专利名称：通过酶法水解动物屠宰血制取多肽及氨基酸的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及用酶解法从动物屠宰血制取多肽及氨基酸的方法。
动物屠宰血是富含蛋白质和有益微量元素的天然资源，但以往除了部分作为食用外，大量屠宰血都白白浪费，同时还造成严重的环境污染。
中国专利申请CN 1080282A从屠宰血提取氨基酸，CN1094618A从畜血中提取血红素与蛋白质粉，两者均采用有机溶剂提取，存在回收溶剂等问题。
近年来发展了生物酶解方法，如CN 1084890A用胃蛋白酶水解动物血来制备食用血红素，欧洲专利EP 436747采用胃蛋白酶水解与超滤技术相结合的方法制备血红素。它们采用单一的胃蛋白酶，水解不完全，成本也高，形成的血红素是不溶性胶体，不易被人体吸收。
本发明的目的是提供成本较低的混合酶水解屠宰血的方法，以利于变废为宝，减少环境污染，开发利用蛋白质再生资源。本发明的另一目的是提供一种水解较彻底的混合酶水解方法，使得到的水解产物能被人体充分吸收。
本发明的方法包括以下步骤1.取血抗凝，干燥成粉；2.在pH3-5、温度30°-60℃条件下，用木瓜蛋白酶和/或酸性蛋白酶水解4-6小时；3.在pH7-9、温度30°-60℃条件下，用胰蛋白酶和/或碱性蛋白酶水解4-6小时；
4.调节pH至中性，加热灭活酶，过滤。
本发明的具体实施方案详述如下在即获的畜、禽类屠宰血中加入0.5-1％抗凝剂，在60°-90℃温度下干燥，使成为粉末状，备用。酶解时将蛋白粉溶于水中，调整pH至弱酸性(pH3-5)。在30°-60℃保温条件下，加入0.2-1.0％木瓜蛋白酶和/或0.2-0.5％酸性蛋白酶水解4-6小时，再调整pH至中性偏酸性(pH7-9)，加入0.1-0.3％胰蛋白酶和/或0.1-0.3％碱性蛋白酶，继续反应4-6小时。然后，将pH调至中性，升温至70°-90℃灭活15分钟至1小时。以上过程应尽量按无菌要求进行操作，水解锅最好是封闭的。
将水解物过滤，除去沉淀颗粒。在滤液中添加赋形剂后冷冻干燥或喷雾干燥成粉末。
更佳的是，在水解物过滤后，将滤液以3000-5000转/分离心20-30分钟，上清液以常规方法制成口服液或静脉注射液，沉淀物冷冻干燥后制成胶囊。
在本发明的方法中采用的抗凝剂为枸橼酸钠或草酸钠等，调节pH值的试剂为稀盐酸、稀硫酸、稀醋酸、氢氧化钠或碳酸氢钠水溶液等，赋形剂为淀粉、羧甲基纤维素(CMC)、甲基纤维素(MC)或甘露醇等。
本发明方法采用混合蛋白酶分阶段处理动物屠宰血，使粘度高、分子量大、不易吸收的血蛋白降解为小分子多肽及少量氨基酸。
图1是水解物经离心后的上清液的质谱图。
从图1可见，上清液中所含水解产物的分子量均在2000道尔顿以下，其中大部分在1000道尔顿左右，为小分子多肽和部分氨基酸。
离心后的沉淀物中多为小分子蛋白质和少量多肽。
本发明方法所得水解产物溶解性好，分散度佳，十分稳定，吸收率达95％以上。
本发明方法所得水解产物富含铁质，是十分理想的补铁营养品，经动物试验证明，具有升高白细胞和血红蛋白的作用。
本发明方法所得水解产物是极好的食品、保健品和食源性药物(包括静脉高营养制剂)的原料，粗制品也是极好的饲料蛋白质添加剂。
以下用实施例和实验例对本发明作更详细的说明。这些实施例和实验例仅仅是说明性的，并不构成对本发明权利要求的限制。
实施例1在新鲜猪血中按重量加入0.8％枸橼酸钠，80℃干燥，得到粉末状物，备用。
10克猪血粉加90克蒸馏水，混匀，用稀盐酸调节pH至3，加入0.2克木瓜蛋白酶(酶活力21-40U/mg)和0.2克酸性蛋白酶(活力2000U/mg)，在无菌封闭的反应锅内连续反应6小时。
降温以停止反应，加1N NaOH调节pH至8.5，加入0.3克碱性蛋白酶(活力2000U/mg)，在56℃下连续反应6小时。
降温停止反应，用稀盐酸将pH调至中性，在80℃下保温45分钟。将反应物用纱布过滤。滤液以3000转/分离心半小时，取上清液加入1％甘露醇，冷冻干燥成粉末状。
实施例2取新鲜鸡血按重量加0.7％枸橼酸钠。在70℃温度下干燥成粉末状备用。
10公斤鸡血粉加90公斤蒸馏水混匀，将pH调至5，加入1％木瓜蛋白酶(酶活力6000U/mg)，在无菌、封闭、恒温条件下(35℃)，连续反应4小时。
降温(停止反应)，调pH至8，加入0.1％胰蛋白酶(活力1∶250)和0.1％碱性蛋白酶(活力2000U/mg)，在35℃条件下，继续反应5小时。
升温至70℃，保持60分钟，降至常温，调pH至中性，将反应物用纱布过滤。
滤液在5000转/分离心20分钟，取上清液灌装安瓿，密封，灭菌。
将沉淀物冷冻干燥，制成胶囊。
实施例3按上述实施例2同样的方法操作，原料改为猪血，水解产物离心后，取上清液加入2％CMC，冷冻干燥成粉末状，作药用原料。
实施例4新鲜鸭血按重量加0.5％枸橼酸钠。在65℃温度下干燥成粉末状备用。
10公斤鸭血粉加10公斤蒸馏水混匀，将pH调至4，加入0.3％木瓜蛋白酶(活力6000U/mg)和0.5％酸性蛋白酶(活力2000U/mg)，在无菌、封闭、恒温(45℃)条件下，连续反应4小时。
停止反应(降温)用NaHCO3调pH至7.2，加入0.3％胰蛋白酶(活力1∶250)，在45℃条件下，继续反应5小时。
升温至90℃，保持30分钟，再降至常温，将反应物用纱布过渡。
在滤液中加入2％淀粉，冷冻干燥成粉末。
实验例1选择昆明种小鼠40只，体重36-42g，雌雄各半，随机分为两组，每组10只雌鼠，10只雄鼠。实验开始的第1、2、3天每天眼眶放血，造成失血性贫血模型，第4、5、6天每天按60mg/kg腹腔注射环磷酰胺以抑制红细胞再生，从第7天开始实验组每天灌服实施例4产物的水混悬液30mg/kg，对照组灌服等体积2％淀粉，连续灌服8天，于实验开始的第0天、第6天和第14天从尾静脉取血，测定小鼠的血红蛋白含量，实验结果见表1。
表1 蛋白水解产物对失血性贫血小鼠的升血红蛋白作用
以上结果表明，本发明方法制得的水解产物对失血性贫血具有一定的升高血红蛋白的作用。
实验例2选择昆明种小鼠40只，体重36-42g，雌雄各半，随机分为两组，每组10只雌鼠，10只雄鼠。测定正常白细胞数后，用100mg/kg环磷酰胺连续腹腔注射三天，造成低白细胞模型测白细胞数，作为给药前的白细胞数，然后对照组每天灌服5％蔗糖水10ml/kg一次，实验组每天灌服实施例4产物的混悬液30mg/kg，连续灌服20天，分别在第10天和20天采血，计算白细胞数，结果如表2。
统计结果表明，本发明方法的水解产物具有显著的升高白细胞的作用。
权利要求
1.从动物血制取多肽及氨基酸的方法，其特征在于1)取血抗凝，干燥成粉；2)在pH3-5，温度30-60℃条件下，用木瓜蛋白酶和/或酸性蛋白酶水解4-6小时；3)在pH7-9、温度30-60℃条件下，用胰蛋白酶和/或碱性蛋白酶水解4-6小时；4)调节pH至中性，加热灭活酶，过滤。
2.按权利要求1所述的方法，其中抗凝剂为0.5-1％枸缘酸钠。
3.按权利要求1所述的方法，其中木瓜蛋白酶浓度为0.2-1.0％。
4.按权利要求1所述的方法，其中酸性蛋白酶的浓度为0.2-0.5％。
5.按权利要求1所述的方法，其中胰蛋白酶的浓度为0.1-0.3％。
6.按权利要求1所述的方法，其中碱性蛋白酶的浓度为0.1-0.3％。
7.按权利要求1所述的方法，其中酶灭活的温度为70-90℃，灭活时间为15分钟至1小时。
8.按权利要求1所述的方法，其中水解物过滤后的滤液加赋形剂后冷冻干燥或喷雾干燥成粉。
9.按权利要求1-7所述的方法，其中水解物过滤后的滤液再以3000-5000转/分离心20-30分钟，取上清液。
10.按权利要求9所述的方法，其中离心后的淀淀物冷冻干燥成粉。
全文摘要
本发明提供用混合酶水解动物屠宰血制取多肽及氨基酸的方法，即在pH3-5、温度30-60℃条件下用木瓜蛋白酶和/或酸性蛋白酶水解以及在pH7-9、温度30-60℃条件下用胰蛋白酶和/或碱性蛋白酶水解。采用混合酶分阶段处理，使血蛋白水解完全，所得产物为小分子多肽和氨基酸。水解产物溶解性好、分散度佳、十分稳定，吸收率达95％以上。
文档编号A61K38/01GK1144273SQ9511600
公开日1997年3月5日 申请日期1995年9月1日 优先权日1995年9月1日
发明者郑国亮 申请人:郑国亮