细胞贴壁生长达70% W上汇合后，弃组织块，Wo. 25%WT的膜酶和0.02%WT的 抓TA消化，轻轻摇动培养瓶，使消化液覆盖所有细胞表面，倒置显微镜下观察，见细胞间隙 增大，胞质回缩，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液。将该单细胞悬液置 于离屯、管中，l0(K)rpm，离屯、3min，用MSCs生长培养液重悬细胞，按1:3的比例传代培养，每3d 换液，倒置相差显微镜下观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传 代扩增。传至第=代后，剩下形态较为单一的细胞，即得到厮带间充质干细胞细胞液。
[0039] 2、胎盘造血干细胞：
[0040] 用酶溶液消化胎盘组织，得到消化产物去除所述消化产物中的组织残渣，得到酶 解液;将所述酶解液与径乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，得到上层的有核细 胞悬液；将所述有核细胞悬液与冻存液混合即得到胎盘造血干细胞液。上述酶溶液包括 lOOIU/mL的I型胶原酶、30IU/mL的DNA酶I、3IU/mL的分散酶和600IU/mL的透明质酸酶。上述 冻存液包括45mL/L的二甲基亚讽、20g/L的径乙基淀粉、80g/L的人血白蛋白、25g/L的右旋 糖酢、5g/L的氯化钢、4.5g/L的葡萄糖酸钢、4g/L的醋酸钢、0.4g/L的氯化钟和0.3g/L的氯 化儀。
[0041 ] 3、混合
[0042] 将上述胎盘造血干细胞添液加到上述厮带间充质干细胞细胞液中，边添加，边混 合，并控制胎盘造血干细胞的浓度为1.5 X IO5个/ml，厮带间充质干细胞的浓度为8 X IO6个/ ml,混合均匀。
[0043] 为进一步验证本发明提供的混合干细胞制剂治疗糖尿病足的显著效果，通过W下 实验及实验数据进行具体说明。
[0044] 验证实验：
[0045] 实验动物分组和模型构建：
[0046] Wi S tar大鼠60只，体质量(200 ± 15) g，实验过程中对动物的处置符合中华人民共 和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。随机数字表法分为 对照组（即注射单纯的间充质干细胞）、实验组（即注射本发明混合干细胞制剂），每组30只， 高脂饲料喂养。2个月后，禁食16h后腹腔注射由巧樣酸-巧樣酸钢缓冲液(0.1mol/L，pH4.4) 配制的45mg/kg的链脈佐菌素，第7天测空腹血糖〉16mmol/L者入选实验模型，足背部切除 3mm X 7mm矩形区域全层皮肤，建立糖尿病足溃瘍模型，并计为第O天。于创面形成后第I天对 照页和实验组分别于大鼠创缘肉膜层多点注射细胞〇.4mL。
[0047] 利用ELISA测定外周血VEGF蛋白水平(取两个组的平均值）：细胞注射后第1，4,8天 经内两个组大鼠赃静脉取外周血1.5mL，5000r/min离屯、4min后，取I(K)化血浆，进行化ISA检 ，取两个组的VEGF蛋白水平测定的平均值，其结果如下表：
[0049] 通过VEGF的测定可判定糖尿病足溃瘍存在VEGF分泌不足，从上表的数值可W看 出：实验组的大鼠局部注射本发明混合干细胞制剂后提高外周血及局部VEGF浓度，可W促 进糖尿病足溃瘍的加速愈合;但对照页注射单纯的间充质干细胞后，VEGF浓度提高不明显。 VEGF是一种促进血管再生的重要因子，在创面的愈合中发挥着重要的作用，VEGF的缺乏可 能对糖尿病足溃瘍的难愈性发挥着重要的作用，注射本发明混合干细胞制剂后，外周血的 VEGF的浓度增高，本发明混合干细胞制剂通过信号转导作用调动机体产生VEGF，而同时具 有旁分泌作用完成自身定居转化过程参与组织修复，在此过程中相对快速激活周围局部 VEGF的分泌达到一定的高浓度，从而促进糖尿病足溃瘍的加速愈合。
[0050] W上仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解 为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本 发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保护范围。因此，本 发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂，其特征在于，包括胎盘造血干细胞和间充质 干细胞，所述胎盘造血干细胞的浓度为1-2X105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为5-10X 106 个/ml。2. 根据权利要求1所述的治疗糖尿病足的混合干细胞制剂，其特征在于，所述间充质干 细胞是脐带间充质干细胞。3. -种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1:制备间充质干细胞的步骤，其包括： S11:获得人脐带组织，经过消毒、冲洗、剪碎成组织块之后，备用； S12:将组织块接种于培养瓶中，加入MSCs生长培养液，置入37°C、含有体积分数为5 % 的C02的细胞培养箱中培养； S13:当细胞贴壁生长达70%以上汇合后，弃组织块，利用消化液消化，使消化液覆盖所 有细胞表面，见细胞间隙增大，胞质回缩，用血清终止消化，制成单细胞悬液； S14:将单细胞悬液置于离心管中，离心，用MSCs生长培养液重悬细胞，按1:2~1:3的比 例传代培养，传至第三代后，得间充质干细胞细胞液； S2:制备胎盘造血干细胞的步骤，其包括： S21:获得胎盘组织，用酶溶液消化，得到消化产物，去除所述消化产物中的组织残渣， 得到酶解液； S22:将所述酶解液与羟乙基淀粉溶液混合并使混合得到的物料分层，再得到上层的有 核细胞悬液，将所述有核细胞悬液与冻存液混合得到胎盘造血干细胞液； S3:配制治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的步骤，包括： 将所述胎盘造血干细胞液添加到所述间充质干细胞细胞液中，边添加，边混合，混合均 匀。4. 根据权利要求3所述的治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所 述消化液包括〇. 25%WT的胰酶和0.02%WT的EDTA。5. 根据权利要求3所述的治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所 述酶溶液包括50-200IU/mL的I型胶原酶、10-40IU/mL的DNA酶I、l-4IU/mL的分散酶和400-1000IU/mL的透明质酸酶。6. 根据权利要求3所述的治疗糖尿病足的混合干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所 述冻存液包括20-65mlVL的二甲基亚砜、3-30g/L的羟乙基淀粉、30-130g/L的人血白蛋白、 5_40g/L的右旋糖酐、4-6.5g/L的氯化钠、3.5-6g/L的葡萄糖酸钠、3-4.5g/L的醋酸钠、0.2-〇. 6g/L的氯化钾和0.1-0.5g/L的氯化镁。
【专利摘要】本发明提出了一种治疗糖尿病足的混合干细胞制剂及其制备方法，该混合干细胞制剂包括胎盘造血干细胞和间充质干细胞，所述胎盘造血干细胞的浓度为1-2×105个/ml，所述间充质干细胞的浓度为5-10×106个/ml。本发明将胎盘造血干细胞与间充质干细胞混合，制成混合的干细胞制剂。由于VEGF是一种促进血管再生的重要因子，在间充质干细胞液中引入胎盘造血干细胞能很好的激活VEGF信号通路，局部注射本发明混合干细胞制剂后，可以提高外周血及局部VEGF浓度，促进糖尿病足溃疡的愈合。而，单纯地注射间充质干细胞后，效果不明显。
【IPC分类】A61P3/10, A61P17/02, C12N5/073, C12N5/0775, A61P9/14, A61K35/28, C12N5/0789
【公开号】CN105477017
【申请号】CN201510882029
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月3日