专利名称：水稻抗瘟基因Pi50基因特异性分子标记Pi50N4s及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及稻瘟病技术领域，尤其是，
水稻抗瘟基因Pi50基因特异性分子标记Pi50N4s及其制备方法和应用。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻痕病菌(Magnapothe oryzae)引起的稻痕病是对水稻生产危害最严重的病害之一,每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。此外，单一抗性品种的持久性(通常是2-4年)会随着病原菌的迅速变异而失去功效(郑钊等2009)，因此，合理的挖掘和利用广谱抗性基因或者聚合多个抗病基因，是获得持久、广谱抗病品种的重要途径。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，不仅依赖于育种者具备的丰富经验和敏锐的观察力，鉴定结果也极易受到环境及人为因素的影响而造成误差，抗性基因的选育效率低下。随着分子标记技术的产生及发展，其便捷、直接、不受环境影响等优点使其应用价值及前景越来越受到关注。通过开发与目标基因紧密连锁的分子标记，特别是在基因内部开发其功能特异性的标记物进行分子标记辅助选择，不仅大大加快了育种步伐，也提高了选择的可靠性。
到目前为止，人们已经鉴定出80多个水稻抗瘟基因(Ballini et al.，2008;鄂志国等2009;Zhai et al.，2010)，其中至少22个水稻稻瘟病抗性基因已被克隆(Wanget al., 1999; Qu et al.2006; Hayashi et al.2010 ；Jiang et al.，2012;Hua et al.，2012 ；Das et al.，201 2)。这些稻瘟病抗病基因多数具有富亮氨酸重复-核苷酸结合位点(NBS-LRR)蛋白结构，NBS中心区域的功能与ATP结合/水解相关，C-端LRR区域参与了蛋白的相互作用(Dangl&Jones, 2001;Takken&Tameling, 2009;Bernoux, 2011)。NBS-LRR 基因有成簇排列的倾向，通常簇内基因的同源性很高，与相同抗性途径的基因也维持着共遗传的规律(Michelmore&Meyers, 1998;Leister, 2004)。水稻第6染色体长臂的Pi2/9基因簇是科学家的研究热点，如
图1所示(Yang et al.，2009)，从该位点区域已报道并深入研究的抗瘟基因有:Pi2、Pi9、Pigm(t)、P1-z及Piz-t，他们分布在2 9个NBS-LRR成员组成的基因簇内。人们已证明了 Pi2、Pi9和P1-z中单个NBS-LRR基因已具有广谱抗瘟作用(Zhou, 2006, 2007 ;Dai，2010)，其中，Pi2和Piz_t的LRR区域仅8个氨基酸残基的差异就产生了不同的产物及抗性(Qu et al., 2006; Zhou et al.，2006)。但该基因簇中，还有更多的NBS-LRR成员等待人们进一步的挖掘和利用。发明内容
申请人通过图位克隆方法(Map-based cloning),从华南稻区的一个优异抗源品种28占(EBZ)中分离、鉴定到了一个具有广谱、持久抗性的稻瘟病抗性基因Pi50。申请人通过长片段 PCR 扩增(Long Rangement PCR Amplification)以及染色体步移(ChromosomeWorking)的方法,获得了包含Pi50位点区域的95kb基因组序列。通过FGenesh预测,该区域包括了 7个编码NBS-LRR类蛋白的基因:Pi50-Nbsl 7 (申请人未发表数据)。Pi50同样位于Pi2/9基因簇，Pi2/9/50区域NBS-LRR基因簇位点的整合图谱如图2所示(Zhu etal.，2012)。
值得注意的是，同样位于Pi2/9基因簇的Pi50，其对应的专化性小种的抗谱却与Pi2、Pi9和Piz-t的抗谱明显不同，如表I所示。针对各等位基因的结构域测序分析表明，Pi50与Pi2, Pi9和Piz-t的LRR功能域存在明显差异。其中Pi50_Nbs2，4，6这3个NBS-LRR类蛋白基因与已报道的Pi2/9基因簇的复等位基因存在较大的核酸序列差异。此外，Pi50供体品种EBZ与参考序列品种日本晴之间具有相似的基因组结构，但与Pi2，Pi9的供体品种存在较大的序列差异。多年实践证明，Pi50具有广谱、持久的稻瘟病抗性，且遗传力较高，使之更适合广泛应用于稻瘟病抗性育种计划中。因而，为了加快Pi50在抗性育种工作中的应用，开发出Pi50基因特异性分子标记，对于准确有效的分子标记辅助育种(MAS)、基因的聚合育种，显得尤其重要。
表lPi2/9/z_t/50基因抗谱比较
权利要求
1.一种稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异(Single NucleotidePolymorphism, SNP)分子标记Pi50N4s,其特征在于,为以水稻品种抗源品种28占(EBZ)总DNA为模板，通过下列碱基序列的引物对SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2进行PCR扩增得到的核苷酸片段:SEQ ID N0.1 (5’ -3’):CTTTGAATGTAATTAGATCTGCCSEQ ID N0.2 (5’ -3’):CTACCCCACAATTACAATCAG 所得PCR产物经限制性内切酶Xba I酶切后，与Pi50呈特异性带型分子标记。
2.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)分子标记Pi50N4s,其特征在于，所述稻痕病抗性基因Pi50包括7个编码NBS-LRR类蛋白的基因，其中，基因特异性分子标记Pi50N4s位于第4个NBS-LRR类蛋白基因中。
3.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)分子标记Pi50N4s,所述稻痕病抗性基因Pi50为通过图位克隆方法(Map-based cloning)从水稻品种抗源品种28占(EBZ)中分离鉴定得到。
4.如权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)分子标记Pi50N4s的制备方法,其特征在于,包括如下步骤: 步骤I)利用多序列比对软件工具，对比日本晴、Pi2/Pi9BAC以及Pi50区域95kb序列，比较Pi50对应区域的NBS-LRR类基因的核苷酸序列，筛查Pi50中特异的、能区别于其感病等位基因以及该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基(SNP)差异位点，得知该SNP位于候选基因Pi50-Nbs4中； 步骤 2)根据 dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences;Neff etal., 2002.Trends in Gene ticsl8:613-615)标记的开发原理，利用步骤I)获得的SNP信息，在SNP上游100-200bp处设计基因特异性上游引物，在该SNP处设计带有错配碱基的基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下:SEQ ID N0.1 (5’ -3’):CTTTGAATGTAATTAGATCTGCCSEQ ID N0.2 (5’ -3’):CTACCCCACAATTACAATCAG 利用上述引物对，以水稻品种抗源品种28占(EBZ)总DNA为模板，进行PCR扩增，得到可进行电泳检测的DNA片段，即为所述稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)分子标记 Pi50N4s。
5.如权利要求4所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)分子标记Pi50N4s的制备方法，其特征在于，还包括步骤3)，利用步骤2)所述的引物对，对多个不同水稻品种的总DNA进行PCR扩增反应，获得Pi2/9基因簇多个抗源品种对应于Pi50特异SNP位点的片段，与步骤2获得的DNA片段进行比较验证，从而确定Pi50基因特异性的分子标记Pi50N4s。
6.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)分子标记Pi50N4s在鉴别Pi2/9基因簇区域不同稻痕病抗性基因的应用。
7.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异(SingleNucleotide Polymorphism, SNP)分子标记Pi50N4s在鉴别普栽水稻品种中稻痕病抗性基因的应 用。
全文摘要
本发明提供了一种稻瘟病抗性基因Pi50基因特异性单碱基差异(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)分子标记Pi50N4s,为以水稻品种抗源品种28占(EBZ)总DNA为模板，通过特定的引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2进行PCR扩增得到的核苷酸片段，所得PCR产物经限制性内切酶XbaI酶切后，与Pi50呈特异性带型分子标记。利用该分子标记Pi50N4s可以提高稻瘟病抗性基因Pi50在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。
文档编号C12N15/11GK103184220SQ20131004719
公开日2013年7月3日 申请日期2013年2月5日 优先权日2013年2月5日
发明者苏菁, 华丽霞, 韩靖鸾, 朱小源, 陈深, 曾列先, 汪文娟, 汪聪颖 申请人:广东省农业科学院植物保护研究所