专利名称：一种Ⅱ型胶原透明质酸复合海绵支架及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种组织工程中软骨修复用的仿生II型胶 原海绵 支架。
背景技术：
关节软骨主要由大量细胞外基质与分布在其中的高度特异性细胞-软骨细胞组 成，软骨缺损在临床上尚无特效治疗方法，组织工程软骨移植是目前治疗软骨缺损最新、最 有希望的治疗技术之一，即将体外培养的种子细胞种植于天然或人工合成的、可在机体降 解和吸收的材料支架上，然后将复合物移植入动物或人体内的缺损部位，形成具有类似软 骨结构和功能的组织，从而完成缺损部位的修复与再造。组织工程支架材料实际扮演着细胞生长微环境的作用，细胞与基质之间的相互作 用在软骨修复中非常重要。因此，良好的支架材料应提供与天然软骨组织相似的环境。软 骨基质主要由II型胶原和蛋白多糖所组成；II型胶原呈网状结构分布于整个软骨基质中， 其主要功能就是为软骨细胞提供张力和承受力，以防止软骨组织在受到外力时被撕裂，还 为软骨细胞的粘附提供基础，并参与软骨细胞的表型分化的调节，但是II型胶原提取方法 复杂，尤其是提取高纯度的II型胶原较为困难，目前市场上高纯度的II型胶原的价格较昂 贵。叶春婷、李斯明等在《中国矫形外科杂志》2001年1月第8卷第1期上的“II型胶原的 研制及其在软骨细胞培养中的应用”和《生物医学工程学杂志》上的“高纯度猪软骨II型胶 原的制备与检测”等文献公开了的目前较为理想的II型胶原的提取方法，可以得到高纯度 的II型胶原。透明质酸是蛋白多糖的重要成份之一，大量研究证实在维持软骨细胞表型、 促进软骨基质分泌等方面发挥了重要的作用，现已作为关节功能改善剂和防粘连阻隔剂在 临床上广泛使用。以胶原和蛋白多糖复合天然支架材料的研究是软骨组织工程支架材料研究的重 点。因为提取方法上的困难或成本的关系，国内外所用的胶原支架多以I型为主。Allemarm 等[J Biomed Mater Res. 2001，55 (1) :13_19]及吴炜等在“中国修复重建外科杂志” 2007 年第21卷第4期发表的论文报道I型胶原_透明质酸支架与软骨基质II型胶原结构相距 甚远；II型胶原_透明质酸支架材料研究国内外报道较甚少，仅有Taguchi等[J Biomed Mater Res. 2002，61 (2) :330_336]和李长青等[第三军医大学学报，2005，27 (13)]报道研 制的II型胶原_透明质酸复合6-硫酸软骨素海绵支架，在制备方法上先用0. 01mol/L盐 酸溶解纯胶原海绵，配成1. 25% (W/V)即12. 5mg/ml的II型胶原溶液，并用1N盐酸调整 pH值至1 2，再加入透明质酸钠溶液混勻，添加6-硫酸软骨素然后经过交联制成II型胶 原复合海绵。生理条件下，胶原和透明质酸带有相反的电荷，极容易形成聚合物(polyion complex, PIC)，而产生沉淀，导致胶原与透明质酸混合不均勻，这成为构建胶原透明质酸复 合海绵支架的难题。目前采用的办法主要是将两者混合而形成的聚合物用勻浆器在低温下 搅拌，得到均勻的混悬液后进行冻干和交联[Park，Biomaterials，2003，24 1631-1641，吴炜，中国修复重建外科杂志，2007，21 (4) 401-405]；另外，李长青等[第三军医大学学报， 2005，27 (13)]报道研制的II型胶原-透明质酸复合6-硫酸软骨素海绵支架，其制备过程 是用盐酸溶解成品II型胶原海绵，用1N盐酸调节pH值在1 2的条件下混合透明质酸 钠，以抑制PIC的形成，然后搅拌混合。上述方法由于pH值太低会对胶原产生不良的影响， 或对胶原的物理结构产生一定的破坏，使纤维断裂，只有采用较大浓度的(1.25% (W/V)即 12. 5mg/ml)的II型胶原溶液，才能制备出合适的孔径结构及一定的力学强度的海绵支架。 上述方法所需胶原浓度太高(如公开号CN101066469A专利申请所述，或文献Allemarm， JBiomed Mater Res, 2001, 55 13-19，常用胶原液浓度约0. 5%较为理想)，造成生产成本较 尚o
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供一种组分与天然软骨相似，理化性能和生物相容 性良好的人工合成的II型胶原透明质酸复合海绵支架。本发明的II型胶原_透明质酸复合海绵支架，是通过如下方法制备的(1) II型胶原溶液的制备，提供高纯度II型胶原溶液；(2) II型胶原溶液的浓缩，将步骤(1)得到的II型胶原溶液注入透析袋中，用足量 的聚乙二醇粉剂包埋透析袋，然后置于低温下浓缩，收集备用；(3)勻浆，将透明质酸钠水溶液加入II型胶原溶液中形成沉淀，于4°C低温状态下 勻浆，成为II型胶原透明质酸钠勻浆液；(4)取步骤(3)的II型胶原透明质酸勻浆液与步骤⑵的II型胶原溶液均勻混 合，使透明质酸钠的含量达到5% (W/W)，II型胶原溶液终浓度为4. 33mg/ml，得到II型胶 原透明质酸复合液；(5)冷冻干燥，步骤(4)得到的II型胶原透明质酸复合液于-80°C低温冰箱中预 冷冻，然后在-30 -40°C下真空冷冻干燥机中冷冻干燥25小时，即得均勻连通孔径的II 型胶原透明质酸复合海绵；(6)交联，配置碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液作交联剂，将步骤(5) 得到的II型胶原透明质酸复合海绵浸泡在上述交联剂中进行交联，交联后的II型胶原海 绵用蒸馏水清洗干净，再进行步骤(5)的冷冻干燥步骤，即得II型胶原透明质酸海绵支架。其中，步骤(2)中用聚乙二醇粉剂包埋透析袋后，置于4°C下浓缩2小时。优选地，步骤(3)中将透明质酸钠水溶液加入II型胶原溶液中形成沉淀后于4°C 低温状态下8000转/分种勻浆3分钟，成为II型胶原透明质酸勻浆液。优选地，步骤(5)中II型胶原透明质酸复合液在冻干瓶中于-80°C低温冰箱中冷 冻24小时。优选地，步骤(5)中-80°C冷冻后的II型胶原透明质酸复合液在冷冻干燥机中 于-30 _40°C下进行冷冻干燥25小时。其中，步骤⑷中所述交联剂为碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在95%乙醇 里，配制成的碳化二亚胺浓度为33mmol/L、N-羟基琥珀酰亚胺浓度为8mmol/L的交联剂。优选地，步骤(4)中II型胶原透明质酸海绵在交联剂中交联的时间为24小时。进一步地，步骤(4)制备出来的II型胶原透明质酸海绵支架，用Co6°进行消毒后
本发明还提供上述制备方法制备出的II型胶原-透明质酸复合海绵支架，在软骨 修复中的应用。本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架可作为组织工程植入物，用于修 复关节软骨缺损；如细胞培养支架材料或药物控释等应用于软骨损伤修复的防治。本发明中用到的高纯度II型胶原溶液的提取，可以采用现有的提取方法，详细可 参照李斯明、叶春婷等在《生物医学工程学杂志》(2001，18(4)592-594)上的“高纯度猪软骨 II型胶原的制备与检测”中公开的制备方法。该制备方法是以猪透明软骨为原料，采用盐 酸胍抽提蛋白多糖，酸性条件下酶解，中间过程经多步纯化去除杂质、降解及变性产物，盐 析纯化制备出产品，经SDS-PAGE电泳、氨基酸成份分析和紫外最大吸收光谱的结果表明， 所提取的II型胶原为高纯度II型胶原，该提取方法采用猪软骨作原料，来源丰富，成本低， 是一种较理想的提取方法。本发明制备出的II型胶原透明质酸复合海绵支架与常见的I型胶原海绵相比，本 发明的II型胶原与透明质酸复合海绵均为软骨细胞基质，具有复合调控软骨细胞生长的 作用，更符合软骨细胞的生理要求。本发明自行提取II型胶原溶液后用聚乙二醇法进行浓缩，使其浓度为4. 5mg/ ml (0. 43% ff/V)，即能制备孔径为82士7mm的复合海绵支架，并具备适当的力学强度；而现 有文献报道方法采用盐酸溶解纯胶原海绵或干粉，配成1. 25% (W/V)即12. 5mg/ml的II型 胶原溶液才能制备出与本法孔径和力学强度相当的支架材料。目前商品化的II型胶原相 当昂贵，本发明能大大地节约生产成本。本发明采用部分勻浆的方法使II型胶原与透明质酸均勻混合，与传统的全勻浆 方法相比较，能最大限度地减少机械旋转作用对胶原纤维的破坏，维持胶原纤维的完整性， 保持支架材料的力学性能。本发明的制备方法中采用的部分勻浆法，让先加入的透明质酸 钠和少量II型胶原混合，将此时形成的沉淀PIC勻浆搅拌，制备成II型胶原透明质酸勻浆 液，然后再加入大量的II型胶原溶液，此时不再形成PIC，然后再进行冷冻交联等步骤，该 方法制备出的复合海绵支架性能良好，不受中间产物PIC的影响。本发明使用II型胶原浓度为4. 5mg/ml (0. 43% ff/V)制备海绵支架材料，可得到平 衡含水率为43mg/mg(97.66% )的支架材料，表示本发明的支架材料具备很强的吸水性能， 并能在培养液中提供良好的交换能力；而现有文献报道方法采用1.25% (W/V)即12.5mg/ ml的II型胶原溶液制备的支架材料，由于溶液浓度过高或结构受到一定程度破坏的原因， 其平衡含水率只有(79% )。通过碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)双重交联提高II型胶原透明 质酸复合海绵的力学强度，以增加孔径结构的三维稳定性。交联后的海绵材料在弹性模量 及极限拉应力方面均有很大程度的提高。本发明的II型胶原透明质酸海绵支架具有更强 的生物力学性能，能长期保持GFP转染软骨细胞的稳定性。下面将结合实验及其附图详细介绍本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架。
图1为本发明的II型胶原透明质酸海绵支架材料外观图；图2a为全勻浆的I型胶原透明质酸海绵激光共聚焦显微镜扫描图(X 100)；
图2b为全勻浆的II型胶原透明质酸复合海绵支架激光共聚焦显微镜扫描图 (X100)；图2c为本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架激光共聚焦显微镜扫描图 (X100)；图3a为全勻浆的I型胶原透明质酸海绵红外光谱(FTIR)分析图；图3b为本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架红外光谱(FTIR)分析图；图4a为荧光显微镜下(X 100)，转染GFP基因的软骨细胞在I型胶原透明质酸支 架中立体培养14天生长情况图，GFP转染软骨细胞呈现绿色荧光；图4b为荧光显微镜下(X 100)，转染GFP基因的软骨细胞在本发明的II型胶原透 明质酸复合海绵支架材料中立体培养14天，成片生长情况图，GFP转染软骨细胞呈现绿色 荧光；图5a为激光共聚焦显微镜下(X100)材料各层立体扫描，转染GFP基因的软骨 细胞在I型胶原透明质酸支架中立体培养28天生长情况图，GFP转染软骨细胞呈现绿色荧 光；图5b为激光共聚焦显微镜下(X100)材料各层立体扫描，转染GFP基因的软骨细 胞在本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架材料中立体培养28天，成片生长情况图， GFP转染软骨细胞呈现绿色荧光。
具体实施例方式实施例、本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架的制备1、高纯度II型胶原的制备参照李斯明、叶春婷等，高纯度猪软骨II型胶原的 制备与检测，生物医学工程学杂志，2001，18 (4) 592-594材料新鲜猪关节软骨取材于屠场新鲜屠宰的猪的四肢关节软骨盐酸胍Farco500g/ 瓶胃蛋白酶Sigma100g/瓶其余均为国产分析纯试剂。方法从新鲜屠宰的猪四肢关节中切取透明软骨，切成薄片，脱脂、捣碎、制勻浆，然后用 10倍体积的4M(pH7. 5)盐酸胍搅拌24小时，离心分离；沉淀径充分洗涤，称取沉淀湿重约 为260g软骨颗粒，用质量比1/50的胃蛋白酶在酸性条件下酶解24 48h，离心，上清液经 EDTA终止酶解后用10% NaCl盐析，沉淀用2000ml的0. 5M HAc使其充分溶解，对水透析脱 盐和脱酸，得到胶原溶液原液(浓度为2. 9mg/ml左右)。上述制备方法制备的II型胶原溶液，纯度较高，若需要进一步得到更高纯度的II 型胶原溶液，可将上述制备方法制备出的II型胶原溶液进一步上S印harose H. P.阴离子 柱，再进行层析纯化。2、II型胶原溶液的纯度检测根据李斯明、叶春婷等在《生物医学工程学杂志》2001，18 (4) 592-594上的“高纯度猪软骨II型胶原的制备与检测”中公开的检测方法对 II型胶原溶液进行纯度检测，此处不再赘述。
3、II型胶原溶液的浓缩，将上述得到的初始浓度为2. 9mg/ml的II型胶原溶液注 入长约15cm直径约为5cm的透析袋中，密封后置于500ml的烧杯中，再加入足量的聚乙二 醇粉剂(分子量6000D)包埋透析袋，然后置于干燥皿中在4°C下浓缩2小时，得到的II型 胶原溶液浓度为4. 5mg/ml，收集备用。4、勻浆，称取透明质酸钠12mg，溶于2ml蒸馏水中，配制成透明质酸钠溶液，浓度 为6mg/ml ；加入II型胶原溶液中形成沉淀，于4°C低温状态下勻浆(8000转/分种)3分 钟，成为II型胶原透明质酸勻浆液；5、取步骤4的II型胶原透明质酸勻浆液9ml与II型胶原溶液31ml均勻混合，使 透明质酸钠的含量达到5% (W/W)，II型胶原溶液终浓度为4. 33mg/ml ；6、冷冻干燥，将得到的II型胶原复合液注入冻干瓶中，于-80°C低温冰箱中预冷 冻24小时，然后在-30 -40°C下真空冷冻干燥机中冷冻干燥25小时，即得均勻连通孔径 的II型胶原透明质酸复合海绵；7、交联，配制碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液作交联剂，碳化二亚胺 和N-羟基琥珀酰亚胺，溶解在95%乙醇里，配制成的碳化二亚胺浓度为33mmol/L、N-羟基 琥珀酰亚胺浓度为8mmol/L的交联剂，室温下将II型胶原透明质酸复合海绵浸泡在上述交 联剂中交联24小时。8、交联后的复合II型胶原海绵用蒸馏水清洗干净，再次冷冻干燥，即得II型胶原 透明质酸复合海绵支架；9、把上述得到的复合海绵支架用Co6°消毒备用。如图1所示，为本发明的II型胶原透明质酸海绵支架材料外观图。实验例一红外光谱(FTIR)分析本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架材料，与文献报道的I型胶原透明质酸 复合海绵材料作比较，用红外光谱仪测定(Spectrum one，美国Perkin-Elmer公司)。对照FTIR谱图，本发明采用部份勻浆法制得II型胶原透明质酸复合海绵支架，与 传统的全勻浆法制得I型胶原透明质酸复合海绵，于1402cm—1处两者均出现透明质酸的特 征吸收峰，证实两种勻浆方法均能制备具有胶原与透明质酸两种特性的复合海绵，结果如 图3a和图3b所示。实验例二 11型胶原透明质酸复合海绵支架材料的孔径检测本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架材料，与文献报道的I型胶原透明质酸 复合海绵和现有全勻浆方法制备的II型胶原透明质酸材料作比较。结果见表1采用激光共聚焦显微镜对两种胶原海绵进行胶原自发荧光分层扫描，激发波长为 488nm，发射波长为520nm，以自发荧光信号强度为限进行测量，测定海绵材料的孔径大小； 使用CLSM图像分析系统进行操作和分析，然后以SPSS13. 0软件包对数据处进行统计。结果如图2a和图2b和图2c所示，激光共聚焦显微镜结果显示各组的胶原海绵均 具有明显的自发荧光，表明本发明的II型胶原复合海绵支架材料具有胶原特有的生物学 特性。激光共聚焦显微镜结果显示本发明的II型胶原复合海绵支架材料的孔径为 92. 63士32. 51 u m,符合软骨细胞的生长要求；全勻浆方法制备的II型胶原复合海绵材料 的孔径为士 210. 1 士 70. 74 iim，I型胶原复合海绵材料的孔径为士 241. 87 士 59. 87 y m，上述
7两种方法制备的材料与本发明方法相比效孔径明显偏大。表1各种方法制备海绵支架材料的性能比较 *与其余两组比较P < 0. 01实验例三11型胶原透明质酸复合海绵支架材料的孔隙率检测本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架材料、文献报道的I型胶原透明质酸复 合海绵材料和现有全勻浆方法制备的II型胶原透明质酸材料作比较，结果如表1。取海绵材料，称量(ms)，浸入盛满乙醇，质量为叫的比重瓶中，使乙醇充分充盈于 胶原海绵孔隙中。脱气，加满乙醇，再次称量，质量记为m2，小心取出胶原海绵，称量剩余乙 醇与比重瓶的质量，记为m3，孔隙率按照如下公式计算 式中分子表示与海绵中孔隙具有相同体积的乙醇的质量，分母表示与海绵的虚 体积(海绵实有体积与孔隙体积之和)相同体积的乙醇的质量。I型胶原透明质酸复合海绵材料孔隙率为98. 60%，全勻浆法制备的II型胶原透 明质酸材料孔隙率为97. 13%，本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架材料的孔隙率为 94. 89%，三者的胶原浓度、透明质酸的加入比例一致，因此孔隙率基本没有差异，均具有良 好的孔洞结构。实验例四11型胶原透明质酸复合海绵支架材料的平衡含水率检测本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架材料、文献报道的I型胶原透明质酸复 合海绵材料和和现有全勻浆方法制备的II型胶原透明质酸作比较。结果如表1。质量为m的海绵在水中浸泡24h后测其质量mw。在同一块海绵中取三块样品进行 重复试验。吸水率按照如下公式计算吸水率(mg/mg) = (mw_m)/m本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架的平衡含水率为97. 66%，全勻浆 法制备的II型胶原透明质酸材料平衡含水率为97. 13%, I型胶原透明质酸复合海绵为 98. 68%，三者均具有较强的吸水性能，提供良好的物质交换能力。实验例五11型胶原透明质酸复合海绵支架材料的生物力学检测本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架材料、文献报道的I型胶原透明质酸复 合海绵材料和和现有全勻浆方法制备的II型胶原透明质酸材料作比较。用刀具将海绵材料裁剪成25mmX 5mm大小，用厚度测量仪测定试样厚度。将试样 固定在力学试验机上，以5mm/min拉伸速率，测试材料的抗张强度和断裂伸长率。三种方法制备的材料力学结果如表2，抗张强度结果显示出采用现有全勻浆方法制备的材料，无论是I型还是II型，由于勻浆过程对胶原纤维有一定的破坏，在其余条件基 本相同的情况下其力学性能明显降低；单纯II型胶原的结构与排列有别于I型，其力学性 能也低于I型，因此采用全勻浆法对力学强度影响尤其显著；此外，断裂伸长率的结果显示 三种材料的伸长率均在40%以上，表明材料的延伸性良好。表2各种方法制备海绵支架材料的力学性能比较 实验例六(GFP)转染软骨细胞在II型胶原透明质酸复合海绵支架材料中长期培 养稳定性观察本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架材料，与文献报道的I型胶原透明质酸 复合海绵材料作比较。原代分离兔软骨细胞，将第三代软骨细胞接种于25cm2培养瓶中，接种密度为 7.5父105个细胞/瓶。加入DMEM完全培养基(含有血清和抗生素)，37°C，5% C02条件下 孵育过夜。加入携带绿色荧光蛋白(GFP)的病毒上清液感染软骨细胞，用DMEM-F12培养基， 37V,5% C02条件下培养过夜，在荧光显微镜下观察GFP的绿色荧光表达。分别将转染GFP基因的软骨细胞接种于本发明的II型胶原海绵支架材料与对照 组材料中，接种浓度为1X105个细胞/ml，在DMEM-F12完全培养基(含有血清和抗生素) 进行立体培养，隔天换液，长期培养观察细胞在材料中的生长情况；一周内每天观察，一周 后每三天观察一次，观察时间最长为28天。 在激光共聚焦显微镜下三维立体观察GFP的绿色荧光表达，如图4a，4b所示，可见 大量的细胞成团生长，在支架材料(本发明的II型胶原海绵支架材料)中附着良好，细胞 与材料之间呈现着良好的相容性。如图5a和图5b所示，材从料表层至底层的立体扫描图 显示，无论是细胞数量或GFP的绿色荧光维持时间，本发明的II型胶原海绵支架材料均明 显优于I型胶原透明质酸复合海绵材料。实验例七本发明方法的II型胶原海绵支架材料及其制备方法与现有的李长青 等文献报道的II型胶原透明质酸海绵材料及其制备方法的比较[李长青，周跃，张传志仿 生髓核组织工程细胞支架的构建及初步理化指标分析。第三军医大学学报.2005，27 (13) 351 354]。表3本发明方法与现有方法的比较 由上述列表可看出，本发明的II型胶原海绵支架材料的制备方法所用的II型胶 材料浓度低，制备而成的II型胶透明质酸复合海绵支架材料的孔径较均勻，孔径大小更合 适，海绵支架含水率更高，具备良好的物质交换能力。 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种II型胶原透明质酸复合海绵支架，其特征在于，是通过如下方法制备的(1)II型胶原溶液的制备，提供高纯度II型胶原溶液；(2)II型胶原溶液的浓缩，将步骤(1)得到的II型胶原溶液注入透析袋中，用足量的聚乙二醇粉剂包埋透析袋，然后置于低温下浓缩，收集备用；(3)匀浆，将透明质酸钠水溶液加入II型胶原溶液中形成沉淀，于4℃低温状态下匀浆，成为II型胶原透明质酸匀浆液；(4)取步骤(3)的II型胶原透明质酸匀浆液与步骤(2)的II型胶原溶液均匀混合，使透明质酸钠的质量百分数达到5％，II型胶原溶液终浓度为4.33mg/ml，得到II型胶原透明质酸复合液；(5)冷冻干燥，步骤(4)得到的II型胶原透明质酸复合液于-80℃低温冰箱中预冷冻，然后在-30～-40℃下真空冷冻干燥机中冷冻干燥25小时，即得均匀连通孔径的II型胶原透明质酸复合海绵；(6)交联，配制碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液作交联剂，将步骤(5)得到的II型胶原透明质酸复合海绵浸泡在上述交联剂中进行交联，交联后的II型胶原海绵用蒸馏水清洗干净，再进行步骤(5)的冷冻干燥步骤，即得II型胶原海绵支架。
2.如权利要求1所述的II型胶原透明质酸复合海绵支架，其特征在于，步骤(2)中用 聚乙二醇粉剂包埋透析袋后，置于4°C下浓缩2小时。
3.如权利要求1或2所述的II型胶原透明质酸复合海绵支架，其特征在于，步骤(3) 中将透明质酸钠水溶液加入II型胶原溶液中形成沉淀后于4°C低温状态下8000转/分种 勻浆3分钟，成为II型胶原透明质酸勻浆液。
4.如权利要求3所述的II型胶原透明质酸复合海绵支架，其特征在于，步骤(5)中II 型胶原透明质酸复合液在冻干瓶中于-80°C低温冰箱中冷冻24小时。
5.如权利要求1或4所述的II型胶原透明质酸复合海绵支架，其特征在于，步骤(5) 中-80°C冷冻后的II型胶原透明质酸复合液在冷冻干燥机中于-30 -40°C下进行冷冻干 燥25小时。
6.如权利要求5所述的II型胶原透明质酸复合海绵支架，其特征在于，步骤(4)中所 述交联剂为碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在95%乙醇里，配制成的碳化二亚胺浓 度为33mmol/L、N-羟基琥珀酰亚胺浓度为8mmol/L的交联剂。
7.如权利要求1或6所述的II型胶原透明质酸复合海绵支架，其特征在于，步骤(4) 中II型胶原海绵在交联剂中交联的时间为24小时。
8.如权利要求1所述的II型胶原透明质酸复合海绵支架，其特征在于，步骤(4)制备 出来的II型胶原海绵支架，用Co6°进行消毒后备用。
9.如权利要求1所述的II型胶原透明质酸复合海绵支架，在软骨修复中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种组织工程中软骨修复用的仿生II型胶原透明质酸复合海绵支架。本发明的II型胶原透明质酸复合海绵支架在提取出的高纯度II型胶原溶液后，用聚乙二醇浓缩法，对II型胶原溶液进行浓缩，然后采用部分匀浆法将透明质酸溶液与高纯度II型胶原溶液分次进行混合，然后用EDC和NHS双重交联剂对浓缩后的II型胶透明质酸复合海绵进行交联制备得到的。本发明的II型胶原透明质酸海绵支架可作为组织工程植入物，细胞培养支架材料或药物控释等应用于软骨损伤修复的防治。
文档编号A61L27/40GK101862475SQ20091019297
公开日2010年10月20日 申请日期2009年10月10日 优先权日2009年10月10日
发明者杨小红, 秦胜男, 陈鸿辉 申请人:广州市创伤外科研究所