联合细胞模型及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种联合细胞模型，它包括Caco-2细胞模型和L-02肝细胞模型，所述Caco-2细胞模型与L-02肝细胞细胞模型以半透膜相隔。本发明还公开了该联合细胞模型的制备方法，以及使用该联合细胞模型筛药的方法。本发明联合细胞模型可同时、准确、高效地检测药物的吸收和代谢过程，提高检测效率，具有良好的市场应用价值。
【专利说明】联合细胞模型及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种联合细胞模型。
【背景技术】
[0002] 据估计，在新药开发中，临床检测发现50%的候选药物药效不理想，40%的候选药 物存在安全性问题，导致开发失败，前期开发工作浪费。若能提前对候选药物的活性和毒性 进行体外评估，可W极大降低药物开发成本。ADME/Tox模式，药物代谢和毒性检测模式，是 近年发展起来的、全新的，是在细胞水平上早期进行吸收、分布、代谢、清除和毒性实验的新 型新药研究模式，其可W提前对候选药物的活性和毒性进行体外评估，近年来在国外各大 制药企业中得到广泛应用。
[0003] 对候选药物进行早期筛选时，可W根据研究的需要，选用相应的高通量ADME/Tox 体外模型，对药物进行早期的活性/毒性筛选。
[0004] 化C0-2细胞模型，人结肠腺癌细胞，用于研究药物吸收的细胞模型。孙敏捷等， "化C0-2细胞单层模型的建立与验证"，中国药学杂志2006年9月第41卷第18期公开了一 种化C0-2细胞模型的制备方法：将化C0-2细胞模型在T-75培养瓶中培养，培养液为MEM/ 邸SS肥AA(抑7. 4,含胎牛血清10%、心谷氨醜胺2mmol/L、H巧巧S lOmmol/L、青霉素、链 霉素），在37°C，含5% C〇2培养箱中全湿度培养，按1:3比例传代后，将细胞接种在24孔 Millicell插入式培养皿中，接种密度为ImL含8X IO4个，每孔400 y以基底侧加入培养液 600 y L培养液培养21天，期间换液。
[0005] k02肝细胞模型，用于研究药物代谢的细胞模型。
[0006] 利用细胞模型研究药物的吸收和代谢过程如果于单个细胞模型的顺序使用，只能 分别考察药物的吸收和代谢，浪费时间，同时相较于体内药物代谢研究，缺少肝肠循环该一 重要环节，存在较多干扰因素导致检测不准确。
[0007] 中国专利CN102876633A公开了一种联合细胞模型，它包括化CO-2细胞模型和大 鼠原代肝细胞模型。该模型采用大鼠肝细胞模型与化CO-2细胞模型相加，与人体间具有种 属差异，且大鼠原代肝细胞培养操作复杂。因此，需要发明一种与人体内环境更加相似的联 合细胞模型。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述问题，本发明提供了一种与人体内环境更加相似的联合细胞模型， 它包括化CO-2细胞模型和k02肝细胞模型，所述化CO-2细胞模型与k02肝细胞模型W 半透膜相隔。
[0009] 所述半透膜为聚碳酸醋膜、聚醋膜或混合纤维素膜，膜孔径为0. 4?8. 0 y m。
[0010] 所述聚醋膜为Millicell息挂式培养皿。
[0011] 所述的化CO-2细胞模型是细胞跨膜电阻值> 550 Q 'cm2的细胞系。所述的化CO-2 细胞模型是细胞跨膜电阻值为550?800 Q ? cm2的细胞系。
[0012] 所述联合细胞模型是按照如下方法制备而成：
[0013] a、取化CO-2细胞，复苏，加入DMEM-20%培养液中培养，按1:3传代，培养2代后， 换成DMEM-IO %培养液继续传代培养；
[0014] b、取铺有鼠尾胶原的培养皿和步骤a制备的第3?15代中任意一代细胞，调整细 胞密度为1. 5 X IO5个/mU从AP侧接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上，在培养皿化侧加入 DMEM-10%培养液，置于37°C，含5% C〇2的培养箱中培养，连续培养17?25天，期间更换 培养液，得载有化CO-2细胞模型的培养皿；
[0015] 〇、取心02肝细胞，复苏，加入0161-20%培养液中培养，按1:3传代，培养2代后， 换成DMEM-IO %培养液继续传代培养；
[0016] t取步骤C制备的k02肝细胞混息液，调整细胞密度为1. 5 X IO5个/ml,接种于 铺有鼠尾胶原的细胞培养板上，每孔加入2ml并每天换液，培养1?5天，得载有k02肝细 胞模型的细胞培养板；
[0017] e、将步骤b所得载有化CO-2细胞模型的培养皿，置于步骤d所得载有k02肝细 胞模型的细胞培养板之上，即可。
[0018] 步骤b中，AP侧指顶端，化指底端。
[001引其中，步骤b中：
[0020] 铺有鼠尾胶原的培养皿是按照如下方法制备：取Millicell息挂式培养皿，加入 浓度为50y g/ml的I型鼠尾胶原，加样量为IOOy l/cm2,紫外照射1小时，放入37°C，5% C〇2培养箱内过夜，PBS清洗3次，即可；
[0021] 取第4代细胞；连续培养21天；更换培养液的方式为接种2化后更换培养液，前一 周隔天换液，一周后每天换液。
[0022] 其中，步骤d中，培养3天。
[0023] 本发明还提供了一种制备前述联合细胞模型的方法，它包括如下步骤：
[0024] a、取化CO-2细胞，复苏，加入DMEM-20%培养液中培养，按1:3传化培养2代后， 换成DMEM-IO %培养液继续传代培养；
[00巧]b、取铺有鼠尾胶原的培养皿和步骤a制备的第3?15代中任意一代细胞，调整细 胞密度为1. 5 X IO5个/mU从AP侧接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上，在培养皿化侧加入 DMEM-10%培养液，置于37°C，含5% C〇2的培养箱中培养，连续培养17?25天，期间更换 培养液，得载有化CO-2细胞模型的培养皿；
[0026] 〇、取心02肝细胞，复苏，加入0161-20%培养液中培养，按1:3传代，培养2代后， 换成DMEM-IO %培养液继续传代培养；
[0027] t取步骤C制备的k02肝细胞混息液，调整细胞密度为1. 5X IO5个/ml,接种于 铺有鼠尾胶原的细胞培养板上，每孔加入2ml并每天换液，培养1?5天，得载有k02肝细 胞模型的细胞培养板；
[0028] e、将步骤b所得载有化CO-2细胞模型的培养皿，置于步骤d所得载有k02肝细 胞模型的细胞培养板之上，即可。
[002引其中，步骤b中：
[0030] 铺有鼠尾胶原的培养皿是按照如下方法制备：取Millicell息挂式培养皿，加入 浓度为50y g/ml的I型鼠尾胶原，加样量为IOOy l/cm2,紫外照射1小时，放入37°C，5% C化培养箱内过夜，用PBS清洗3次，即可；
[0031] 取第4代细胞；连续培养21天；更换培养液的方式为接种2化后更换培养液，前一 周隔天换液，一周后每天换液。
[0032] 其中，步骤d中，培养3天。
[0033] 本发明还提供了前述联合细胞模型的筛药方法，它包括如下步骤：
[0034] ①采用前述联合细胞模型，取待检药物，从化CO-2细胞模型一侧施药；
[00巧]②收集k02肝细胞模型一侧样品，检测，根据检测结果评价待检药物。
[0036] 将化CO-2细胞模型和k02肝细胞模型作为一个联合细胞模型整体来使用，不仅 可W使联合细胞模型更加准确地模拟人体药物吸收和代谢过程，使得研究结果更加准确， 对高通量的药物筛选有着重要意义，还避免了细胞模型与人体间存在种属差异，本发明提 供了一种与人体内环境更加相似的联合细胞模型。同时，本发明k〇2肝细胞的培养方法简 便。
[0037] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0038] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1聚醋膜内化CO-2细胞培养10天后的形态
[0040] 图2聚醋膜内化CO-2细胞培养21天后的形态
[0041] 图3透射电镜观察聚醋膜内化CO-2细胞培养21天后的形态
[0042] 图4培养24小时的k02肝细胞形态
[0043] 图5培养3天的k02肝细胞形态
[0044] 图化-02肝细胞第1-7天的ALB，BUN分泌情况
[0045] 图7ADME/TOX并联测试体系示意图
[0046] 图8模型组给药后2化细胞形态
[0047] 图9空白DMEM色谱图
[0048] 图10空白DMEM溶液加内标卡马西平色谱图
[0049] 图11吴莱英碱、吴莱英次碱和内标卡马西平混合物色谱图
[0050] 图12上细胞前吴莱英水提物色谱图
[0051] 图13吴莱英水提物经细胞作用色谱图
【具体实施方式】
[0052] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0053] 实施例1本发明联合细胞模型的建立
[0054] 1实验材料
[00巧]1. 1 细胞株化。〇-2 细胞株购自美国 ATCC(American Type Qilture Collection)。
[0056] I. 2细胞株k02细胞株购自中国典型培养物保藏中也CCTCC (化ina Center化r Type Culture Collection)
[0057] I. 3主要试剂和药品DMEM培养基、膜蛋白酶购自Gibco公司，皿SS、I型鼠尾胶原、 邸TA，2化、肥阳S、非必需氨基酸购自Sigma公司，胎牛血清购自PAA公司，青霉素和链霉素 购自Amresco公司，其余试剂均为国产分析纯。所用缓冲液为皿SS溶液，pH 7. 2?7. 35。
[0058] 1. 4主要器材和仪器；6孔板（Costar)，Millicell息挂式培养皿（聚醋膜， 孔径LOym)、90mm平板过滤器、Millicell-ERS跨膜电阻仪、超纯水系统（Millipore， 美国），3111水套式C02培养箱（Forma,美国），DMLL倒置相差显微镜（Leica，德国）， XSZ-H7双目生物显微镜（重庆），SW-CJ-2F双人双面超净工作台（苏州净化设备有限公 司），ALLEGRAX-15R台式冷冻离也机炬eckman,美国），MLS-3070高压灭菌锅（H洋，日 本），YDS-50B-80液氮容器（乐山市东亚机电工贸有限公司），CP-22抓型精密电子天平 (Sartorius)，PB-IO酸度计（Sartorius)，抑-ID-50冷冻干燥机（北京博医康），7020全自 动生化测试仪（日立，日本），XW-80A縱润混旋仪（海青浦沪西）。
[00则 2实验方法
[0060] 2. 1建立Caco-2细胞模型
[0061] 2. 1. lCaco-2细胞的复苏及传代
[0062] 从液氮中取出化CO-2细胞，立即放入37C水浴。快速融化后，将化CO-2细胞转移 至盛有8ml DMEM-20% (37C)培养液的离也管中，混匀，在900转的速度下离也5min，如此 重夏贸心3次后,得到化c〇-2细胞息浮液。将化c〇-2细胞息浮液转移至细胞抬养瓶中，放 入恒温培养箱中培养，第二天换液，W后隔天换液。当培养瓶内细胞汇合达到约80%左右 时，倾去旧的培养液，加入0. 25 %膜蛋白酶-0. 02%邸TA溶液消化。在倒置相差显微镜下 观察细胞形态变化，约2min后，细胞间隙变大，细胞变圆，立即停止消化，倒掉消化液，加入 6ml DMEM-20%培养液，轻轻将细胞吹落至瓶底并混匀，转移至离也管中，在900转的速度下 离也5min，倒去上清液，加入6ml DMEM-20%培养液，混匀，按1 ;3传代。用DMEM-20%培养 液继续培养两代后，换成DMEM-IO %培养液培养。
[0063] 2. 1. 2MiIlicell膜涂铺I型鼠尾胶原
[0064] 将Millicell息挂式培养皿放入6孔培养板，加入浓度为50 U g/ml的I型鼠尾胶 原IOOy l/cm2(452 y 1)，将培养板在超净工作台内用紫外线照射，1小时后，放入37°C，5% 〇化培养箱内过夜，拿出后，用皿SS清洗Millicell膜3次，备用。
[0065] 2. 1. 3Cac〇-2细胞的接种及培养
[0066] 实验时，取复苏第4代W后的细胞，按2. 1. 1项下传代，调整密度为1. 5 X 1〇5个/ 血，接种在Mi 11 icel 1膜上。在Mi 11 icel 1膜的AP侦U，加入混匀的细胞息液2ml，化侧加入 DMEM-10%培养液4ml。将细胞置于37C，含5% C〇2的培养箱中培养，接种2化后更换培养 液。前一周隔天换液，之后每天换液，连续培养21天。
[0067] 2. 1. 4Cac〇-2细胞模型的验证
[0068] ①倒置相差显微镜观察细胞形态；每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。 细胞接种化后开始贴壁，生长至第4天左右时汇合达80%，膜上可看到细胞形态。由图1 可知，生长10天W后细胞边界清晰，为不规则多边形。由图2可知，生长21天时，各细胞间 如铺路石镶嵌排列，互不重叠，为典型单层形态。
[0069] ②透射电镜观察细胞形态；由图3可知，细胞生长至21天时，由微绒毛形成的刷状 缘非常整齐致密，细胞之间的紧密连接和桥粒出现在腔侧。
[0070] ③跨膜电阻值的测定：用Millicell-邸S跨膜电阻仪隔天测定Caco-2细胞的跨膜 电阻值，每次测量电阻前，电极用PBS浸泡过夜，使用前用75%己醇浸泡30min，然后用培养 液浸泡15min备用。
[0071] 化CO-2细胞的跨膜电阻值=(测定值一空白膜电阻值）XMillicell膜面积
[0072] 化CO-2细胞的TE邸值在前6天增长迅速，6天后TE邸值维持在一个稳定的范围 内，21天时，Cac〇-2细胞跨膜电阻值大于550 Q ? cm2。
[0073] 2. 1. 5 小结
[0074] 上述方法建立的化CO-2细胞模型重复性好，通过电阻值测定发现，21天时，T邸R 值大于550 Q ? cm2。
[00巧]2. 2建立k02肝细胞模型
[0076] 2. 2.比-02肝细胞的复苏及传代
[0077] 从液氮中取出k02肝细胞，立即放入37C水浴。快速融化后，将k02肝细胞转移 至盛有8ml DMEM-20% (37C)培养液的离也管中，混匀，在900转的速度下离也5min，如此 重复离也3次后，得到k02肝细胞息浮液。将k02肝细胞息浮液转移至细胞培养瓶中，放 入恒温培养箱中培养，第二天换液，W后隔天换液。当培养瓶内细胞汇合达到约80%左右 时，倾去旧的培养液，加入0. 25%膜蛋白酶-0. 02%邸TA溶液消化。在倒置相差显微镜下 观察细胞形态变化，约2min后，细胞间隙变大，细胞变圆，立即停止消化，倒掉消化液，加入 6ml DMEM-20%培养液，轻轻将细胞吹落至瓶底并混匀，转移至离也管中，在900转的速度下 离也5min，倒去上清液，加入6mlDMEM-20%培养液，混匀，按1 ;3传代。用DMEM-20%培养 液继续培养两代后，换成DMEM-IO %培养液培养。
[0078] 2. 2. 2k02肝细胞的接种及培养
[0079] 实验时，取复苏第4代W后的k02肝细胞，按2. 2. 1项下传代，调整密度为 1. 5 X 1〇5个/mL,接种于铺有鼠尾胶原的6孔板上，每孔加入2ml细胞息液，并每天更换培 养液。
[0080] 2. 2. 3k02肝细胞模型的验证
[0081] ①用台盼蓝染色排斥法测定肝细胞活力；将肝细胞息液与0.4%的台盼蓝溶液 1 : 1混匀，立即用全自动细胞分析仪计算活细胞百分率。
[0082] 图像显示活肝细胞呈透亮，圆形，立体感较强，死肝细胞被蓝染，细胞膜模糊已破 损，经计数后，肝细胞存活率在95 % -98 %。
[0083] ②倒置相差显微镜观察细胞形态；每天在倒置相差显微镜下观察细胞情况。
[0084] 取复苏第4代W后的k02肝细胞，接种于铺有鼠尾胶原的6孔板上。24小时后， 肝细胞已经贴壁，培养3天的肝细胞镜下可见相互之间连接成片，可见细胞核呈单核或双 核（图4、图5)。
[0085] ③k02肝细胞功能学检测；连续培养肝细胞7天，每天换液，取细胞培养上清液 Iml，300化/min离也5min后取上清，全自动生化仪测定ALB、BUN浓度。
[0086] 如图6所示，L-02肝细胞的分泌功能在第1、2天开始恢复，其ALB的分泌功能在第 3天出现高峰，然后逐渐衰退，BUN的分泌在第3-4天是其活跃的高峰期，其后也开始衰退。
[0087] 2. 2. 4 小结
[008引本发明建立了 k02肝细胞模型。通过对肝细胞存活率的检测，形态变化的观察， W及对其分泌功能的检测，结果显示，本实验建立的肝细胞存活率在95% -98%，ALB的分 泌在第3天达到高峰，BUN的分泌在第3、4天达到高峰。因此，W第3天为给药时间。
[0089] 2. 3联合模型的建立
[0090] 在化CO-2细胞模型建立21天时，用皿SS清洗化CO-2细胞3次后，显微镜下观察 细胞，选用细胞膜完整、排列紧密无脱落且电阻值大于550 Q 'cm2的化CO-2细胞。用皿SS 清洗已培养3天的肝细胞3次，尽量将死细胞洗去，镜下见细胞形态清晰，连接呈岛状，多数 呈双核。将可用的化CO-2细胞（Millicell膜）提出，轻放入种有k02肝细胞的6孔板上， 即得本发明联合细胞模型，如图7所示。
[0091] 经观察，两种细胞之间无相互抑制作用，证明本发明成功建立了吸收和代谢的联 合细胞模型。
[0092] 实施例2用本发明联合细胞模型考察吴莱英ADME特征
[0093] 吴莱英为芸香料植物吴莱英Evodia rutaeca巧a (Juss) Benth,石虎Evodia TUtaecarpa(JuSs)Benth var officinalis (Dode)Huang 或疏毛 吴莱英 Evodia !11136。3巧3(]1133)86]11：11.￥31'130(1；[]1161'；[值0(16)化3叫的干燥近成熟果实。能散寒止痛，降 逆止呕，助阳止泻。为温中止痛的必备药。吴莱英含有多种化学成分，目前从中分离的主要 有生物碱类、苦味素类、挥发类等化学成分，其中生物碱类成分是吴莱英的主要化学和生物 活性成分。生物碱类成分中吴莱英碱巧VO)、吴莱英次碱（Rut)是其主要活性成分。
[0094] 本实施例通过吴莱英水提物（WZY)中吴莱英碱巧VO)、吴莱英次碱（Rut)的吸收代 谢来考察本发明联合细胞模型的准确性，设置2组对照组，分别为化C0-2细胞模型组，L-02 肝细胞模型组。
[0095] 根据现有技术，吴莱英碱巧VO)、吴莱英次碱（Rut)在化C0-2细胞模型和大鼠体内 的吸收代谢方式为；Rut在大鼠在体肠吸收模型中的吸收为被动扩散过程。Rut在化C0--2 细胞模型中的吸收W被动扩散为主，载体参与的协助扩散同时存在。Evo和Rut体内代谢研 究表明二者均主要W原形方式代谢排泄。
[0096] 具体地；1、化C0-2细胞模型组因缺少肝细胞模型，其最终得到的样品中吴莱英碱 (Evo)和吴莱英次碱（Rut)含量应当高于联合模型组；2、肝细胞模型组中因未经过化C0-2 细胞吸收而直接作用于肝细胞，样品中吴莱英碱、吴莱英次碱含量应当高于化C0-2细胞模 型组和联合模型组。
[0097] 1实验材料和方法 [009引 1. 1实验材料
[0099] 1. 1. 1受试样品吴莱英水提物（WZY)由四川省中医药科学院中药化学研究所提 供。
[0100] 1. 1. 2 细胞株化。〇-2 细胞株购自美国 ATCC (American Type Qilture Collection), 1^-02细胞株购自中国典型培养物保藏中也CCTCC(Qiina Center for Type Culture Collection)
[0101] I. I. 3主要试剂和药品；DMEM培养基、膜蛋白酶、IV型胶原酶购自Gibco公司， 皿SS、I型鼠尾胶原、邸TA ? 2化、肥阳S、非必需氨基酸购自Sigma公司，胎牛血清购自PAA 公司青霉素和链霉素购自Amresco公司，吴莱英碱标准品（含量> 98% )、吴莱英次碱标准 品（含量>98%)购自成都曼思特生物科技有限公司；内标物卡马西平，购自中国食品药 品检定研究院，色谱纯甲醇购自美国fisher公司，其余试剂均为国产分析纯。
[0102] 1. 1. 4主要器材和仪器；6孔板（Costar)，息挂式培养皿（聚醋膜，孔径1. 0 U m)、 90mm平板过滤器、Millicell-ERS跨膜电阻仪、超纯水系统（Millipore，美国），3111水套 式C02培养箱（Forma,美国），DMLL倒置相差显微镜（Leica，德国），XSZ-H7双目生物显微 镜（重庆），SW-CJ-2F双人双面超净工作台（苏州净化设备有限公司），ALLEGRAX-15R台式 冷冻离也机炬eckman，美国），MLS-3070高压灭菌锅（H洋，日本），YDS-50B-80液氮容器 (乐山市东亚机电工贸有限公司），美国Agilent 1200RRLC-6410 triple qua化upole液质 联用系统，配有G1312B二元粟、G1322B真空脱气机、G1329B自动进样器和G131她柱温箱， 使用Mass化nter软件控制系统及数据处理。CP-22抓型精密电子天平（Sartorius) ,PB-IO 酸度计（Sartorius),抑-ID-50冷冻干燥机（北京博医康），7020全自动生化测试仪（日 立，日本），XW-80A縱润混旋仪（海青浦沪西）。
[0103] 1.2实验方法
[0104] 1.2. 1分组及给药
[0105] ①联合模型组（本发明联合细胞模型）；在化CO-2细胞AP侧加入2ml吴莱英水 提物，肝细胞侧炬L侧）加入3ml DMEM液，分别于1、2、24小时后收集肝细胞侧样品，-2(TC 冻存。
[0106] ②肝细胞模型组；在肝细胞模型中加入2ml吴莱英水提物，作用24小时后收集样 品，-2(TC冻存。
[0107] ③化CO-2模型组：在化CO-2模型AP侧加入2ml吴莱英水提物，化侧加入3ml DMEM液，分别于1、2、24小时后收集化侧样品，-2(TC冻存。
[010引 1.2. 2细胞样品处理
[0109] 微量加样器精密吸取待测细胞培养液DMEM 600 y 1，内标物卡马西平 4〇111巧04叫.1111-1)、置1.51]11离也管中、冷冻干燥后，加入60〇111甲醇溶解，润旋混匀11]1；[]1， 12 000转离也lOmin，0. 22 y m微孔滤膜过滤，取上清液10 y 1进样测定。
[0110] 2分析方法
[0111] 2.1色谱条件
[011引 色谱柱；Welch Materials Xtimate-Cis, (2. 1 X 150mm, 3 Ji m);流动相：甲醇-水 (85:15)含10臟01.。己酸馈；流速；0.21111.111111-1;柱温；301：;进样量；10^1。
[011引 2. 2质谱条件
[0114] 采用电喷雾离子化源巧SI),正离子模式，喷雾电压4000V，源温度为IOCTC ;雾化 气为氮气，雾化压力为40psi ;去溶剂气为氮气，温度35(TC，流速为lOL/min ;碰撞气为高纯 氮气，压力为0. IMPa ;采用MRM模式对药物检测，质谱条件如下：
[011 引
【权利要求】
1. 一种联合细胞模型，其特征在于：它包括Caco-2细胞模型和L-02肝细胞模型，所述 Caco-2细胞模型与L-02肝细胞模型以半透膜相隔。
2. 根据权利要求1所述的联合细胞模型，其特征在于：所述半透膜为聚碳酸酯膜、聚酯 膜或混合纤维素膜，膜孔径为〇. 4?8. 0 y m。
3. 根据权利要求2所述的联合细胞模型，其特征在于：所述聚酯膜为Millicell悬挂 式培养皿。
4. 根据权利要求1所述的联合细胞模型，其特征在于：所述Caco-2细胞模型是细胞跨 膜电阻值大于等于550 Q ? cm2的细胞系。
5. 根据权利要求1所述的联合细胞模型，其特征在于：其是按照如下方法制备而成： a、 取Caco-2细胞，复苏，加入DMEM-20%培养液中培养，按1:3传代，培养2代后，换成 DMEM-10%培养液继续传代培养； b、 取铺有鼠尾胶原的培养皿和步骤a制备的第3?15代中任意一代细胞，调整细胞 密度为1. 5X 105个/mL，从AP侧接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上，在培养皿BL侧加入 DMEM-10%培养液，置于37°C，含5% C02的培养箱中培养，连续培养17?25天，期间更换 培养液，得载有Caco-2细胞模型的培养皿； c、 取L-02肝细胞，复苏，加入DMEM-20%培养液中培养，按1:3传代，培养2代后，换成 DMEM-10%培养液继续传代培养； d、 取步骤c制备的L-02肝细胞混悬液，调整细胞密度为1. 5 X 105个/ml，接种于铺有 鼠尾胶原的细胞培养板上，每孔加入2ml并每天换液，培养1?5天，得载有L-02肝细胞模 型的细胞培养板； e、 将步骤b所得载有Caco-2细胞模型的培养皿，置于步骤d所得载有L-02肝细胞模 型的细胞培养板之上，即可。
6. 根据权利要求5所述的联合细胞模型，其特征在于：所述步骤b中： 铺有鼠尾胶原的培养皿按照如下方法制备：取Millicell悬挂式培养皿，加入浓度为 50y g/ml的I型鼠尾胶原，加样量为100iil/cm2,紫外照射1小时，放入37°C，5% C02培养 箱内过夜，PBS清洗3次，即可； 取第4代细胞；连续培养21天；更换培养液的方式为接种24h后更换培养液，前一周隔 天换液，一周后每天换液。
7. 根据权利要求5所述的联合细胞模型，其特征在于：步骤d中，培养3天。
8. -种制备权利要求1?7任意一项所述联合细胞模型的方法，其特征在于：它包括 如下步骤： a、 取Caco-2细胞，复苏，加入DMEM-20%培养液中培养，按1:3传代，培养2代后，换成 DMEM-10%培养液继续传代培养； b、 取铺有鼠尾胶原的培养皿和步骤a制备的第3?15代中任意一代细胞，调整细胞 密度为1. 5 X 105个/mL，从AP侧接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上，在培养皿BL侧加入 DMEM-10%培养液，置于37°C，含5% C02的培养箱中培养，连续培养17?25天，期间更换 培养液，得载有Caco-2细胞模型的培养皿； c、 取L-02肝细胞，复苏，加入DMEM-20%培养液中培养，按1:3传代，培养2代后，换成 DMEM-10%培养液继续传代培养； d、 取步骤c制备的L-02肝细胞混悬液，调整细胞密度为1. 5 X 105个/ml，接种于铺有 鼠尾胶原的细胞培养板上，每孔加入2ml并每天换液，培养1?5天，得载有L-02肝细胞模 型的细胞培养板； e、 将步骤b所得载有Caco-2细胞模型的培养皿，置于步骤d所得载有L-02肝细胞模 型的细胞培养板之上，即可。
9. 根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述步骤b中： 铺有鼠尾胶原的培养皿按照如下方法制备：取Millicell悬挂式培养皿，加入浓度为 50y g/ml的I型鼠尾胶原，加样量为100iil/cm2,紫外照射1小时，放入37°C，5% C02培养 箱内过夜，用PBS清洗3次，即可； 取第4代细胞；连续培养21天；更换培养液的方式为接种24h后更换培养液，前一周隔 天换液，一周后每天换液； 所述步骤d中，培养3天。
10. 使用权利要求1?7任意一项所述联合细胞模型筛选药物的方法，其特征在于：它 包括如下步骤： ① 采用权利要求1?7任意一项所述的联合细胞模型，取待检药物，从Caco-2细胞模 型一侧施药； ② 收集L-02肝细胞模型一侧样品，检测，根据检测结果评价待检药物。
【文档编号】C12Q1/02GK104357398SQ201410624752
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】赵军宁, 鄢良春 申请人:四川省中医药科学院