专利名称：一种适用于三磷酸腺苷分析的固定荧光素酶的方法
技术领域：
本发明属于生物化学分析领域，更确切的说是一种新的适用于三磷酸腺苷分析的固定荧光素酶的制备方法。
背景技术：
微生物的检测无论是在临床检测还是在工业应用领域都具有重要的意义。当前，对微生物的检测主要采用传统的平板培养计数法，该方法需要较长的时间对微生物在一定条件下进行培养，然后进行平板计数以获取微生物的浓度。平板技术法步骤繁琐、耗时长，很多时候难以满足现场快速检测的要求。ATP生物荧光检测法是近几年发展起来的一种新的微生物检测方法，它具有快速、准确、灵敏等诸多优点。ATP(adenosine triphosphate,中文三磷酸腺苷)作为重要的能量分子存在于所有的生物体内，通过测定一定条件下ATP的数量，可以间接推断微生物的数量或浓度。ATP生物荧光检测法利用微生物细胞内的三磷酸腺苷(ATP)与荧光素-荧光素酶间的复杂生化反应，产生生物荧光，然后通过荧光测定仪或液闪测定仪测定荧光强度。在荧光素、荧光素酶、温度、PH等外界条件相同的情况下，上述荧光强度与ATP的数量成正比关系。`荧光素酶+Mg2+
ATP+荧光素+O2 — AMP + PPi +氧化荧光素+光但是，上述方法长期以来受到萤光素酶稳定性的巨大挑战，外界环境如光、氧气、温度、pH、甚至浓度，都会极大地减低酶的活性。迄今，已经提出了几种上述问题的解决方法。例如，可以通过添加还原剂如DTT等减小酶的被氧化副作用，加入牛血清蛋白提高对酶的保护作用，加入辅酶提高萤光素酶的反应荧光强度。美国专利(U.S.Pat.N0.4，833，075)则采用猪皮胶制备成生物膜，经戊二醛交联后作为载体，制备固定荧光素酶。但上述方法存在制备繁琐、价格较高等缺点。此外，它们的稳定性仍然不够令人满意。
发明内容
本发明的目的是针对现有ATP生物荧光检测中存在的酶稳定性问题，提供一种方便和有效的固定萤光素酶制备方法。本申请人发现,半乳甘露聚糖(Galactomannan,简写为半乳甘露聚糖)等植物多糖可以在醇(如异丙醇)存在的情况下，在水溶液中形成颗粒状悬浮液，水溶液中的萤光素酶可以吸附固定于该悬浮液中的植物多糖颗粒上，将上述固定有萤光素酶的半乳甘露聚糖经过滤干燥后，可以极大的提高萤光素酶的稳定性。本发明提供的制备固定有萤光素酶的植物多糖的步骤是:I)制备萤光素酶溶液:将萤光素酶、还原剂及其它成分如荧光素、牛血清蛋白、Mg2+、螯合剂等按照一定比例配成溶液，获得第一种溶液；
2)配制半乳甘露聚糖溶液:首先配制一定浓度的醇溶液，然后在上述醇溶液中按照一定的配比加入半乳甘露聚糖，搅拌，呈现悬浮状液体，获得第二种溶液；3)将上述第一种和第二种溶液混合，轻轻搅拌一定时间，获得第三种混合液；4)将上述第三种溶液过滤、干燥，获得固定有萤光素酶的植物多糖，称为固定萤光素酶。第一种混合液中所用的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、乙醇胺、巯基乙醇等以及它们的混合物。所述的还原剂的浓度为0.1 100mM/L。第二种混合液中所用的半乳甘露聚糖半乳甘露聚糖包括但不限于胡芦巴胶、关华豆胶、塔拉胶、刺槐豆胶、角豆胶、芦荟胶、魔芋胶等以及它们的混合物。所述的半乳甘露聚糖的浓度为0.1 % 99%
第二种混合液中所用的醇溶液中的醇包括但不限于乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇、环戊醇、环己醇、乙二醇、丙二醇等。所述的醇的浓度为30% 70%。上述发明还提供了一种固定萤光素酶材料。
图1示出了固定萤光素酶和液体萤光素酶在室温条件(20°C )下置放不同时间后的萤光强度对比。图2示出了萤光素酶和半乳甘露聚糖接触不同时间下萤光素酶活性保持率的变化关系。
具体实施例方式下面结合具体的实施例进一步阐述本发明的特点和优点。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明的优点在于:针对现有ATP生物荧光检测中酶稳定性存在的问题，提供一种方便和有效的固定萤光素酶及其制备方法。上述方法制备的固定萤光素酶稳定性好，使用方便，且价格较低，具有工业实用价值。实施例1荧光素酶溶液由以下成分组成::虫突光素酶:5mg/mL虫突光素:1.5mMTricine (pH7.8):20mMMg2+:20mM牛血清蛋白:0.5%DTT: ImMEDTA:50mM
按照上述成分组成配制萤光素酶溶液，将萤光素酶、荧光素、TRICINE缓冲液、Mg2+、牛血清蛋白、还原剂DTT、螯合剂EDTA等按照一定比例配成溶液。配制30%的异丙醇水溶液，在上述醇溶液中加入20 %的瓜儿胶，搅拌成悬浮状液体，加入萤光素酶溶液，继续搅拌lOmin，过滤、干燥后获得固定萤光素酶。将上述固定萤光素酶加入标准ATP溶液中，用微量荧光检测仪(北京滨松光子股份的9504型荧光检测仪)检测荧光强度，记录荧光值。同时，将上述萤光素酶溶液直接与标准ATP溶液混合，作为参比样品，检测萤光强度。图1示出了固定和液体萤光素酶在室温条件(20°C )下置放不同天数后的萤光强度对比，结果显示了虽然初始液体萤光素酶的活性很高，但在第三天后，其萤光强度已经低于固体萤光素酶，证明了固体萤光素酶的稳定性较液体萤光素酶更优。实施例2荧光素酶溶液由以下成分组成::虫荧光素酶:2mg/mL虫荧光素:0.8mMTricine (pH7.8):20mMMg2+:20mM牛血清蛋白:0.5%
DTT: ImMEDTA:50mMEDTA:50mM按照上述成分组成配制萤光素酶溶液，将萤光素酶、荧光素、TRICINE缓冲液、Mg2+、牛血清蛋白、还原剂DTT、螯合剂EDTA等按照一定比例配成溶液。配制45%的乙醇溶液，在上述醇溶液中加入15%的葫芦巴胶，搅拌成悬浮状液体，加入萤光素酶溶液，继续搅拌5min、10min、20min、40min、60min,过滤、干燥后获得固定萤光素酶。将上述固定萤光素酶加入标准ATP溶液中，用微量荧光检测仪(北京滨松光子股份的9504型荧光检测仪)立即检测荧光强度，记录荧光值。结果如图2示。结果显示，不同的接触时间对萤光素酶的活性保持率不同，从5min的10%逐渐上升到20min的45%。进一步的提高接触时间反而导致酶活性的降低。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种制备固定荧光素酶的方法，其特征在于通过悬浮半乳甘露聚糖到荧光素酶的醇溶液中，饱和植物多糖后，对附有荧光素酶的半乳甘露聚糖进行分离、干燥，获得固定于植物多糖的固定荧光素酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于半乳甘露聚糖包括但不限于胡芦巴胶、关华豆胶、塔拉胶、刺槐豆胶、角豆胶、芦荟胶、魔芋胶等半乳甘露聚糖以及它们的混合物。
3.根据权利要求1和2，其特征在于半乳甘露聚糖的浓度为0.1 % 99%。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于醇溶液中的醇包括但不限于乙醇、正丙醇、正丁醇、正戊醇、正己醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇、环戊醇、环己醇、乙二醇、丙二醇等。
5.根据权利要求1和4，醇的浓度为30% 70%。
6.根据权利要求1所述的方法，荧光素酶溶液中含有还原剂，还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、乙醇胺、β-巯基乙醇等以及它们的混合物。
7.根据权利要求1和6，还原剂的浓度为0.1 100mM/L。
8.本发明还提供了一种固 定萤光素酶材料。
全文摘要
本发明涉及一种新的适用于三磷酸腺苷分析的固定荧光素酶的制备方法。本方法针对三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)生物荧光检测中萤光素酶存在的稳定性问题，通过溶液法将其附着固定于半乳甘露聚糖(Galactomann)上，成为固定萤光素酶。上述方法制备的固定萤光素酶稳定性优于液体萤光素酶。本发明还提供了一种固定萤光素酶材料。
文档编号C12N11/10GK103088012SQ20131004790
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者万冬云 申请人:万冬云