治疗糖尿病足的混合干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及干细胞制剂及其制备方法，尤其及一种用于治疗糖尿病足的干细胞制 剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病足是糖尿病患者由于并发神经病变及各种不同程度末梢血管病变而导致 下肢感染、溃瘍形成和(或)深部组织的破坏，是导致糖尿病患者致残致死的严重慢性并发 症之一。糖尿病外周血管病变常常累及双下肢动脉，早期主要表现为间歇性贩行，随着狭窄 的加重可出现静息痛甚至丧失行走能力，如缺血伴感染和神经病变可导致局部组织坏死、 溃瘍和坏痘而形成缺血性糖尿病足。大约有60%的非创伤性小腿截肢是由糖尿病足引起， 糖尿病足给社会及家庭造成了沉重的医疗负担。利用干细胞的血管新生机制进行糖尿病双 下肢缺血性病变，是近年来的一项崭新的技术，目前，取得了较好的临床效果。
【发明内容】
[0003] 本发明需解决的技术问题是提供一种疗效好的治疗糖尿病足的混合干细胞制剂。
[0004] 为解决上述的技术问题，本发明设计了一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂，其 包括胎盘造血干细胞和间充质干细胞，所述胎盘造血干细胞的浓度为1-2 X IO5个/ml，所述 间充质干细胞的浓度为5-10 X IO6个/ml。
[0005] 作为本发明进一步改进，所述间充质干细胞是厮带间充质干细胞。
[0006] 本发明还提供了一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，其包括W下步 骤：
[0007] SI:制备间充质干细胞的步骤，其包括：
[000引Sll:获得人厮带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
[0009] S12:将组织块接种于培养瓶中，加入MSCs生长培养液，置入37°C、含有体积分数为 5 %的C02的细胞培养箱中培养；
[0010] S13:当细胞贴壁生长达70% W上汇合后，弃组织块，利用消化液消化，使消化液覆 盖所有细胞表面，见细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化，制成单细胞悬液；
[0011] S14:将单细胞悬液置于离屯、管中，离屯、，用MSCs生长培养液重悬细胞，按1:2~1:3 的比例传代培养，传至第=代后，得间充质干细胞细胞液；
[0012] S2:制备胎盘造血干细胞的步骤，其包括：
[0013] S21:获得胎盘组织，用酶溶液消化，得到消化产物，去除所述消化产物中的组织残 渣，得到酶解液；
[0014] S22:将所述酶解液与径乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，再得到上层 的有核细胞悬液，将所述有核细胞悬液与冻存液混合得到胎盘造血干细胞液；
[0015] S3:配制治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的步骤，包括：
[0016] 将所述胎盘造血干细胞液添加到所述间充质干细胞细胞液中，边添加，边混合，混 合均匀。
[0017] 作为本发明进一步改进，所述消化液包括0.25%WT的膜酶和0.02%WT的邸TA。
[0018] 作为本发明进一步改进，所述酶溶液包括50-200IU/mL的I型胶原酶、10-40IU/mL 的DNA酶I、1 -4IU/mL的分散酶和400-1000 lU/mL的透明质酸酶。
[0019] 作为本发明进一步改进，所述冻存液包括20-65mL/L的二甲基亚讽、3-30g/L的径 乙基淀粉、30-130g/L的人血白蛋白、5-40g/L的右旋糖酢、4-6.5g/L的氯化钢、3.5-6g/L的 葡萄糖酸钢、3-4.5g/L的醋酸钢、0.2-0.6g/L的氯化钟和0.1-0.5g/L的氯化儀。
[0020] 本发明将胎盘造血干细胞与间充质干细胞混合，制成混合的干细胞制剂。由于 VEGF是一种促进血管再生的重要因子，在间充质干细胞液中引入胎盘造血干细胞能很好的 激活VEGF信号通路，局部注射本发明混合干细胞制剂后，可W提高外周血及局部VEG阿农度， 促进糖尿病足溃瘍的愈合。而，单纯地注射间充质干细胞后，效果不明显。因而，本发明制成 混合的干细胞制剂能更好地促进糖尿病足创面的愈合。
【具体实施方式】
[0021] 为了使本领域相关技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合本发明实 施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式 仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。
[0022] 本发明提供一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂，将胎盘造血干细胞与间充质干 细胞混合在一起，可通过局部注射该混合干细胞制剂的方法来治疗糖尿病足，疗效非常好。
[0023] 本发明混合干细胞制剂包括胎盘造血干细胞和间充质干细胞，胎盘造血干细胞的 浓度为1-2 X IO5个/ml，所述间充质干细胞的浓度为5-10 X IO6个/ml。在本发明的实施方式 中，所述间充质干细胞为厮带间充质干细胞。本发明在间充质干细胞液中引入胎盘造血干 细胞能很好地激活VEGF(vascular endothelial growth factor,血管内皮生长因子）的信 号通路，局部注射本发明混合的干细胞制剂后，提高外周血及局部VEGF浓度，促进糖尿病足 溃瘍的愈合。而，单纯地注射间充质干细胞后，效果不明显。
[0024] 本发明治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，包括W下步骤：
[0025] SI:制备间充质干细胞的步骤，其包括：
[00%] Sll:获得人厮带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用；
[0027] Sl2:将组织块接种于培养瓶中，加入MSCs生长培养液，置入37°C、含有体积分数为 5 %的C02的细胞培养箱中培养；
[00%] S13:当细胞贴壁生长达70% W上汇合后，弃组织块，利用消化液消化，使消化液覆 盖所有细胞表面，见细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化，制成单细胞悬液；
[00巧]S14:将单细胞悬液置于离屯、管中，离屯、，用MSCs生长培养液重悬细胞，按1:2~1:3 的比例传代培养，传至第=代后，得间充质干细胞细胞液；
[0030] S2:制备胎盘造血干细胞的步骤，其包括：
[0031 ] S21:获得胎盘组织，用酶溶液消化，得到消化产物，去除所述消化产物中的组织残 渣，得到酶解液；
[0032] S22:将所述酶解液与径乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，再得到上层 的有核细胞悬液，将所述有核细胞悬液与冻存液混合得到胎盘造血干细胞液；
[0033] S3:配制治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的步骤，包括：
[0034] 将所述胎盘造血干细胞液添加到所述间充质干细胞细胞液中，边添加，边混合，混 合均匀。即得到本发明治疗糖尿病足的混合干细胞制剂。
[0035] 下面结合具体的实施例对本发明进一步详细说明
[0036] 1、获取间充质干细胞
[0037] 在本实施中，间充质干细胞来源于人的厮带。从手术台取正常足月健康婴儿厮带， 浸泡于生理盐水(每毫升含2抓肝素钢）中，超净台内取出厮带，W含有1%WT的青链霉素的 PBS液充分冲洗厮带外表面，20ml注射器冲洗动、静脉管腔后，将其置于1%WT青链霉素的 PBS液中10分钟，取出后将其剪切成Imm X Imm X Imm大小的组织块，在剪切时向所操作的组 织上滴加1-2滴培养液，W保持组织湿润。将组织块接种于培养瓶中，均匀铺放，上置盖玻 片，待化后，再加入MSCs生长培养液，置入37°C、含有体积分数为5%的C02的细胞培养箱中 培养，在倒置相差显微镜下观察细胞自组织块周边游出、贴壁后，每隔3d更换培养液。
[003引当