专利名称：一种用于定量检测ikzf1基因突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于定量检测IKZFl基因突变的试剂盒。
背景技术：
Ph阳性白血病包括慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)和某些急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL),其始作俑者是Ph染色体导致的BCR-ABLl融合基因。然而，以BCR-ABLl为靶点的治疗对某些Ph阳性白血病却并不见效。最新研究发现，在这类白血病的发生及进展过程中，包括IKZFl基因缺失在内的其他遗传学因素的作用也不可忽视。IKZFl基因编码一种具有锌指结构的转录因子蛋白，在淋巴细胞的分化和发育过程中起着重要的调控作用。IKZFl基因的下游产物Ikaros是淋巴细胞特异性转录因子。IKZFl基因缺失可导致Ikaros表达的不足、显性失活或完全丧失。IKZFl突变主要见于ALL，约20%的儿童B-ALL、15 30%的成人B-ALL和5%的T-ALL患者有IKZFl突变。BCR-ABLl阳性B-ALL患者常伴有IKZFl基因突变，MLL相关融合基因阳性的ALL患者也可伴有IKZFl突变，约20%染色体核型正常的ALL患者中可检测到IKZFl基因突变。IKZFl突变发生于基因组水平，是ALL发病的一个重要促进因素，也是ALL患者独立的预后不良因素。IKZFl突变很少发生于髓性白血病，但约86%的CML患者急淋变时可检测到发生IKZFl突变，是CML患者急变的重要促进因素。目前，检测IKZFl突变的方法主要为测序的方法，不能定量分析IKZFl突变的水平。
发明内容
本发明的一个目的 是提供一种用于定量检测IKZFl基因突变的试剂盒。本发明所提供的用于定量检测IKZFl基因突变的试剂盒，由引物对和探针组成，引物对的一条引物序列如SEQ ID No:l所不，另一条引物序列如SEQ ID No:2所不,探针的序列如SEQ ID No:3所示。SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示引物对和SEQ ID No:3所示探针在制备定量检测IKZFl基因突变的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。上述技术方案中，所述IKZFl基因突变可为单纯的缺失突变，还可为缺失突变和插入突变并存，还可为缺失突变和替换突变并存；以野生型IKZFl 基因的全基因组序列(NCBI Reference Sequence:NT_079592.2)为参照物来描述该突变应当满足的条件，该突变必须满足如下条件:I)缺失突变、插入突变或替换突变均发生在参照物的自5 '末端起第25185——76017位核苷酸之间；(参照物的自5 '末端起第25185——76017位核苷酸实际上位于参照物的第2内含子-第6内含子这段区域内)2)在参照物的自5 '末端起第25185——76017位核苷酸之间，发生所述突变后，所剩余的DNA片段大小能够被SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所述引物对扩增得到PCR扩增曲线。本发明提供的引物对和探针，可以用于定量检测IKZFl基因突变水平，且简便、灵敏，从而用于血液肿瘤患者(特别是ALL白血病患者、CML急淋变患者)的辅助诊断、MRD监测、预后的评估等等，将在医学检测领域发挥重要作用。
图1为IKZFl基因突变测序结果。图2为标准曲线。图3为对病人样本的灵敏度检测结果图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、检测IKZFl基因突变一、检测样本成人初诊为ALL306例，非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’s lymphoma, NHL) 10例，慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphoblastic leukemia, CLL) 21例,诊断标准依据世界卫生组织新的分型标准。提取DNA的样本为上述患者的外周血或骨髓，均经过患者的知情同意。
二、测序方法检测IKZFl基因突变以提取的DNA为模板，以上游引物:5-ccacagggcaagtcatccacattttg_3’，下游引物:5-cagaccatagagtccctcctaggggaaaaa_3’进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为 50 μ I:2XPCR扩增预混试剂(天根生物有限公司)25μ 1，上、下游引物各400nM，300ng DNA0 PCR反应条件为:先95°C 5分钟；然后95°C 40秒，58°C 40秒，72°C I分钟，共30个循环，最后72°C 10分钟。扩增产物纯化后，使用测序引物5-ttcttagaagtctggagtctgtgaaggtca_3’由北京天一辉远生物技术有限公司在ABI3700DNA分析仪上完成测序工作。其中发现的部分突变被克隆进入pMDlS-T质粒载体，经过细菌转化、筛选、进一步测序验证。结果，306例ALL中，有58例的IKZFl基因存在突变，其余均不存在IKZFl基因突变。其中一例的测序结果如图1。以野生型IKZFl 基因(NCBI Reference Sequence:ΝΤ_079592.2)的全基因组序列为参照物描述58个突变。58个突变中，有的仅为缺失突变(即仅丢失大片段)，有的为缺失突变和插入突变并存(即在缺失大片段的同时有少数几个碱基的插入)；但是无论哪种突变，突变均发生在参照物的自5 '末端起第25185——76017位核苷酸之间；无论哪种突变，与参照物相比丢失的碱基数目在50730bp-50786bp之间(表I)。表1、丢失的碱基总数(bp)
权利要求
1.一种用于定量检测IKZFl基因突变的试剂盒，由引物对和探针组成，引物对的一条引物序列如SEQ ID No:1所不，另一条引物序列如SEQ ID No:2所不，探针的序列如SEQ IDNo:3所示。
2.SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示引物对和SEQ ID No:3所示探针在制备定量检测IKZFl基因突变的 试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于定量检测IKZF1基因突变的试剂盒。本发明所提供的用于定量检测IKZF1基因突变的试剂盒，由引物对和探针组成，引物对的一条引物序列如SEQ ID No1所示，另一条引物序列如SEQ ID No2所示，探针的序列如SEQ ID No3所示。本发明提供的引物对和探针，可以用于定量检测IKZF1基因突变水平，且简便、灵敏，从而用于血液肿瘤患者(特别是ALL白血病患者、CML急淋变患者)的辅助诊断、MRD监测、预后的评估等等，将在医学检测领域发挥重要作用。
文档编号C12Q1/68GK103103284SQ201310047359
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者阮国瑞, 黄晓军, 江滨, 刘开彦, 陈珊珊, 江浩, 刘艳荣, 赖悦云, 李玲娣, 冷馨, 黎宁 申请人:北京大学人民医院