专利名称：多能干细胞的传代方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及多能干细胞的传代方法及其用途。
背景技术：
多能干细胞(Pluripotent Stem Cells,PSCs)可以在体外适宜的条件下快速增殖而不分化，并且在经过体外大量扩增后，再给予特定条件处理，例如使用蛋白质或小分子化合物的组合诱导，可以使其定向的分化成具有特定功能的细胞，将这些分化后失去多能性的特定细胞收集起来就可用于治疗人类的相关疾病，例如可以将多能干细胞诱导成神经细胞后，注入大脑内用于治疗因神经元缺损导致的老年性痴呆或亨廷顿氏症。工业化生产中，多能干细胞的常见增殖培养方式是贴壁培养和悬浮培养。其中，相比贴壁培养，悬浮培养方式有很多优点，适用于工业化大规模的生产模式，是未来干细胞生物研究和应用发展的趋势所亟需的技术:悬浮培养的多能干细胞的分布呈球形，易于操作处理和回收细胞；悬浮培养可以充分利用空间及培养基，便于集中控制并降低成本，提高效率；悬浮系统产出的多能干细胞更利于向特定功能细胞如神经前体细胞和中胚层心肌前体细胞分化。细胞培养过程中，当多能干细胞增殖达到一定密度后，需要进行传代，进行再培养。现有的传代方法主要有机械传代、酶消化传代，以及酶消化加机械传代三种方式。现有的机械传代是利用极细的玻璃丝将大的集落划切成数枚小片传代，可用于贴壁培养，而悬浮培养的多能干细胞呈实体球状，其毫无附着，无法固定，很难用玻璃丝将其划开，因而不适宜用现有机械 传代。酶消化传代是向细胞中加入胰酶等酶进行消化处理，使细胞分散后传代；可用于贴壁培养，而酶消化对悬浮培养的细胞球表面的细胞起作用快，而球内部细胞消化慢，造成消化不均一，影响了传代细胞的性能，例如团块大于150微米的多能干细胞小块在接种到小鼠饲养层细胞上后易于自发分化，而小于40微米的多能干细胞小块则易于死亡。因而悬浮培养不适宜用酶消化传代。酶消化配合移液枪吹打相较单独酶消化，虽然消化相对均匀，但传代时仍不易掌握和控制，导致制备的小团块大小不均一，无法抑制自发分化，并且降低定向分化的可行性。并且长期采用酶消化，容易引起多能干细胞发生染色体变异或缺失。可见，现有的细胞传代方法不适于悬浮培养多能干细胞的传代。
发明内容
本发明提供了一种多能干细胞的传代方法及其用途，实现了悬浮培养体系中多能干细胞的传代。本发明的技术方案是这样实现的:多能干细胞的传代方法，包括下列步骤:步骤A:将多个多能干细胞小球移入培养基中，并混合均匀；
步骤B:利用移液器吸取混于培养基的所述多能干细胞小球，并利用所述移液器产生的压力挤压混于培养基的所述多能干细胞小球，使其通过30-70 μ m细胞筛的筛网，形成混于培养基的多能干细胞小团块；步骤C:将所述混于培养基的多能干细胞小团块移入新的培养皿中，继续培养，完成传代；所述多能干细胞小球为悬浮培养形成的多能干细胞的球状聚集体，并且所述多能干细胞小球的直径为240±40μπι。进一步地,所述步骤B包括:利用移液器将混合后的混于培养基的所述多能干细胞小球，分批通过30-70 μ m细胞筛的筛网；并且每批吸取800μ I混于培养基的所述多能干细胞小球，每批在所述筛网的不同位置通过。进一步地,所述步骤A包括:将每70-90个所述多能干细胞小球移入3ml所述培养基中，并混合均匀。进一步地，所述移液器为移液枪，所述移液枪所用的枪头为带滤芯枪头。进一步地,所述步骤A之前进一步包括:向所述培养基中加入10 μ mo I/L Rock抑制剂Y-27632，并将所述培养基在37°C水浴中预热。进一步地，所述步骤A中的混合均匀包括:利用移液管或移液枪反复吸吹。进一步地，所述继续培养包括:将所述培养皿置于37°C，含5%C02的培养箱中。进一步地，所述步骤B之后和所述步骤C之前进一步包括:用磷酸盐缓冲液或培养基润湿所述培养皿的底部的内表面。进一步地，所述细胞筛为尼龙筛网的无菌细胞筛，和/或，所述培养基为无血清成分确定培养基；和/或，所述培养皿为皮氏培养皿。所述的多能干细胞的 传代方法的用途，所述多能干细胞的传代方法用于脊椎动物门的胚胎干细胞和诱导多能性干细胞的传代。与现有技术相比，本发明提供的多能干细胞的传代方法是:用移液器吸取悬浮培养的多能干细胞小球，并利用该移液器产生的压力使细胞小球通过细胞筛的筛网，同时利用筛网具有均匀小孔的特点，从而将其切割成均匀的圆柱形小团块，进行传代，其中，无需细胞自身具有附着点，并且为无酶消化的传代，因而避免了细胞染色体变异；可见，该方法适于悬浮培养形成的多能干细胞小球，利用该方法传代后多能干细胞存活率高，可以达到90%，每次传代比率可达1:8至1:10。此外，本发明提供的技术方案还可以达到下列技术效果:(I)简单易行:本发明通过细胞筛和移液器两个工具，即可完成传代，所用工具操作简单易行。(2)成本低，耗时少:本发明的传代方法无需酶消化，因而避免了酶消化中涉及的清洗、处理、终止等繁琐步骤，因而不仅节省了酶试剂所需的成本，而且节省了生产时间，可用于工业化量产多能干细胞。(3)提高细胞活性，防污染:本发明分批切割多能干细胞小球，可以保证得到的细胞小团块尺寸更均匀，从而提高细胞活性；并且每批都在细胞筛的不同位置切割，可以防止污染。(4)培养基安排合理:每70-90个多能干细胞小球用3ml培养基，体积适量，既可以保证细胞生长所需的营养，又可以避免培养基的浪费。(5)切割所用的气流均匀和缓:使用带滤芯的枪头，可以产生均匀和缓的气压，从而进一步提高切割的均匀性。(6)增加细胞的存活率:培养基中加入Rock抑制剂Y-27632，可显著促进细胞增殖，提闻细胞的克隆球形成能力。(7)保证培养基顺利铺展:用磷酸盐缓冲液或培养基润湿所述培养皿的底面，增加了培养皿的浸润性，从而保证培养基可以顺利铺展，防止多能干细胞克隆球相互聚集成团，抑制了自发分化，提高干细胞品质。
为了更清楚地说明本发明的具体实施方式
，下面将对具体实施方式
中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明的实施例一提供的多能干细胞的传代方法流程图；图2为本发明的实施例二提供的悬浮培养的多能干细胞小球的形态图；图3为本发明的实施例二提供的多能干细胞传代当天和传代第二日的形态图；图4为本发明的实施例二提供的人类胚胎干细胞的8次传代后的多能性染色鉴定结果具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。实施例一多能干细胞的传代方法，如图1所示，包括下列步骤:步骤101:将多个多能干细胞小球移入培养基中，并混合均匀；步骤102:利用移液器吸取混于培养基的所述多能干细胞小球，并利用移液器产生的压力挤压混于培养基的所述多能干细胞小球，使其通过30-70 μ m细胞筛的筛网，形成混于培养基的多能干细胞小团块；步骤103:将所述混于培养基的多能干细胞小团块移入新的培养皿中，继续培养，完成传代；所述多能干细胞小球为悬浮培养(非贴壁式)形成的多能干细胞球状聚集体，并且所述多能干细胞小球的直径为240±40 μ m。与现有的传代方法相比， 本实施例的传代方法具有以下优点:
(I)充分考虑悬浮培养的多能干细胞的球体形状:用移液器携带悬浮培养的多能干细胞小球，并利用该移液器产生的压力使细胞小球通过细胞筛，同时利用细胞筛具有均匀小孔的特点，从而将其切割成大小均匀的直径为30-70μπι的圆柱形小团块，进行传代，其中，无需细胞自身具备附着点或事前的特殊处理。(2)避免多能干细胞的变异:本实施例的方法为无酶消化的传代，因而避免了细胞染色体变异。(3)简单易行:本方法通过细胞筛和移液器两个工具，即可完成传代，所用工具操作简单易行。(4)成本低，耗时少:本方法无需酶消化，因而避免了酶消化中涉及的清洗、处理、终止等繁琐步骤，因而不仅节省了酶试剂所需的成本，而且节省了生产时间，一次传代在l-3min即可完成，这样可以应用于工业自动化大规模量产多能干细胞。由此可见，本发明方法更适用于悬浮培养多能干细胞的工业化生产，为研究和医疗需要的大量多能干细胞生产提供了可靠的技术基础。本实施例还提供了上述方法的用途:所述多能干细胞的传代方法用于脊椎动物门的胚胎干细胞和诱导多能性干细胞的传代。为了进一步提高上述实施例的实用性，可以在以下方面进行改进:优选地,所述步骤101之前进一步包括`:向所述培养基中加入10 μ mol/L Rock抑制剂Y-27632，并将所述培养基在37°C水浴中预热。因为培养基中加入Rock抑制剂Y-27632，可显著促进细胞增殖，提高细胞的克隆形成能力。优选地，步骤101中，将每70-90个所述多能干细胞小球移入3ml所述培养基中，并混合均匀。因为每70-90个多能干细胞小球所传代后的多能干细胞小球置用3ml培养基，体积适量，既可以保证细胞生长所需的营养，又可以避免培养基的浪费。优选地，步骤102中，利用移液器将混于培养基的所述多能干细胞小球，分批通过30-70 μ m细胞筛，得到多能干细胞小团块；并且每批吸取800 μ I混于培养基的所述多能干细胞小球，每批在所述细胞筛的不同位置通过。因为分批切割多能干细胞小球，可以保证得到的细胞小团块尺寸更均匀，从而提高细胞活性；并且每批都在细胞筛的不同位置切割，可以防止污染。优选地，所述移液器为移液枪，所述移液枪所用的枪头为带滤芯枪头。因为使用带滤芯的枪头，可以产生均匀和缓的气压，从而进一步提高切割的均匀性。优选地，所述步骤102之后和所述步骤103之前进一步包括:用磷酸盐缓冲液或培养基润湿所述培养皿的底部的内表面。因为用磷酸盐缓冲液或培养基润湿所述培养皿的底面，增加了培养皿的浸润性，从而保证培养基可以顺利铺展，可以防止多能干细胞小球自发聚合成团。优选地，所述步骤101中的混合均匀进一步包括:利用移液管或移液枪反复吸吹。优选地，所述步骤103中的所述继续培养进一步包括:将所述培养皿置于37°C，含5%C02的培养箱中。优选地，所述细胞筛为尼龙筛网的无菌细胞筛。优选地，所述培养基为mTeSRl培养基；所述培养皿为皮氏培养皿。
由此可见，经过改进，本发明的传代方法的实用性在以下发明得到了进一步提高:试剂得到充分利用，细胞的切割更均匀，细胞的存活率高，操作更简单易行，从而使本发明的适用范围更广。为了更充分说明本发明的改进点，以下实施例二提供了具体试验例。实施例二以下试验例所用的多能干细胞均为人类胚胎干细胞BG02。将悬浮培养的多能干细胞在平均直径达到240 μ m时进行利用细胞筛进行传代。第一步:轻轻晃动培养皿，使悬浮培养的多能干细胞小球聚集在培养皿中央。第二步:使用200 μ I的移液枪无选择的吸取少量多能干细胞小球置于96孔板的一个孔中。第三步:在显微镜下计数，调整小球个数至70-90个。第四步:将小孔中的多能干细胞小球转移至3ml37°C预热的培养基中(内含10μ mol/L Rock 抑制剂 Y-27632)。第五步:将直径为40 μ m细胞筛置于洁净的小管上。第六步:用移液枪轻轻吹吸步骤4中的多能干细胞小球，用Iml带滤芯的枪头吸取800 μ I的培养基。第七步:将枪头轻轻的抵紧细胞筛网面，缓缓按压使培养基及多能干细胞小球通流流过筛网流入下面的洁净 小管中，得到混于培养基的多能干细胞小团块。第八步:重复步骤6-7直至3ml培养基及多能干细胞小球全部通流完毕，且每次通过筛网面的位置不同。第九步:撤去细胞筛，使用5ml的移液枪轻轻吹吸传代后的多能干细胞小团块及
培养基3次。第十步:吸取全部的步骤9中溶液在35_直径的皮氏培养皿中央注入，注入时使液流垂直。第十一步:将培养皿轻轻的移入培养箱中，在移入过程中尽量不要使液面发生波动。上述细胞在传代后24h内不要移动培养皿。上述第一步中的悬浮培养的多能干细胞小球形状如图2所示，左侧为4X镜下照片，右侧为IOX镜下照片。传代当天仅为d0日，传代第二日(dl)进行照相和换液，。照相:在传代后24_30h内将培养皿取出，轻轻晃动，使多能干细胞小球聚集于培养皿中央。利用4X镜下拍摄照片。利用摄像软件测量200个以上的多能干细胞小球直径，计算平均直径。多能干细胞在传代当天的形态如图3的左侧所示，在传代第二日的形态如图3的右侧所示。换液过程:在传代24小时后需要更换不含Y-27632的新鲜培养基。吸取培养皿中的培养基并用2ml预热的PBS涮一下培养基，回收剩余的多能干细胞小球离心500rpm, 5min ;去掉上清，用3ml新鲜的预热过的培养基重悬细胞沉淀，后按实施例1中步骤十，十一铺入原来的培养皿中，放入培养箱中继续培养。检验多能干细胞经过8次传代后的多能性。检验方法:免疫染色法。将经过8次通流细胞筛传代后的人类胚胎干细胞BG02在传代后第I天转移到小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层细胞上，待其贴壁，观察其是否形成并恢复典型的平面生长形态，在贴壁后进行多项多能性标记物免疫染色鉴定，方法如下(以Oct-3为例):将贴壁的BG02品在4%多聚甲醛中固定lOmin，PBS洗两次，每次5min。加入0.3%Triton-X1002mL,室温放置 lOmin，随后 PBS 洗两次，每次 5min。样品在5%BSA中封闭20min，PBS稀释一抗(鼠抗Oct_3IgG)，稀释比例为1:500，将样品与一抗室温孵育lh，随后PBS洗2次，每次5min。所用二抗为生物素化羊抗小鼠IgG，1:100稀释后，将样品与二抗室温孵育30min，随后PBS洗2次，每次5min。SABC-Cy31:100稀释，室温避光，与样品孵育30min，随后PBS洗3次，每次5分钟。DAPI染色:DAPI1:50稀释，与涂片室温孵育10分钟，荧光显微镜观察。SSEA-4和Tra-1-6 0两种抗体的操作方法同上，只需将一抗更换即可。结果:结果如图4所示，可知，采用本发明的方法将人类胚胎干细胞BG02传代8次后，细胞的存活率还可以达到90%以上，进一步说明本发明适用于悬浮培养多能干细胞的传代。上述实验只是选取了本发明研究工作中的一个实验，经过多次实验证明，该方法用于悬浮培养形成的多能干细胞小球传代，每次传代比率可达1:8至1:10。最后应说明的是:以上具体实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述具体实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施方式和具体实施例技术方案的精神和范围。
权利要求
1.多能干细胞的传代方法，其特征在于，包括下列步骤: 步骤A:将多个多能干细胞小球移入培养基中，并混合均匀； 步骤B:利用移液器吸取混于培养基的所述多能干细胞小球，并利用所述移液器产生的压力挤压混于培养基的所述多能干细胞小球，使其通过30-70 μ m细胞筛的筛网，形成混于培养基的多能干细胞小团块； 步骤C:将所述混于培养基的多能干细胞小团块移入新的培养皿中，继续培养，完成传代； 所述多能干细胞小球为悬浮培养形成的多能干细胞的球状聚集体，并且所述多能干细胞小球的直径为240 ±40 μ m。
2.如权利要求1所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述步骤B包括: 利用移液器将混合后的混于培养基的所述多能干细胞小球，分批通过30-70 μ m细胞筛的筛网； 并且每批吸取800μ I混于培养基的所述多能干细胞小球，每批在所述筛网的不同位置通过。
3.如权利要求2所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述步骤A包括: 将每70-90个所述多能干细胞小球移入3ml所述培养基中，并混合均匀。
4.如权利要求1所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述移液器为移液枪，所述移液枪所用的枪头为带滤芯枪头。
5.如权利要求1所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述步骤A之前进一步包括: 向所述培养基中加入 ο μ mo I/L Rock抑制剂Y-27632，并将所述培养基在37°C水浴中预热。
6.如权利要求3所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述步骤A中的混合均匀包括: 利用移液管或移液枪反复吸吹。
7.如权利要求6所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述继续培养包括: 将所述培养皿置于37°C，含5%C02的培养箱中。
8.如权利要求7所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述步骤B之后和所述步骤C之前进一步包括: 用磷酸盐缓冲液或培养基润湿所述培养皿的底部的内表面。
9.如权利要求1-8任一项所述的多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述细胞筛为尼龙筛网的无菌细胞筛，和/或， 所述培养基为无血清成分确定培养基；和/或，所述培养皿为皮氏培养皿。
10.权利要求1-8任一项所述的多能干细胞的传代方法的用途，其特征在于，所述多能干细胞的传代方法用于脊椎动物门的胚胎干细胞和诱导多能性干细胞的传代。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及多能干细胞的传代方法及其用途。该方法包括将定量的多能干细胞小球移入培养基中，并混合均匀；利用移液器吸取混于培养基的所述多能干细胞小球，并利用所述移液器产生的压力挤压，使其通过30-70μm细胞筛的筛网，形成混于培养基的更多的多能干细胞小团块；将所述混于培养基的多能干细胞小团块移入新的培养皿中，完成传代。该方法用于脊椎动物门的胚胎干细胞和诱导多能性干细胞的传代。本发明适于悬浮培养形成的多能干细胞小球，是一种无需酶消化的新型传代方法。利用该方法传代后多能干细胞克隆球存活率高，可以达到90％，每次传代比率可达1:8至1:10，可以满足干细胞大规模量产化的需求。
文档编号C12N5/0735GK103146641SQ20131004850
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者蒋斌, 李天晴, 季维智, 牛昱宇 申请人:云南中科灵长类生物医学重点实验室