专利名称：一种培育抗江苏省穗颈瘟水稻品种的育种方法
技术领域：
本发明涉及一种培育抗江苏省穗颈瘟水稻品种的育种方法，属水稻遗传改良与生物技术应用领域。背景技术：
稻痕病是由稻痕病菌(Magnaporthe oryzae ;无性态Pyriculariaoryzae)引起的水稻上最具毁灭性的病害之一，俗称水稻的“癌症”。水稻整个生育期过程中都会受到稻瘟病病菌的侵染，依据感染的部位不同可以分为苗瘟，叶瘟，叶枕瘟、节瘟，穗颈瘟、谷粒瘟等。 其中穗颈瘟的危害大于叶瘟和其它的危害，严重时可以导致颗粒无收。稻瘟病在全球85个有水稻种植的国家和地区均有发生。据统计，在1975 1990年的16年间，由稻瘟病引起的全球水稻产量损失高达I. 57亿吨。我国每隔7-10年就发生一次较大规模的稻瘟病危害，受害面积达300-600万hm2，稻谷损失70-125万吨。水稻是江苏省第一大粮食作物，单产水平居全国之首，其中粳稻面积占水稻面积的80%以上。稻瘟病也是江苏省的主要水稻病害，在20世纪90年代初，发病面积达166. 67万hm2，减产35万吨，苗、叶、穗颈瘟都有发生，但穗颈瘟的潜在威胁最大。因此江苏省在粳稻新品种审定过程中对穗颈瘟达到4 级的采取直接淘汰制度。稻瘟病的防治主要通过化学防治和种植抗性品种来控制病害，实践证明，选育和推广抗稻瘟病品种是解决这一问题的最有效、安全和环保的方法。发掘抗源和鉴定抗性基因是培育抗病品种的基础和前提。目前从不同抗病品种中鉴定出大约80个稻瘟病抗性基 m，Pi-b、Pi_ta、Pi-d2、Pi9、Pi-21等至少20个抗稻瘟病基因已经被克隆。但除了 Pbl外这些稻瘟病抗性基因的研究都集中在苗瘟、叶瘟的抗性上，不能明确其对穗颈瘟的抗性。选择穗颈瘟的抗病基因是穗颈瘟抗性育种的前提。我们利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi_b的功能标记对江苏省历年来大面积推广的粳稻品种进行基因型检测，结合穗颈瘟抗性结果，通过关联分析初步明确了 Pi-to、/74联合效应对江苏省粳稻稻瘟病尤其是穗颈瘟具有较好的抗性。在稻瘟病抗性育种中抗性的鉴定是基础，鉴定方法主要有人工接种鉴定和病区自然诱发鉴定。传统水稻抗稻瘟病种质资源的鉴定主要是大田喷雾测定，该方法所需时间较长，需要消耗大量的材料，并且受环境因素影响较大。与田间鉴定方法相比，接种鉴定可在植株生长早期进行，不受外界气候因素影响，占用空间小。但在品种的抗性鉴定中还存在许多问题，如鉴定方法、评价标准不统一，鉴定方法不标准、不规范，鉴定效率低，鉴定中条件难以控制等，从而使得出的鉴定结果不准确，难以用统一
标准来判断衡量，进而影响了抗病育种工作。利用基因功能标记辅助选择技术是根据抗病基因本身序列的差异设计引物进行的基因型选择，利用该方法开展穗颈瘟抗性育种工作不仅选择精确，且不受时间和环境限制。因此，在江苏省粳稻穗颈瘟抗性育种过程中发明一种高效转育和鉴定穗颈瘟抗性基因的育种方法，聚合高产、多抗病基因于一体，是本发明的宗旨。三、发明内容技术问题本发明涉及一种培育抗江苏省穗颈瘟水稻品种的育种方法，采用高效转育和抗性基因聚合选择的育种方法，将高产、抗病基因聚合于一体，减少育种成本、缩短育种周期是本发明的宗旨。技术方案
一种培育抗江苏省粳稻穗颈瘟水稻新品种的育种方法，其特征在于
1)选用中感穗颈瘟的江苏高产水稻品种淮稻10(.Pi-taPi-tapi-bpi-b)为母本、感穗颈痕的南粳38 ipi-tapi-taPi-bPi-b)为父本配制杂交配组；
2)种植FpF2、F3,成熟后全部单株混收；
3)F4代开始进行稻瘟病抗病基因Pi-te、Pi-b的分子标记辅助选择，苗期各单株DNA 的提取采用SDS法
(1)利用2对等位基因特异PCR引物分子检测稻瘟病抗性基因的存在
用Pita引物对
Pita-F AGCAGGTTATAAGCTAGGCC ；Pita-R CTACCAACAAGTTCATCAAA 扩增水稻单株的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，如果具有1042 bp特征条带说明该单株含有基因；
用Npita引物对
Npita-F AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT ；Npita-R CTACCAACAAGTTCATCAAA 扩增水稻单株的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，如果具有1042 bp特征条带说明该单株不含有朽-h基因；
在F4代中选择用Pita引物对扩增出1042bp的特征条带，同时Npita引物对不能扩增出1042bp目的条带的单株即为基因纯合的单株；
(2)利用2对等位基因特异PCR引物稻分子检测瘟病抗性基因的的存在
用Pib引物对
Pib-F GAACAATGCCCAAACTTGAGA ；Pib-R GGGTCCACATGTCAGTGAGC 扩增水稻单株的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，如果具有365 bp特征条带说明该单株含有基因；
用Npib引物对
Npib-F TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT ； Npib-R GGGAAGCGGATCCTAGGTCT 扩增水稻单株的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，如果具有803 bp特征条带说明该单株不含有基因；
在F4代中选择用Pib引物对扩增出365bp的特征条带、同时用Npib引物对不能扩增出803bp目的条带的单株即为基因纯合的单株；
4)在F4代中选择同时含有基因纯合和基因纯合的单株，即为获得的抗江苏省粳稻穗颈瘟的水稻品种。或者将F4代中同时含有朽-te基因纯合和基因的纯合的单株分别种成F5小区，F5小区在水稻孕穗初期，进行穗颈瘟接种鉴定，于水稻成熟后按调查标准调查结果，穗颈瘟鉴定标准如下，0级无病，免疫；I级1 /4以下枝梗发病或穗颈有斑点，抗病；2级 I /4以上枝梗发病或主轴中部发病，或颈部有病，但对产量影响不大，中抗；3级主轴中部或颈部发病，对产量有显著影响，感病；4级穗颈发病造成白穗，高感；选择对穗颈瘟表现为穗颈瘟抗性为0-1级)的F5小区即为即为获得的抗江苏省粳稻穗颈瘟的水稻品种。5)将F4代中同时含有朽-te基因纯合和基因的纯合的单株分别种成F5小区，F5小区内选择株高9(Tl00cm、每株8 10穗、每穗140 150粒的单株加代稳定，于F6代获得农艺性状稳定一致、抗穗颈瘟的水稻品系。其中水稻品系南京14128，该品系株高98 102cm，每株8 10穗，平均穗长17 18cm， 直立穗型，每穗总粒数140 150粒，结实率94% 98%，千粒重26 27g。有益效果
本发明提供的一种培育抗江苏省粳稻穗颈瘟水稻新品种的育种方法，具有以下优点 本发明方法中涉及辅助选择的基因标记均为PCR标记，操作简单，成本低，不仅可以在育种世代中快速准确地鉴定出含有Pi-b纯合体的水稻植株，同时由于是对基因本身的选择，因此可以减去田间鉴定的过程，简化育种程序，降低了育种成本，极大的提高了选择效率，缩短育种年限。四
图I淮稻10/南粳38F4群体不同单株种抗病基因的分子检测 (M DL2000 ；1 :淮稻10 ；2 :南粳38 ;3_24 =F4群体的部分单株)
图2淮稻10/南粳38F4群体不同单株种抗病基因7^/4的分子检测 (M DL2000 ；1 :淮稻10 ；2 :南粳38 ;3_24 =F4群体的部分单株)
图3抗穗颈瘟高产新品种“南京14128”选育系谱图五具体实施例方式
选择亲本淮稻10号(原名淮9836)，江苏省高产粳稻品种，江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所育成，2007年江苏省审定并定名。Pi-ta位点上基因型为Pi-taPi-ta, Pi~b位点上基因型为Pi-如i-匕该品种全生育期155天，株高96 100厘米，每株有效穗If 12个，每穗实粒数KKTllO粒，结实率90 92%，千粒重25 26克。南粳38 (原名南京72031)，江苏省高产粳稻品种，江苏省农业科学院粮食作物研究所育成，2001年江苏省审定并定名oPi-b位点上基因型为位点上基因型为pi-tapi-ta,该品种叶色清秀，后期转色好，熟相好。株高90、5，每株有效穗If 12个， 每穗实粒数120 125粒，结实率90 95%，千粒重26 27克。以上两个品种均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为(袁生堂等，淮稻10号(淮9836)的选育及应用，中国稻米，2007，5，34-35 ;仲维功等，中粳稻新品种南粳38的选育与应用，江苏农业科学，2001，5，35-37)。品种选育2005年选用Pi-ta位点上基因型为中感穗颈瘟的江苏高产粳稻品种淮稻10号为母本早与位点上基因型为的高产优质感穗颈瘟粳稻品种南粳38，为父本色杂交配组，2006年在南京种植F1, 2007年种植混收F2代种子，2008 年种植F3,成熟后混收种子。2009年在南京种植F4,根据分子标记辅助育种的结果选择目的单株，种植F5小区，根据分子标记辅助育种的结果以及农艺性状的表现在个别小区内继续选择单株。中选单株2010年种成小区(F6),筛选出表现稳定一致、高抗穗颈瘟、综合丰产性好的粳稻新品系南京14128。分子标记辅助选择 F4代开始进行稻瘟病抗性基因的分子标记辅助选择，苗期各单株DNA的提取采用SDS法(参照Dellaporta S L, et al. , Plant MolBiol Rep, 1983，I (I): 19-21)，略有改动。具体步骤为取水稻苗期叶片，在_20°C预冷的研钵中用液氮研磨并装入I. 5 ml离心管；加入600 ul提取液(20% SDS, IM Tris-HCl,
0.5M EDTA, 5M NaCl，65°C预热)，摇勻，65°C温浴30 min，中间振荡:次；加入1/4体积5M KAC,摇匀后置冰上30 min ;加入氯仿-异戊醇(24:1) 300 400 ul，在摇床上充分振荡， 120 rpm, 30 min ；8000^10000 rpm离心15分钟,液面分层，下层颜色较深,上层微带黄绿色，取上清(400 ul左右)至另一离心管；加入等体积氯仿-异戊醇(24:1)，摇床上充分振荡,80 90 rpm, 30 min ；8000 rpm离心15分钟,转移上清(400 ul左右)至新的离心管；力口 A 2倍体积_20°C预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12000 rpm离心6 min ;弃无水乙醇，加入4°C 70%乙醇，放置10 min，弃上清，超净工作台上风干I h ;加入100 200 ulTE，-20°C保存。稻瘟病抗性基因的分子检测，利用2对等位基因特异PCR引物
Pita-F AGCAGGTTATAAGCTAGGCC
Pita-R CTACCAACAAGTTCATCAAA Npita-F AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT Npita-R ； CTACCAACAAGTTCATCAAA
扩增水稻品种的基因组DNA，20 ii L的反应体系包括模板DNA (约15ng/y L) 2 y L， 引物(4pmol/ii L) L，IOX 缓冲液(25 mmol/ L) 2 u L, MgC12 (25 mmol/ L) I. 2 u L, dNTP (2.5 mmol/ L) 0. 4u L, Taq 酶(5 U/u L )0. 2u L，灭菌双蒸水 12. 2 y L。在 Eppendorf PCR仪上进行扩增，反应条件为(I )94°C预变性5分钟；(2)94°C，I分钟；58°C, I分钟；72°C，I. 5分钟；共35个循环.(3) 72°C再延伸10分钟。反应产物在在I %的琼脂糖上进行分离电泳，溴化乙锭染色，然后在紫外凝胶成像仪上观察并照相，选择Pita扩增出1042bp的特征条带，同时Npita不能扩增出1042bp目的条带的基因纯合的单株。稻瘟病抗性基因的Pi-b分子检测，利用2对等位基因特异PCR引物
Pib-F GAACAATGCCCAAACTTGAGA
Pib-R GGGTCCACATGTCAGTGAGC Npib-F TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT Npib-R ；GGGAAGCGGATCCTAGGTCT
扩增水稻品种的基因组DNA，20 ii L的反应体系包括模板DNA (约15ng/y L) 2 y L， 引物(4pmol/ii L) L，IOX 缓冲液(25 mmol/ L) 2 u L, MgC12 (25 mmol/ L) I. 2 u L, dNTP (2.5 mmol/ L) 0. 4u L, Taq 酶(5 U/u L )0. 2u L，灭菌双蒸水 12. 2 y L。在 Eppendorf PCR仪上进行扩增，反应条件为(I )94°C预变性5分钟；(2)94°C，I分钟；58°C, I分钟；72°C，I. 5分钟；共35个循环.(3) 72°C再延伸10分钟。反应产物在在I %的琼脂糖上进行分离电泳，溴化乙锭染色，然后在紫外凝胶成像仪上观察并照相，选择Pib扩增出365bp的特征条带，同时Npib不能扩增出803bp目的条带的基因纯合的单株。将F4代中同时含有朽-te基因纯合和基因纯合的单株分别种成F5小区，在水稻孕穗初期，参照罗楚平等(罗楚平等，水稻稻瘟病接种技术及2009年江苏省区试品种抗性鉴定，江苏省农业科学，2009，6: 178-179)进行穗颈瘟接种鉴定。于水稻成熟后按调查标准调查结果。穗颈瘟鉴定标准如下，0级无病，免疫；I级1/4以下枝梗发病或穗颈有斑点，抗病；2级1 /4以上枝梗发病或主轴中部发病，或颈部有病，但对产量影响不大，中抗；3级主轴中部或颈部发病，对产量有显著影响，感病；4级穗颈发病造成白穗，高感。选择对穗颈瘟表现为抗病(穗颈瘟抗性为0-1级)，同时含有朽-te ,Pi-b基因纯合体的F5小区。在上述F5小区内选择株高9(Tl00cm、每株8 10穗、每穗140 150粒的单株加代稳定，于F6R获得一批农艺性状稳定一致、抗穗颈瘟的水稻品系。其中水稻品系南京14128， 该品系株高98 102cm，每株8 10穗，平均穗长17 18cm，直立穗型，每穗总粒数140 150粒， 结实率94% 98%，千粒重26 27g。
权利要求
1.一种培育抗江苏省粳稻穗颈瘟水稻新品种的育种方法，其特征在于1)选用中感穗颈瘟、基因型为/如 的江苏高产水稻品种淮稻10作母本，与感穗颈瘟、基因型为的南粳38作父本配制杂交配组；2)种植FpF2、F3,成熟后全部单株混收；3)F4代开始进行稻瘟病抗病基因Pi-b的分子标记辅助选择，苗期各单株DNA 的提取采用SDS法(1)利用2对等位基因特异PCR引物分子检测稻瘟病抗性基因Pi-ia的存在用Pita引物对Pita-F AGCAGGTTATAAGCTAGGCC ；Pita-R CTACCAACAAGTTCATCAAA 扩增水稻单株的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，如果具有1042 bp特征条带说明该单株含有A'-ia基因；用Npita引物对Npita-F AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT ；Npita-R CTACCAACAAGTTCATCAAA 扩增水稻单株的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，如果具有1042 bp特征条带说明该单株不含有/基因；在F4代中选择用Pita引物对扩增出1042bp的特征条带，同时Npita引物对不能扩增出1042bp目的条带的单株即为Pi-ia基因纯合的单株；(2)利用2对等位基因特异PCR引物稻分子检测瘟病抗性基因的的存在用Pib引物对Pib-F GAACAATGCCCAAACTTGAGA ；Pib-R GGGTCCACATGTCAGTGAGC 扩增水稻单株的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，如果具有365 bp特征条带说明该单株含有基因；用Npib引物对Npib-F TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT Npib-R GGGAAGCGGATCCTAGGTCT扩增水稻单株的基因组DNA并经溴化乙锭染色后观察，如果具有803 bp特征条带说明该单株不含有基因；在F4代中选择用Pib引物对扩增出365bp的特征条带、同时用Npib引物对不能扩增出803bp目的条带的单株即为Pi-ia基因纯合的单株；4)在F4代中选择同时含有基因纯合和基因纯合的单株，即为获得的抗江苏省粳稻穗颈瘟的水稻品种。
2.根据权利要求I所述的育种方法，其特征在于在F4代中选择同时含有基因纯合和基因纯合的单株分别种成F5小区，F5 小区中在水稻孕穗初期，进行穗颈瘟接种鉴定，于水稻成熟后按调查标准调查结果，穗颈瘟鉴定标准如下，O级无病，免疫；I级1 /4以下枝梗发病或穗颈有斑点，抗病；2级1 /4 以上枝梗发病或主轴中部发病，或颈部有病，但对产量影响不大，中抗；3级主轴中部或颈部发病，对产量有显著影响，感病；4级穗颈发病造成白穗,高感；选择对穗颈瘟表现为穗颈瘟抗性为0-1级)的F5小区即为即为获得的抗江苏省粳稻穗颈瘟的水稻品种。
3.根据权利要求I或2所述的育种方法，其特征在于在F4代中选择同时含有基因纯合和基因纯合的单株分别种成F5小区，F5 小区内选择株高9(Tl00cm、每株8 10穗、每穗14(Tl50粒的单株加代稳定，于F6代获得农艺性状稳定一致、抗穗颈瘟的水稻品系。
4.根据权利要求3所述的育种方法，其特征在于所述水稻品系南京14128，该品系株高98 102cm，每株8 10穗，平均穗长17 18cm，直立穗型，每穗总粒数140 150粒，结实率94% 98%，千粒重26 27g。
全文摘要
本发明涉及一种培育抗江苏省粳稻穗颈瘟水稻新品种的育种方法，属水稻遗传改良与生物技术应用领域。选用中感穗颈瘟品种淮稻10(含有Pi-ta基因)与感穗颈瘟品种南粳38(含有Pi-b基因)配制杂交配组；F1、F2、F3代单株混收，F4代开始进行稻瘟病抗病基因Pi-ta和Pi-b分子标记辅助选择，聚合2个抗性基因获得基因型为Pi-taPi-taPi-bPi-b的双基因纯合体；后续世代经产量与农艺性状选择，至F6代选育出农艺性状稳定一致、抗江苏粳稻穗颈瘟的高产水稻新品系。本发明不仅能够快速选育出抗江苏省粳稻穗颈瘟的水稻新品种，而且不需要大量的接种鉴定，节约了育种成本。
文档编号A01H1/02GK102577925SQ201210035778
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月17日 优先权日2012年2月17日
发明者仲维功, 朱金燕, 杨杰, 王军, 范方军 申请人:江苏省农业科学院