含胶原蛋白与透明质酸的细胞组织胶体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是关于一种含胶原蛋白与透明质酸的细胞组织胶体。
【背景技术】
[0002] 在治疗退化性疾病中，干细胞疗法被视为是一种相当有希望的方法。然而，将干细 胞保留在病患体内的植入位置（implantationsite)并且维持其存活度以实现组织修复仍 具有一定的挑战性。因此，研发一种介质（例如细胞组织胶体）使干细胞伴随着高存活度 地移植于特定位置为目前相关产学界亟需达到的重要目标之一。
[0003] 伤口愈合是一种对组织损伤的自然修复反应。愈合是由细胞一连串复杂的交互作 用而产生，使受伤皮肤的抗拉强度能重铺（resurfacing)、重建（reconstitution)和修复 (restoration)。与非糖尿病患者相比，糖尿病患者的伤口需要更长的时间进行愈合。
【发明内容】
[0004] 本发明提供一种含胶原蛋白与透明质酸的细胞组织胶体，其中以整体重量为基 础，该胶原蛋白与该透明质酸的比例介于0.01 :1-100 :1之间，例如0.05-100 :1、1-50 :1、 100 :1、75 :1、50 :1、30 :1、25 :1、15 :1、10 :1、5 :1、1 :1、0· 5 :1、0· 2 :1 或 0· 1 :1。该透明质酸 的浓度可为 〇· 〇〇l_l〇〇mg/ml(例如：0· 01 至 1mg/ml、0. 5 至 100mg/ml、0. 5mg/ml、lmg/ml、 1 · 5mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、75mg/ ml或lOOmg/ml)，而该胶原蛋白的浓度可为0.OOlmg/ml至lOOmg/ml(例如，l-100mg/ml、 10-100mg/ml、100mg/ml、75mg/ml、50mg/ml、30mg/ml、25mg/ml、15mg/ml、10mg/ml或 5mg/ ml)。举例来说，胶原蛋白的浓度介于0.l-100mg/ml，而透明质酸的浓度为0. 01-35mg/ml。 在一实施例中，胶原蛋白的浓度介于3-40mg/ml(例如6mg/ml或9mg/ml)，而透明质酸的浓 度为0. 2-20mg/ml。在另一实施例中，透明质酸的浓度为0. 5-100mg/ml，而胶原蛋白的浓度 为 5_50mg/ml〇
[0005] 本发明的细胞组织胶体可进一步包含可供细胞生长的营养素（例如：细胞培 养基或维他命）、生物活性剂、一个或多个基质要素以及/或干细胞。该生物活性剂可 为生长因子，例如上皮生长因子（epidermalgrowthfactor)、纤维母细胞生长因子 (fibroblastgrowthfactor,FGF)、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowth factor,VEGF)、结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor)、血小板衍生性 生长因子（platelet-derivedgrowthfactor,F1DGF)、类膜岛素生长因子（insulin-like growthfactor)、神经生长因子（nervegrowthfactor)、肝细胞生长因子（hepatocyte growthfactor,HGF)、细胞聚落刺激因子（colony-stimulatingfactor)、干细胞因子 (stemcallfactor)、角质细胞生长因子（keratinocytegrowthfactor)、颗粒球细胞 聚落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor)、颗粒球巨细胞聚落刺激 因子（granulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor)、胶质衍生神经营养因 子（glial-derivedneurotropicfactor)、睫状神经营养因子（ciliaryneurotrophic factor)、内皮单核细胞活化多胜肽（endothelial-monocyteactivatingpolypeptide)、 上皮中性粒细胞活化胜肽（epithelialneutrophilactivatingpeptide)、红血球生成 素（erythropoietin)、骨形成蛋白（bonemorphogeneticprotein)、大脑衍生神经营养 因子（brain-derivedneurotrophicfactor)、BRAK、车专化生长因子-β(transforming growthfactorbeta)或肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor)中的一种或多种。所 述基质要素包括，但不限于：明胶（gelatin)、纤维连接蛋白（fibronectin)、弹性蛋白 (elastin)、细胞黏合素（tenacin)、层黏蛋白（laminin)、玻璃连接蛋白（vitronectin)、多 胜肽（polypeptides)、硫酸肝素（heparansulfate)、软骨素（chondroitin)、硫酸软骨素 (chondroitinsulfate)、角质素（keratan)、硫酸角质素（keratansulfate)、硫酸皮肤素 (dermatansulfate)、鹿角菜胶（carrageenan)、肝素（heparin)、几丁质（chitin)、几丁聚 糖（chitosan)、褐藻胶（alginate)、琼脂糖（agarose)、琼脂（agar)、纤维素（cellulose)、 甲基纤维素（methylcellulose)、駿基甲基纤维素（carboxylmethylcellulose)或肝 醣（glycogen)中的一种或多种。当所述细胞组织胶体含有明胶时，明胶的浓度可介于 0. 01-100mg/ml之间（例如lmg/ml)。较佳的，于所述含有明胶的细胞组织胶体中，胶原蛋 白以及透明质酸的浓度分别介于6-40mg/ml之间以及0. 2-20mg/ml之间。
[0006] 本发明亦提供一种输送细胞（例如干细胞）至一受体的方法，包含（i)提供一含 有上述细胞组织胶体的细胞植入体，使细胞生长于所述细胞组织胶体中；以及（ii)将所述 细胞植入体置于受体内的某一位置。此外，使用所述细胞组织胶体制备一种用于细胞输送 的细胞植入体的方法也属于本发明的范畴。
[0007] 本发明的细胞组织胶体可用于一个体的伤口中，以治疗或促进伤口愈合。
[0008] 下文特举一些实施例作本发明的详细说明。本发明的其他目的或特征将呈现于下 述实施例及申请专利范围中。
【附图说明】
[0009] 图1显示不同配比的细胞组织胶体对细胞增生的影响。图1A为各种细胞组织胶 体对于活化的HL-60细胞的增生效果。图1B为各种细胞组织胶体对于RAW264. 7细胞的增 生效果。图1C为各种细胞组织胶体对于NIH3T3细胞的增生效果。
[0010] 图2显示不同配比的细胞组织胶体对发炎细胞的影响。图2A为各种细胞组织胶 体对于活化的HL-60细胞的影响。图2B为各种细胞组织胶体对于U937细胞的影响。
[0011] 图3显示不同分子量的透明质酸对细胞趋化作用的影响。图3A为各透明质酸对 于活化的HL-60细胞的趋化作用结果。图3B为各透明质酸对于RAW264. 7细胞的趋化作 用结果。
[0012] 图4显示不同浓度及不同分子量的透明质酸（HA)对TGF-βl、TGF-f3 2与TGF-0 3 表现的影响。
[0013] 图5显示各种细胞组织胶体对伤口愈合的影响。图5A为不同的处理天数下，伤口 愈合的状况。图5B为不同的处理天数下，伤口大小的改变。
[0014] 图6显示在伤口植入各细胞组织胶体后1个月（图6A)及2个月（图6B)的组织 切片。
[0015] 图7显示各细胞组织胶体对糖尿病患者伤口愈合的影响。图7A为不同的处理天 数下，伤口愈合的状况。图7B为不同的处理天数下，伤口大小的改变。
[0016] 图8显示猪伤口的矩阵模式，A为2个月大的兰屿猪侧面伤口示意图；B为猪伤口 矩阵放大图。
[0017] 图9显示在各细胞组织胶体处理下，猪伤口的愈合情况。
[0018] 图10显示猪的伤口在细胞组织胶体处理后2个月（图10A)及6个月（图10B) 的结果。
[0019] 图11显示在不同处理下，猪伤口愈合情况。
[0020] 图12显示胶原蛋白（图12A)与透明质酸（图12B)对干细胞增生的影响。
【具体实施方式】
[0021] 本发明是关于一种含有胶原蛋白与透明质酸的细胞组织胶体，所述胶原蛋白与所 述透明质酸的重量比为 〇· 01:1-100 :1(例如：〇· 05-100 :1、1-50 :1、100 :1、75 :1、50 :1、30 : 1、25 :1、15 :1、10 :1、5 :1、1 :1、0. 5 :1、0. 2 :1或0. 1 :1)，且所述细胞组织胶体可选择性地 包括一个或多个其他成分，例如基质要素、生物活性剂以及可供细胞生长的营养素。
[0022] 胶原蛋白
[0023] 任何自然产生的胶原蛋白或具有其功能性的胶原蛋白变异体均可被用来制备 本发明的细胞组织胶体。目前已经发现至少有28种带有不同遗传讯息的胶原蛋白。胶 原蛋白可以从富含胶原蛋白的组织（例如皮肤、肌腱、韧带及人类或动物的骨头）中单 独分离或纯化出来。分离及纯化胶原蛋白的方法为本领域技术人员皆知的方法，亦可 参见所附的文献：美国第5, 512, 291号专利、美国第2004/0138695号专利、Methodsin Enzymology,vol. 82,ρρ· 33-64, 1982、ThePreparationofHighlypurifiedInsoluble Collagen,Oneson,I. ,etal. ,Am.LeatherChemistsAssoc. ,Vol.LXV,pp. 440-450, 1970 以及美国第6, 090, 996号专利。胶原蛋白也可通过重组技术，如AdvancedTissue Sciences(LaJolla,Calif.)所述的重组技术制备而成，或市售购得，例如Fibergen或 SouthSanFrancisco,Calif. 〇
[0024] 以下利用实例进行说明。将小牛的深屈肌腱移除脂肪与筋膜（fascia)后，用水清 洗并冷冻，之后切成数个厚度均为〇. 5毫米的肌腱薄片。取适量的肌腱薄片置入50毫升的 水中，于室温下进行第一次萃取，所需时间为24小时。将水溶性部份去除后，将肌腱薄片置 入酸性溶液（例如0.2N盐酸溶液）中，于适当温度下（例如室温下）进行一段时间（例如 12-24小时）的萃取，随后将酸性溶液去除，并以水冲洗肌腱薄片以去除残留的酸。经冲洗 后的肌