X-C族并优选白细胞介素8(IL-8)。
依照本发明，可使用的抗体是完整的抗体或其片断。合适的片断是FVS，Fabs或F(ab’)2S(依照本申请用语为CH1抗体片断)，CH3和CH2抗体片段(图1)。优选方案为FVS，CH1-，CH2和CH3抗体片断。
因此，本发明的目的之一是提供一个免疫偶联物，其抗体是Fab片段或F(ab’2)片段，这些片段实质包括抗体重链的可变区，恒定区的CH1段及合适的轻链(抗体-CH1偶联物)。另一个免疫偶联物，其抗体是一个实质上包括抗体重链可变区，恒定区CH1和CH2段及合适轻链(抗体-CH2偶联物)的抗体片段，还有一个免疫偶联物，其抗体为一完整抗体，主要包括抗体重链的可变区，恒定区的CH1，CH2和CH3段及合适的轻链(抗体-CH3偶联物)，最后，还有一个免疫偶联物，其抗体主要包括抗体重链的可变区，合适的轻链和一个连接轻链和重链(抗体-FV偶联物)的多肽序列组成。
本发明的免疫偶联物可包括在抗体(片段)和可产生诱导作用的趋化因子之间的任意一个限制性位点它使得例如一特异连接肽的引入成为可能，从而保证了偶联物与目标表位的最佳结合。合适的连接肽和引入它们的方法在技术上已众所周知，并在下文中叙述。依据本发明，所选择的限制性位点是特定DNA结构中唯一的位点。较好的限制位点是NcoI和BclI。
因此，本发明进一步的目的是提供一个免疫偶联物，它含有一个氨基酸(序列)，该氨基酸(序列)可由抗体/抗体片断和生物活性配基之间的DNA限制位点推导出，所述限制性位点在整个融合结构中是唯一的。
本发明进一步的目的是提供一个免疫偶联物，它包含一个在抗体/抗体片断与生物活性配基之间的连接肽。
原理上，导向肿瘤细胞表面EGF受体的所有抗体都是适用的，但单克隆抗体425是优选方案。
而且，本发明的另一个目的是提供一个免疫偶联物，其抗体和抗体片段来源于鼠的、人化的或嵌合体的MAb425，并且以从MAb425-CH1-IL8 MAb 425-CH2-(NcoI)-IL8，MAb 425-CH2-(BclI)-IL8，MAb 425-FV-IL8，MAb425-CH3-IL8族中选择为好。
此外，本发明的另一目的是提供一种上、下文及权利要求中所定义的免疫偶联物的生产方法，它包括将编码抗体或抗体片段和生物活性配基的DNA序列，通过一个与所需融合DNA序列互补的寡核苷酸彼此融合在一单链DNA上。把产生的目的结构置于表达载体上，转化此载体到宿主体中，于营养液中培养宿主细胞，并表达此融合蛋白。
本发明的免疫偶联物适用于临床治疗。
因此，本发明的目的之一是提供一种药物配方，它至少包含有一种上、下文及权利要求中所定义的免疫偶联物以及生理学上许可的载体。
本发明的目标之一是产生一种融合蛋白，它包括作为靶向成分的单克隆抗体和作为效应物，具有趋化和激活性质的趋化因子IL-8。
第一次，可以证明当IL-8和其它趋化因子(例如MIPs)的N-末端被附加的氨基酸，例如抗体的一部分所封闭的时候，它们可以保持其生物活性。因此，在靶向肿瘤治疗中，这个分子将会是很有用的，这是由于效应细胞可被导向EGF受体阳性的肿瘤细胞并在原位被激活。
可以证明，编码MAb425重链及IL-8蛋白的CDNA可用分子生物学的方法被融合，蛋白可在合适的表达系统中表达，而且EGF受体结合能力在融合蛋白中被保留(图2)。
IL-8的主要靶细胞是嗜中性粒细胞，它们有三种生物学功能·沿一个趋化梯度趋化移动·释放带有预制备的蛋白水解酶的储存颗粒·即时产生过氧化物阴离子(呼吸性释放)相应地，也研究了MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8融合蛋白的趋化活性，MPo释放和过氧化物释放的介导。
进一步，可以看出，本发明的融合蛋白(例如MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8)可引起趋化活性，诱导MPO的释放和过氧化物的释放。图3a中所显示的结果表明了以上两种融合蛋白在重组IL-8(图3b)的范围内对人中性粒细胞是有趋化性的，除了应成型为二价形式的MAb425/NcoI/IL-8和MAb425/BclI/IL-8融合蛋白之外，还产生在大肠杆菌(E.coli)中表达并被纯化的一价F(ab’)-IL-8融合蛋白。图4显示出与MAb425F(ab’)相对比，相应的在E.Coli中表达并被纯化的F(ab’)-IL-8融合蛋白对人中性粒细胞是具趋化性的。
与游离IL-8相对比，MAb425/BclI/IL-8融合蛋白具有相当强的过氧化物释放的能力(图5)，MAb425/NcoI/IL-8融合蛋白活性较小，但明显高于对照值(图5)。单独的MAb425无活性。所有的试验均以细胞松驰素B作为增强剂来进行。该试剂在单独存在时无活性(数据未显示)。
两种融合蛋白均诱导髓过氧化物酶(MPO)的释放，但MAb425/NcoI/IL-8融合蛋白比MAb425/BclI/IL-8融合蛋白更具活性(图6)。所有数据均参照三硝基甲苯溶解细胞的数据计算，该数被称作100％酶含量。所有数据的获得均使用细胞松驰素B作为增强剂。
以前已证明，IL-8分子的N-末端带有高度保守的E-L-R基元对于受体结合和信号传导是必须的。IL-8的三维结构是一个两个N-末端均在一个开放构型中的匀二聚物。当IL-8的两个N-末端被附加的氨基酸所封闭时，其生物活性是可能丧失的。因此，在两个CDNA之间引入限制性位点(NcoI/BclI)以产生连接肽从而恢复N-末端的可接近性。
产生融合蛋白的其它方法，例如两成分的化学偶联会导致可能在两批产品间变动的非常不确定的结构。另外，化学偶联会破坏配体的二级结构或产生由于不可接近性造成的大多数蛋白质在受体接合方面的钝化。相比较来说，本发明的方法可产生确定结构的融合蛋白，这种蛋白可以几乎无限制地被很重现地表达。
总之，本发明的融合蛋白具有下述性质—接合于EGFR阳性细胞—产生趋化活性—介导MPO和过氧化物的释放—诱导肿瘤细胞的原位溶解。
因此，本发明的免疫偶联物适用于肿瘤治疗。
表1表1表明用于产生NcoI或BclI点位，以产生真核表达的融合蛋白的PCR引物序列。
图1抗体一细胞因子免疫偶联物的模型。
C＝细胞因子；VH＝重链可变区；VL＝轻链可变区；CH＝重链恒定区；CL＝轻链恒定区。
图2以抗EGF-R的ELISA证明MAb425在COS-7的转染上清中正方形MAb425-CH3上清液三角形MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液倒三角形MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液点PHCMV上清液横轴上清液稀释度纵轴光密度在490nm图3a以COS-7转染上清诱导趋化性柱1对照DMEM/PS柱2未稀释的PHCMV上清柱3MAb425-CH3上清1∶14稀释(据EGF-γ-ELISA的结果)柱4MAb425-CH3上清1∶28稀释(据EGF-γ-ELISA的结果)柱5未稀释的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清(1.76×10-10Mol/L*)柱6MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清1∶2稀释柱7MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清，未稀释(2.0×10-10Mol/L*)柱8MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清1∶2，稀释*IL-8浓度以ELISA(Amersham)测定纵轴每个计数区的细胞数目图3b纯化IL-8介导的趋化作用纵轴每个计数区的细胞数目横轴IL-8浓度(Mol/L)图4MAb425-CH1-IL-8(E.Coli)介导的趋化作用点大肠杆菌中表达的MAb425-CH1-IL-8正方形大肠杆菌中表达的MAb425-F(ab’)三角形Dulbecco’s/BSA对照纵轴每个计数区的细胞数目横轴浓度(Mol/l)图5COS-7转染上清对过氧化物释放的诱导柱1未被刺激的细胞柱2IL-8 10-7M
柱3未稀释的MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清(2.0×10-10Mol/L*)柱4未稀释的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清(1.76×10-10Mol/L*)柱5未稀释的MAb425-CH3上清(OMol/L*)*IL-8的浓度由ELISA(Amersham)测定纵轴光密度在550nm图6以COS-7转染上清液诱导MPO释放柱1未被刺激的细胞柱2用细胞松驰素B刺激的细胞柱3IL-8 10-7M柱4未稀释的MAb425-CH3上清液柱5MAb425-CH3上清液1∶2稀释柱6未稀释的MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液柱7MAb425-CH2-(NcoI)-IL-8上清液1∶2稀释柱8未稀释的MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液柱9MAb425-CH2-(BclI)-IL-8上清液1∶2稀释纵轴与总的MPO量(100％)相比的％MPO活性所有微生物、细胞素、质粒、启动子、抗性标记，复制起始点，限制性位点或申请中提到的其它片段都是商品化的或可普遍得到的。如果没有给出其它提示，它们仅用作例证，而不是本发明所必需的，并可相应地被其它合适的工具和生物材料代替。
本发明所必需的相关技术在下文中详尽叙述，其它未详细描述的技术与已知标准方法相符，这些方法或为技术熟练人员熟知或在引用的参考文献，专利申请和标准文献(如“Atibodies，A Labora-tory Manul”，Harlow，Lane，Cold Spring Harbor，1988)中有更详细的描述。
单克隆抗体MAb425是抗人A431癌细胞系(ATCC CRL 1555)的IgG1鼠单克隆抗体。MAb425结合于人EGF受体外部功能区的多肽表位并与EGF竞争结合。MAb被发现在体外介导肿瘤细胞毒性，并抑制表皮及直肠结肠肿瘤源细胞系肿瘤细胞的生长(Rodeck et al.，Cancer Res.473692，1987)。MAb425的人化或嵌合体转型在WO92/15683中已公开。
趋化因子编码趋化因子的CDNA既可以从英国Biotechnology(生化技术)公司购买(人IL-8 BBG44Hermann Biermann GmbH，BadNauheim FRG)或由产生人细胞系U937(ATCC CRL 1593)的细胞因子中分离出的mRNA产生从产生趋化因子的细胞中得到的总mRNA是用生产厂家介绍的RNA201(WAK-Chemie，Germany)分离的。此RNA随后被转录成CDNA，编码趋化因子的序列使用从已发表的DNA序列推测出的合适引物进行PCR扩增。
载体PUC19是一系列有关高拷贝数大肠杆菌质粒克隆化载体的一部分，并含有PBR322和MBmp19的几部分。PUC19包含可诱导的细菌乳糖启动子-操纵子，其后是多克隆位点(Yanisch-Oerron etal.，Gene 33103-109，1985)。PUC载体可作为商品买到(例如New England Biolabs)。
pBluescipt KS/SK+和KS/SK噬菌体质粒载体来自pUC19。这些载体都可作为商品买到(Stratagene，Heidelberg)。原核表达载体是以PUC19载体衍生物，PSW1载体作为基础(Ward et al.，Nature 341544-546，1989)，PSW1包含一段序列，该序列编码从Erwinia Carotovora得到的细菌pel基因的前导肽。外来DNA被导入框架，在pelB前导序列之后，使得蛋白表达入外周细胞质中。
真核表达载体PHCMV(Gillies et al.，Cell 33717。1983)包含有猴病毒40(SV40)的复制起始点和人诞腺病毒的启动子和增强子区。这个启动子和增强子区的后面是多克隆位点，用以导入表达基因。在这个载体中，将MAb425重链可变区的嵌合体形式和与在CH2段末端的趋化因子融合的Cγ1 CH2区相结合以产生MAb425重链融合蛋白。通过与合适轻链相结合的方式把融合Ig链装入免疫偶联物中以形成一价抗原结合区，此区域随后可被用于产生一个对靶抗原特异的二价免疫偶联物。此重链及轻链结构可被装入一个或分开的载体中。
融合蛋白在真核细胞中的表达用于表达Fab425趋化因子融合蛋白的真核表达载体的构建用PCR技术融合Mab425与趋化因子人Cγ1恒定区作为BamHI/BamHI片段被插入PUC19。这个Cγ1恒定区包含两个SacII位点一个位于5’基因内区5’BamHI位点下游40bp处，第二个位于5’BamHI位点下游580bp及CH3段开头上游140bp处。第二个SacII位点适于更进一步的亚克隆，因此，用一个连接子导入一个SnaBI位点会破坏第一个SacII位点。在这个结构中(ΔSacII Cγ1)从SacII位点向下游的片段能够很容易地被交换。
1.IL-8从PUC18载体(BglII/EcoRI)上切下并被插入pBlueScript SK+(Stratagene GmbH，Heidelberg)(Smal/EcoRI)，从而去掉BgIII和SamI位点。ΔSacII Cγ1克隆的SacII/×baI片段被插入pBlueskript SK+。两个基因均使用PCR技术以合适的引物扩增—对于ΔSacII cγ13’引物CH2段的末端序列和NcoI位点。
5’引物反向测序引物—对于IL-8 3’引物通用测序引物5’引物一个NcoI位点及IL-8起始序列产物被切下并以SK+SacII/EcoRI连接。所得肽序列CH2段C-末端的丝氨酸被变为甲硫氨酸，IL-8部分N-末端的丝氨酸被变为甘氨酸。
在两个多肽之间接点上新产生的序列是5′AAA GCC ATG GGT GCT3′Lys Ala Met Gly Alacγ1CH2 IL-8(2-72)使用引物(表1)进行同样步骤以便在两个基因中导入BclI位点。所得的融合基因在Cγ1恒定区与IL-8基因之间有一个BclI位点，此融合基因编码CH-2段的全部序列，两上附加氨基酸(缬氨酸，异亮氨酸)，设有前两个氨基酸(丝氨酸丙氨酸)的IL-8序列。
在两个多肽之间的接点上新产生的序列是5′GCC AAA GTG ATC AAA GAA 3′Ala Lys Val Ile Lys Glucγ1CH2
IL-8(3-72)使用SacII和EcoRI限制性位点将PCR产物亚克隆入SK+。为了真核表达的需要，把这些配合基因克隆进pHcmv载体。
表1
免疫偶联物在真核细胞中的表达免疫偶联物在真核细胞中的表达需要将含有重链和轻链的载体DNA引入宿主细胞中。已经介绍有多种不同的方法，如电穿孔，DEAE葡聚糖，磷酸钙，脂质体或原生质体的融合。只要编码免疫偶联物的重组DNA序列在那种细胞型中被恰当地转录成mRNA，任何一种宿主细胞型都可以使用。宿主细胞可以是不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，如Sp2/0-AG14(ATCC CRL 1581)，P3×63Ag8.653(ATCC CRL 1580)或仓鼠细胞例如。CHO-KL(ATCCCCL61)或CHO/DHFR-(ATCC CRL 9096)，或BHK-21(ATCCCCL 10)。为瞬时表达的需要，可以使用COS-1(ATCC CRL 1650)或COS-7(ATCC CRL 1651)。
免疫偶联物的瞬时表达表达载体PHCMV包含有猴病毒40(SV40)的复制起始点。细胞系COS-7是猴细胞系CV-1的一个分支，原细胞系已被转入起始点缺乏的SV-40病毒。因此，含有SV40复制起始点的质粒将会被扩增，免疫偶联物的产物也将会增加。72小时后收集上清液，用ELISA检测EGF受体的结合情况及趋化因子浓度。
免疫偶联物的永久表达把含有表达免疫偶联物的重组结构的载体导入合适的宿主细胞中。重链和轻链结构可以被装入同一个或分开的不同载体中；在后一种情况中，两个载体可以带有同一选择标记，如新霉毒抗性或二氢叶酸还原酶(DHFR)。或者带有二个不同的选择标记用于两个载体都存在时的筛选。DHFR标记的选择只能在DHFR负性细胞系如CHO/DHFR-中进行。为了表达免疫偶联物，可以使用EGF受体特异性的ELISA分析混合种群。对阳性克隆进一步的筛选可使用限度稀释克隆法进行。
M425趋化因子免疫偶联物的纯化由宿主细胞制造的M425免疫偶联物可以使用任何一种合适的方法进行收集和纯化，例如使用靶抗原、抗细胞因子抗体或抗个性基因抗体的亲合色谱法(例如Harlow，lane，I.c.)。
本发明中使用经标准方法(如Kostelny et al.(1992)，J.Im-munol，148，1547)，由MAb425制取的抗个性基因抗体进行纯化。
为了获得纯的FV-免疫偶联物，将表达质粒(见下)转入适于蛋白表达的大肠杆菌菌株。细胞生长到OD578＝0.5，并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(ImM)诱导。细胞生长过夜，收集上清液及细胞。上清液用一个依据标准步骤制备的抗MAb425，抗个性基因的色谱柱进行分离。以含有0.5M Nacl的磷酸盐缓冲液洗柱，结合在柱上的蛋白用PH＝2.5的含0.5M Nacl的100mm甘氨酸洗脱。洗脱液立即用PH8.0的2.5M Tris中和，将含有MAb425-CH1-IL-8的各部分合并，浓缩并对PBS透析。
用于Fab425-趋化因子的原核表达载体的构建及Fv-趋化因子融合蛋白的表达Fv片段依据Glock shuber等人的方法制成(Bit-chemistry 291362-1367，1990)。编码轻链和重链Fd片段或Fv片段的DNA序列被导入PSW1载体的多克隆位点中。轻链成熟编码序列，重链成熟编码序列及Fv编码序列位于细菌pelB基因的前导肽之后。重链的编码序列包含一个NcoI(3’末端)位点。以PCR修饰编码CDNA的趋化因子以导入NcoI(5’末端)和NotI(3’末端)或EcoRI(用于Fv融合)限制性位点。在框架中，趋化因子基因被直接融合于重链的CH1区或Fv段。相应地，一个连接肽，例如(Gly-Gly-Gly-Gly-Sex)x，这里x可为1到4，可被导入CH1区和趋化因子基因之间。这种连接子及其制作方法可从文献(如Curtis等，1991，Proc、Natl、Acad、Sci、U.S.A，88，5809)中得知。
这些载体使功能性F(ab’)(＝CHI)及Fv-趋化因子，融合蛋白在大肠杆菌中的有效表达成为可能。轻链和重链-趋化因子融合蛋白定位于在可诱导的乳糖启动子(Skerra和Pluckthun，Science 2421038-1040，1988)调控下的单二顺反子信使RNA上，因此，Fab/Fv-融合蛋白的表达可根据对培养条件的要求来诱导。从二顺反子信使RNA上翻译，两个蛋白倾向于合成等量的Fd-趋化因子融合蛋白和轻链，以增加正确装配入功能性Fab/Fv融合蛋白的可能性。这两个多肽被分泌入大肠杆菌外周胞质中，在那里发生二硫键的折叠，形成并装配入功能性Fab 425 CH1/Fv融合蛋白中。延长细菌的培养可导致大肠杆菌外膜的部分渗透性使得融合蛋白可扩散入培养基中。
Mab425免疫偶联物的结合作用Mab425免疫偶联物的结合性质用EGF-受体特异性的ELISA测定。简言之，就是微滴定度板在4℃用纯化的EGF-受体包被过夜。用含有融合蛋白的上清液或含有未被偶联的Mab片段的上清液孵育该板。洗板以移去未被结合的材料，然后平板先用偶联于过氧化物酶的羊抗人IgG及IgM(重链和轻链)，再用底物孵育，以检测结合于EGF-受体的抗体。在490nm测定结合的EGF-受体特异性蛋白的量。
Mab425-IL-8免疫偶联物的生物活性效应细胞的分离为了检测生物活性，按Hoslett等(Am.J.Pathol 119101-110，1985)以前所述，从健康供血者的全血中新鲜分离出人外周血嗜中性粒细胞。离心分离血浆，用葡聚糖沉降法分离红细胞，最后用percoll-梯度离心法分离淋巴细胞和白细胞。分离出的中性粒细胞立即使用。
趋化活性的检测趋化性的检测依据Fald等(J.Immunol Methocls 33239-247，1980)所述方法进行。简言之，就是使用48boyden chamber及5um的膜，纯化的中性粒细胞以1×106细胞/ml的浓度被重新悬浮于DEME介质中(DEME，1％青霉素，1％链霉素，10％FCS，2mML谷氨酰胺，1mM谷铜酸钠，10mM HEPES)。含有融合蛋白的上清液或对照上清液放入下面的孔中，以膜覆盖上面的孔中盛装细胞悬液。在37℃孵育30分钟后，把膜移去并在2％戊二醛。中将膜固定10分钟。然后，在魏格特氏铁苏木精染剂中将粘附于膜上的细胞染色3分钟。在显微镜下，测定结合于膜的细胞数目。
在中性粒细胞中诱导酶释放能力的测定为评估这些免疫偶联物在中性粒细胞中诱导颗粒释放的能力，要控制上清液中髓过氧化物酶的活性(Henson等，J.Immunol 121851；1978)试验在每孔5×105个细胞的96孔微量滴定度板中进行。与刺激物孵育(37℃)后，离心滴定度板，并把不含细胞的上清液转移到另一个96孔微量滴定度板中。这个不含细胞离的上清液与二茴香胺(作为底物)孵育并在492nm测定吸收度使用浓度为10-7M的FMLF作为阳性对照。为测定全部酶含量，以三硝基甲苯溶解未经刺激的细胞。以对全部酶含量(溶解)的百分比计算活力。
过氧化物释放能力的测定细胞色素C可被O2-所还原并因此改变它的吸收度。这个吸收度的变化对估计过氧化物的活性是一个有价值的标志。此试验依据Guthrie等(J.Exp.Med 1601656-1671，1984)所述方法在每孔5×105个细胞的96孔微量滴定度板中进行。将刺激物与细胞色素C孵育后，离心平板，在550nm测定上清液的吸收度。
进一步的免疫偶联物据以上描述，已经制备并研究了抗EGFR-CH1，-CH2-，CH3及Fv的免疫偶联物(带有/不带有限制性位点和连接子)，它们包含有作为趋化因子组分的MIP-2α及MIP-2β。这些结构显示出与IL-8分枝相似的性质。
免疫偶联物的治疗用途本发明的免疫偶联物可为治疗目的给药于病人。因此，本发明的目的之一是提供一种药物配方，它包含有至少一个在上文及权利要求中定义的融合蛋白作为活性成分，并辅以一种或多种药学许可的载体，赋形剂或稀释剂。
本发明中的免疫偶联物典型的给药方式是静脉内或胃肠外注射。一般来说，这些免疫偶联物给药的剂量范围很广足以产生目标肿瘤的抑制及肿瘤溶解效应。这个剂量依赖于病人的年龄，个体条件，性别及疾病程度，并可以在0.1mg/kg到200mg/kg之间变动，倾向于选择每日剂量在0.1mg/kg到100mg/kg之间，一次或多剂量给药，持续一天或几天。
胃肠外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液，悬液及乳剂。非水溶剂可以是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油和可注射的有机酯如油酸乙酯，以及在技术上已知的适于这些意图的其他溶剂。本项发明的免疫偶联物可被用在一种含有生理学许可的载体的成分中。这些合适的载体可以是盐水，PBS，林格氏溶液及乳酸化的林格氏溶液。防腐剂和其他添加剂如抗菌素，抗氧剂及螯合剂也可以出现在药物配方中。
所提请发明的药物配方适用于对所有类型肿瘤的治疗，包括黑色素瘤，神经胶质瘤及癌症，也包括血液肿瘤和固体肿瘤。
权利要求
1.免疫偶联物，包含有导向承载表皮生长因子受体抗原表位的肿瘤细胞的单克隆抗体或其片段，以及融合于上述抗体或抗体片段的趋化因子蛋白质。
2.权利要求1中的免疫偶联物，其趋化因子选自C-X-C族。
3.权利要求2中的免疫偶联物，其趋化因子是IL-8。
4.权利要求1至3之一中的免疫偶联物，其抗体是一个主要包含抗体重链的可变区、恒定区的CH1段及合适轻链(抗体-CH1偶联物)的Fab片段或F(ab)2片段。
5.权利要求1至3之一中的免疫偶联物，其抗体是一个主要包含有抗体重链的可变区、恒定区的CH1和CH2段及合适轻链(抗体-CH2偶联物)的抗体片段。
6.权利要求1至3之一中的免疫偶联物，其抗体是一个主要包含有抗体重链的可变区，恒定区的CH1、CH2和CH3段及合适轻链(抗体CH3偶联物)的抗体片段。
7.权利要求1至3之一中的免疫偶联物，它主要由抗体重链的可变区、合适轻链以及一段连接重链轻链(抗体一Fv偶联物)的多肽序列所组成。
8.权利要求1至6之一中的免疫偶联物，它包含可由抗体/抗体片断和生物活性配基之间的一个限制性位点推导出的一个氨基酸(序列)，上述限制性位点在整个融合结构中是唯一的。
9.权利要求1至7之一中的免疫偶联物，它包含一位于抗体/抗体片段与生物活性配基之间的连接肽。
10.权利要求1至8之一中的免疫偶联物，其抗体或抗体片段来源于鼠的，人化的或嵌合体的MAb425。
11.选自MAb425-CH1-IL8，MAB425-CH2-(NcoI)-IL-8，MAb425-CH2-(BclI)-IL8，MAb425-Fv-IL8，MAb425-CH3-IL8组的一个免疫偶联物。
12.权利要求1至10之一的免疫偶联物的生产方法，它包括将编码抗体或抗体片段及生物活性的配基的DNA序列通过与所需融合DNA序列互补的单链DNA彼此融合在一单链DNA上，将产生的结构放入表达载体中，转化此载体到宿主生物体中，在营养液中培养此宿主细胞并表达此融合蛋白。
13.药物组合物，它包含至少一个权利要求1至10中的免疫偶联物以及生理学上许可的载体。
14.权利要求1至10之一中的免疫偶联物应用于制备抗肿瘤的药物。
全文摘要
本项发明涉及新型免疫偶联物，其包含对人EGF一受体分子特异性的一个单克隆抗体或其片段，以及趋化因子族中的一员，倾向于从C-X-C族中选拔，例如白细胞介素8。这些免疫偶联物诱导细胞毒性和趋化活性并且适用于靶向肿瘤治疗。
文档编号A61K39/385GK1123185SQ95116279
公开日1996年5月29日 申请日期1995年9月14日 优先权日1994年9月16日
发明者W·霍尔兹, I·冯·霍格恩, W·斯特里玛特尔, S·玛滋库 申请人:默克专利股份有限公司