专利名称：具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法
技术领域：
本发明涉及一种具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法。
背景技术：
随着现代生活水平的提高，人们越来越关注紫外辐射的问题。越来越多的抗紫外辐射化妆品也随之诞生。目前市场上抗紫外辐射的产品其主要成分为多糖类、多酚类、黄酮类、胶原蛋白和植物蛋白(如藻蓝蛋白)等。抗紫外辐射的试验可采用动物模型，如文镜在《营养学报》2001，23 (1):44_47报道的给小白鼠连续灌胃金属硫蛋白(MT)30天后分别接受7 Gy、8 Gy 60Co-Y 一次性辐照或每周一次I Gy小剂量连续8次福照,通过采血测定白细胞和淋巴细胞等指标以判断金属硫蛋白是否具有抗紫外辐射的作用，发现口服MT具有一定的抗紫外辐射功能。这种直接通过动物实验的方法，准确性高，但测试过程繁琐。抗紫外辐射的另一种试验方法是采用活体细胞模型。例如，Takeshi Saito在 Japanese Journal of Ophthalmology, 54(5):486-493中报道的通过建立Lens Epithelial细胞模型来研究金属硫蛋白的抗紫外福射作用。与此类似的方法如黄敏钧在《广东茶业》，2010，4:30-33中报道的通过NIH/3T3细胞模型研究了普洱茶的抗紫外辐射作用。研究表明，用细胞模型进行抗紫外辐射试验具有简便、准确和快速等优点。迄今已发现许多藻类多糖具有抗紫外辐射的功能，但是对藻类蛋白的抗紫外辐射研究还较少涉及，特别是藻类类金属硫蛋白的抗紫外辐射功能还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法。为实现上述目的，本发明的技术解决方案是:
本发明是一种具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法，它包括以下步
骤:
(1)活体细胞经0.25%胰酶消化3-8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞；
(2)在24孔板中各加入0.3 mL细胞悬浮液，于37°C及5% CO2气氛的培养箱中培养24
h ；
(3)取出24孔板，此时细胞完全贴壁，弃上清液，加入以pH7.4的PBS为介质的小球藻类金属硫蛋白制品0.3 mL,在距离紫外灯管25 cm处福射0_9 J/cm2 ；
(4)弃上清液，加入37°C预热的新鲜DMEM培养基并放入培养箱中培养12h ；
(5)弃上清液，往各孔加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL,继续培养2 h后，加入0.5 mLDMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶标仪测定570 nm处的吸光度值；(6)以pH 7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻类金属硫蛋白制品进行对照试验,通过比较试验组和对照组的吸光度值说明小球藻类金属硫蛋白的抗紫外辐射能力。所述的小球藻类金属硫蛋白的试验浓度范围为1.25 10 mg/mL。所述的活体细胞为NIH/3T3细胞，它包括以下步骤:
(I )NIH/3T3细胞经0.25%胰酶消化3 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞；
(2)在24孔板中各加入0.3 mL细胞悬浮液，于37°C及5% CO2气氛的培养箱中培养24
h ；
(3)取出24孔板，此时细胞完全贴壁，弃上清液，加入以pH7.4的PBS为介质的小球藻类金属硫蛋白制品0.3 mL,在距离紫外灯管25 cm处福射6 J/cm2 ；
(4)弃上清液，加入37°C预热的新鲜DMEM培养基并放入培养箱中培养12h ；
(5)弃上清液，往各孔加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL,继续培养2 h后，加入0.5 mLDMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶标仪测定570 nm处的吸光度值；
(6)以pH7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻类金属硫蛋白制品进行对照试验。通过比较试验组和对照组的吸光度值说明小球藻类金属硫蛋白的抗紫外辐射能力。所述的活体细胞为HaCaT细胞，它包括以下步骤:
(I )HaCaT细胞经0.25%胰酶消化8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞；`
(2)在24孔板中各加入0.3 mL的细胞悬浮液，于37°C及5% CO2气氛的培养箱中培养24 h至细胞完全贴壁；
(3)取出24孔板，弃上清液，加入以pH7.4的PBS为介质的小球藻类金属硫蛋白制品
0.3 mL,在距离紫外灯管25 cm处福射3 J/cm2;
(4)弃上清液，加入37°C预热的新鲜DMEM培养基并放入培养箱中继续培养12h ；
(5)弃上清液，各加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL，继续培养2 h后，加入0.5 mL DMSO,充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶标仪测定570 nm处的吸光度值；
(6)以pH7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻类金属硫蛋白制品进行对照试验,通过比较试验组和对照组的吸光度值说明小球藻类金属硫蛋白的抗紫外辐射能力。步骤(3)中紫外灯辐射剂量是通过以下方法计算得出:
稿删量_ -)=歷舊O采用上述方案后，由于本发明采用普通海洋小球藻(C vulgaris)为原材料，通过锌诱导制备锌结合类金属硫蛋白，并通过NIH/3T3和HaCaT活体细胞模型进行抗紫外辐射试验。发现NIH/3T3和HaCaT细胞经紫外辐射后，细胞活性下降，细胞形态改变甚至出现裂解的现象。而分别在NIH/3T3和HaCaT细胞介质中加入小球藻类金属硫蛋白制品后再经紫外辐射，发现细胞形态变化小，细胞活性得到保持，说明小球藻类金属硫蛋白具有一定的抗紫外辐射功能。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
图1为不同剂量紫外辐射对NIH/3T3细胞活性的影响 图2为不同浓度小球藻类金属硫蛋白保护下NIH/3T3细胞经紫外辐射(6 J/cm2)的活性 图3为不同剂量紫外辐射对HaCaT细胞活性的影响 图4为不同浓度小球藻类金属硫蛋白保护下HaCaT细胞经紫外辐射(3 J/cm2)的活性图。
具体实施例方式一、提取方法
本发明是一种具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的提取方法，它包括以下步
骤:
1.收集藻细胞:在处于对数生长期的小球藻培养液中加入0.05 mmol/L氯化锌，通气连续培养72 h。取小球藻悬浮液，经5000 r/min离心，收集藻细胞。2.收集上清液:将收集的藻细胞分别用5 mmol/L EDTA-2Na和超纯水依次清洗2次，按藻泥重量与提取液(含1% 二硫苏糖醇的10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.8)体积比以1:10(w/v)的比例分散悬浮藻细胞，在冰浴下超声波细胞破碎，然后经12000 r/min离心10 min,收集上清液。3.制取金属硫蛋白: 将上清液注入葡聚糖凝胶(G-75)层析柱(Φ3.0X80 cm),以10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.8)为洗脱液，经430 min后收集富含锌的类金属硫蛋白组分60 min。收集过程可通入氮气保护，以防止样品被氧化。将收集的组分经真空冷冻干燥后，复溶于超纯水中，用葡聚糖凝胶(G-25)层析柱(Φ 1.5X30 cm)脱盐纯化，收集类金属蛋白质组分并经真空冷冻干燥后即得到小球藻类金属硫蛋白制品。二、实验方法
本发明是一种具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法的四个实施例，它包括以下步骤:
实施例1:
NIH/3T3细胞经0.25%胰酶消化3 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞。在24孔板中各加入0.3 mL细胞悬浮液，于37°C及5% CO2气氛的培养箱中培养24 h。取出24孔板，此时细胞完全贴壁，弃上清液，于各孔中加入0.3 mL PBS (pH 7.4)，分别在距离紫外灯管25 cm处辐射0、3、6、7.5、9 J/cm2。然后，弃上清液，加入37°C预热的新鲜DMEM培养基并放入培养箱中培养12 h，观测细胞形态。弃上清液，各孔加入2 mg/mL的MTT溶液0.1 mL，继续培养2 h后，加入0.5 mL DMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶标仪测定570 nm处的吸光度值，结果如图1所示。实施例2
NIH/3T3细胞经0.25%胰酶消化3 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞。在24孔板中各加入0.3 mL的细胞悬浮液，于37°C及5% CO2气氛的培养箱中培养24 h。取出24孔板，此时细胞完全贴壁，弃上清液，于各孔中加入0.3 mL小球藻类金属硫蛋白制品(溶于pH 7.4的PBS中)。在距离紫外灯管25 cm处辐射，剂量为6 J/cm2。然后按实施例1中的方法测定各吸光度值，并观测细胞形态，结果如图2所示。实施例3
HaCaT细胞经0.25%胰酶消化8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞。在24孔板中各加入0.3 mL的细胞悬浮液，于37°C及5% CO2气氛的培养箱中培养24 h至细胞完全贴壁。取出24孔板，弃上清液，加入0.3 mL PBS (pH 7.4)，分别在距离灯管25 cm处辐射0、3、6、7.5、9 J/cm2后，弃上清液，加入37°C预热的新鲜DMEM培养基并放入培养箱中继续培养12 h。然后，弃上清液，各加入2 mg/mL的MTT溶液0.1 mL，继续培养2 h后，加入0.5 mL DMS0，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶标仪测定吸光度值，结果如图3所示。 实施例4
HaCaT细胞经0.25%胰酶消化8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞。在24孔板中各加入0.3 mL的细胞液，于37°C及5% CO2气氛的培养箱中培养24 h至细胞完全贴壁。取出24孔板,弃上清液,加入0.3 mL小球藻类金属硫蛋白(溶于pH
7.4的PBS中)，在距离紫外灯管25 cm处辐射，剂量为3 J/cm2。然后按实施例1中的方法测定各吸光度值，结果如图4所示。需要说明的是:
(I)所述的小球藻类金属硫蛋白的试验浓度范围为1.25 10 mg/mL。随着小球藻类金属硫蛋白的浓度增大，NIH/3T3细胞和HaCaT细胞的活性增强，说明小球藻类金属硫蛋白对这两种细胞的保护作用增强，即抗紫外辐射能力增强。(2)上述各实施例中紫外灯辐射剂量是通过以下方法计算得出:
权利要求
1.一种具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法，其特征在于:它包括以下步骤: (1)活体细胞经0.25%胰酶消化3-8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞； (2)在24孔板中各加入0.3 mL细胞悬浮液，于37°C及5% CO2气氛的培养箱中培养24h ； (3)取出24孔板，此时细胞完全贴壁，弃上清液，加入以pH7.4的PBS为介质的小球藻类金属硫蛋白制品0.3 mL,在距离紫外灯管25 cm处福射0_9 J/cm2 ； (4)弃上清液，加入37°C预热的新鲜DMEM培养基并放入培养箱中培养12h ； (5)弃上清液，往各孔加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL,继续培养2 h后，加入0.5 mLDMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶标仪测定570 nm处的吸光度值； (6)以pH7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻类金属硫蛋白制品进行对照试验,通过比较试验组和对照组的吸光度值说明小球藻类金属硫蛋白的抗紫外辐射能力。
2.根据权利要求1所述的具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法，其特征在于:所述的小球藻类金属硫蛋白的试验浓度范围为1.25" 0 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法，其特征在于:所述的活体细胞为NIH/3T3细胞，它包括以下步骤: (I )NIH/3T3细胞经0.25%胰酶消化3 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞； (2)在24孔板中各加入0.3 mL细胞悬浮液，于37°C及5% CO2气氛的培养箱中培养24h ； (3)取出24孔板，此时细胞完全贴壁，弃上清液，加入以pH7.4的PBS为介质的小球藻类金属硫蛋白制品0.3 mL,在距离紫外灯管25 cm处福射6 J/cm2 ； (4)弃上清液，加入37°C预热的新鲜DMEM培养基并放入培养箱中培养12h ； (5)弃上清液，往各孔加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL,继续培养2 h后，加入0.5 mLDMSO溶液，充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶标仪测定570 nm处的吸光度值； (5)以pH 7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻类金属硫蛋白制品进行对照试验；通过比较试验组和对照组的吸光度值说明小球藻类金属硫蛋白的抗紫外辐射能力。
4.根据权利要求1所述的具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法，其特征在于:所述的活体细胞为HaCaT细胞，它包括以下步骤: (I )HaCaT细胞经0.25%胰酶消化8 min后，加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养液悬浮细胞； (2)在24孔板中各加入0.3 mL的细胞悬浮液，于37°C及5% CO2气氛的培养箱中培养，24 h至细胞完全贴壁； (3)取出24孔板，弃上清液，加入以pH7.4的PBS为介质的小球藻类金属硫蛋白制品，0.3 mL,在距离紫外灯管25 cm处福射3 J/cm2; (4)弃上清液，加入37°C预热的新鲜DMEM培养基并放入培养箱中继续培养12h ；(5)弃上清液，各加入2mg/mL的MTT溶液0.1 mL，继续培养2 h后，加入0.5 mL DMSO,充分溶解后各取0.2 mL溶液放入96孔板中，用酶标仪测定570 nm处的吸光度值； (6)以pH7.4的PBS溶液0.3 mL替代小球藻类金属硫蛋白制品进行对照试验,通过比较试验组和对照组的吸光度值说明小球藻类金属硫蛋白的抗紫外辐射能力。
5.根据权利要求1所述的具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法，其特征在于:步骤(3)中紫外灯辐射剂量是通过以下方法计算得出:
全文摘要
本发明公开了一种具有抗紫外辐射功能的小球藻类金属硫蛋白的实验方法，它包括小球藻类金属硫蛋白的制备和活体细胞试验等步骤。由于本发明采用普通海洋小球藻(C.vulgaris)为原材料，通过锌诱导制备锌结合类金属硫蛋白。通过NIH/3T3和HaCaT活体细胞模型进行抗紫外辐射试验。发现NIH/3T3和HaCaT细胞经紫外辐射后，细胞活性下降，细胞形态改变甚至出现裂解的现象。而分别在NIH/3T3和HaCaT细胞介质中加入小球藻类金属硫蛋白制品后再经紫外辐射，发现细胞形态变化小，细胞活性得到保持，说明小球藻类金属硫蛋白具有抗紫外辐射功能。
文档编号C12Q1/02GK103114123SQ20131004769
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者黄志勇, 杨洪 申请人:集美大学