专利名称：一种经过密码子优化的脂肪酸脱氢酶基因序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种脂肪酸脱氢酶(以下简称!^ )基因序列及其应用，尤其是涉及一种促使细胞内n-6脂肪酸向n-3脂肪酸转化的!^atI基因序列及其应用。
背景技术：
在现有技术中，n-6系列的亚油酸和n-3系列的亚麻酸都是多不饱和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acids，以下简称PUFAs)是哺乳动物体内的必需脂肪酸，其具有广泛的生物学功能；他们参与细胞膜的构建而且作为许多细胞应答过程中的信号分子，它对人类及其他哺乳动物的正常发育起着至关重要的作用，在人体内维持一定量的n-3PUFAs 可以很好的预防心血管疾病、神经退行性疾病等；因此随着人们对n-3PUFAs认识的增加对富含这一成分的食品需求也大大增加；但是，人类食谱中的n-3PUFAs含量又在不断下降， 取而代之的是越来越多的n-6PUFAs ；而人体又不能有效将n_6PUFAs转化为n-3PUFAs，这样就使得n-6与n-3PUFAs的比值严重失调，甚至已经危害到了人类的健康；而对于人体，无论 n-3PUFAs的过低还是n-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。n-3!^itl基因是合成n-3PUFAs的重要基因，他们利用n-6PUFAs做为底物在脂肪酸碳链甲基端第三个碳催化生成一个不饱和键，从而合成相应的n-3PUFAs ；因此，为了改善动物体内n-3PUFAs的含量，除了摄取含有较多n_3PUFAs的食物之外，还可以利用n_3FatI 基因以n-6PUFAs为底物来自身合成，进而从根本上改善动物体内n_6与n-3PUFAs比例失调问题；通过转基因技术，制备带有n-3!^tl基因的畜禽动物，可以获得自身合成n-3PUFAs 的畜禽，进而高效、低廉地生产出含有n-3PUFAs的蛋奶肉制品；但是由于i^atl基因仅存在于真菌、植物和低等的动物如线虫中，这些低等生物跟高等生物的密码子偏好性不同，不利于直接表达；通过优化线虫密码子，合成n-3!^tl基因，并通过细胞转染获得稳定表达该基因的双基因转染细胞株(CHO)，为培育富含n-3多不饱和脂肪酸的动物新品种提供有效途径等方面的研究已成为业界正在追求的技术内容。
发明内容
本发明克服了现有技术中存在的缺点；一个目的是提供一种促使细胞内n-6脂肪酸向n-3脂肪酸转化的!^atI基因序列；本发明另一个目的是提供一种促使细胞内n_6脂肪酸向n-3脂肪酸转化的!^atI基因序列的真核表达载体；本发明再一个目的是提供一种稳定表达促使细胞内n-6脂肪酸向n-3脂肪酸转化的!^atI基因序列的细胞株。为了实现上述第一个发明目的，本发明根据GenBank系列数据库中的线虫序列 (ACCESSION NM_001028389)，采用化学合成法合成针对哺乳动物进行过密码子优化的!^itI 基因序列，并在起始密码子ATG之前加上一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含有利于基因表达的Kozak序列，共12Mbp ；其完整的碱基序列如下GTTGCGGCCGCCACCATGGTCGCTCACTCCAGCGAAGGACTGTCCGCTACCGCTCCAGTGACAGGAG
GAGACGTGCTGGTCGATGCCAGAGCTAGCCTCGAGGAAAAAGAGGCCCCTCGAGATGTCAACGCCAATACCAAGCAGGCTACCACAGAGGAACCACGCATCCAGCTGCCTACAGTGGACGCTTTCCGACGAGCTATTCCAGCTCACTGTTTTGAACGAGATCTGGTCAAGTCCATCCGCTACCTCGTGCAGGACTTCGCCGCTCTGACCATTCTCTATTTTGCCCTGCCAGCTTTCGAGTACTTTGGACTGTTCGGGTATCTCGTCTGGA
ACATCTTCATGGGCGTGTTCGGATTTGCCCTGTTTGTGGTCGGACACGACTGCCTCCATGGGTCCTTCAGCGACAACCAGAATCTGAACGATTTCATCGGCCACATTGCCTTTTCCCCTCTCTTCAGCCCTTACTTTCCCTGGCAGAAATCCCACAAGCTGCACCATGCCTTCACCAGTCATATCGACAAAGATCCCGGCCATGTGTGGATTCAGGACAAAGATTGGGAGGCCATGCCATCTTGGAAGCGGTGGTTCAACCCCATCCCATTTTCAGGATGGCTGAAGTGGTTCCCCGTGTACACACTCTTCGGGTTTTGCGACGGCTCCCACTTCTGGCCATACTCTTCACTGTTTGTCAGGAATTCTGAGAGAGTGCAGTGTGTCATCTCAGGGATTTGCTGTTGCGTGTGCGCCTACATCGCTCTGACCATTGCCGGCTCTTATTCAAACTGGTTCTGGTACTATTGGGTGCCCCTGTCTTTCTTTGGGCTGATGCTCGTGATCGTCACATACCTCCAGCACGTGGACGATGTCGCCGAGGTGTATGAAGCTGACGAGTGGAGCTTCGTGCGGGGACAGACCCAGACAATCGACAGGTACTATGGGCTGGGCCTCGATACCACAATGCACCATATTACCGACGGGCATGTGGCCCACCATTTCTTTAACAAAATCCCTCACTACCATCTGATTGAAGCTACCGAGGGCGTCAAGAAAGTGCTGGAGCCCCTCTCCGATACACAGTACGGATATAAGAGCCAAGTGAATTACGACTTCTTTGCCAGGTTTCTGTGGTTCAACTACAAACTGGACTATCTCGTGCACAAGACCGCTGGAATCATGCAGTTCCGCACCACACTGGAGGAAAAGGCCAAAGCTAAGTAA。为了实现本发明第二个目的，本发明根据GenBank中的的线虫序列 (ACCESSI0NNM_001028389)，采用化学合成法合成针对哺乳动物进行过密码子优化的!^atI 基因的编码区序列，并在起始密码子ATG之前加上了一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含了有利于基因表达的Kozak序列，并在其上下游分别引入了 HindIILKpnI限制性内切酶的酶切位点及相应的保护碱基；合成的序列连接到克隆载体PUC57载体中，获得重组质粒 pUC57-FatI，将pUC57_FatI和真核表达载体pCDNA3. 1 (+)用限制性内切酶HindIII、KpnI 进行双酶切，胶回收相应的片段；将htl基因连接入真核表达载体ρ⑶NA3. 1(+)中获得重组质粒PCDNA3. 1 (+) -FatI，得到促使细胞内n_6脂肪酸向n_3脂肪酸转化的!^atI基因序列的真核表达载体。为了实现本发明第三个目的，本发明将涉及的含有n-3FatI基因的真核表达载体，转染到CHO细胞中，经过阳性克隆筛选得到能够稳定表达n-3!^tl基因的细胞株；经过对阳性细胞株mRNA表达水平检测其电泳结果如图7所示阳性细胞株有清晰的1. 左右的条带，而阴性对照无相应条带，n-3FatI基因能够在细胞株中稳定的表达；经过对细胞中 n-3/n-6不饱和脂肪酸值的检测结果如表1所示，表明含有转染n-3!^tl基因的真核表达载体的细胞株中n-3/n-6值比未转染的细胞株中η-3/η_6值提高8. 47%，说明n-3i^itl基因成功稳定的表达并且改良细胞中n-3/n-6不饱和脂肪酸值。本发明涉及的经过密码子优化的n-3!^tl基因，构建促使细胞内n-6脂肪酸向n_3 脂肪酸转化的i^atl基因序列的真核表达载体以及将载体转染到CHO细胞中，经过阳性克隆筛选得到的能够稳定表达n-3htl基因的细胞株，可以应用于培育富含n-3多不饱和脂肪酸的动物新品种。本发明与现有技术相比有益效果是采用密码子优化方法对!^atI基因序列进行优化，得到促使细胞内n-6脂肪酸向n-3脂肪酸转化的!^atI基因序列，优化的!^atI基因序列更容易在真核细胞中得到表达；构建含有该基因序列的真核表达载体并将载体转染到 CHO细胞中，经过阳性克隆筛选得到的能够稳定表达n-3!^tl基因的细胞株；本发明涉及的 n-3FatI基因能稳定表达并且改良细胞中n-3/n-6不饱和脂肪酸值，可以应用于培育富含 n-3PUFAs的动物新品种，获得能自身合成n-3PUFAs的畜禽，进而高效、低廉地生产出含有 n-3PUFAs的蛋奶肉制品，解决人们食谱中n_6与n-3PUFAs的比值失调的问题；本发明的工艺过程简单，经密码子优化的基因质量优良而且更容易在真核细胞中得到表达，应用性好， 负面影响小。
图1为!^atI基因序列密码子优化前后序列比对图。图2为经过密码子优化的!^atI基因序列的显示密码子优化图谱。图3为经过密码子优化的!^atI基因序列显示构建的真核表达载体。图4为经过密码子优化的!^atI和pEGFP_Nl转染后24h的细胞。图5为经过密码子优化的!^atI基因组DNAPCR检测阳性克隆。图6为本发明涉及的Southern Blot检测1 tl基因的表达。图7为本发明涉及的阳性克隆!^atI的mRNA表达水平及对照。
具体实施例方式下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步说明。实施例1 本实施例对稳定表达促使细胞内n-6脂肪酸向n_3脂肪酸转化的!^atI 基因序列的细胞株培养，按下列步骤进行1. ICHO细胞培养CH0细胞系常规复苏后，将含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/L硫酸链霉素的DMEM培养基(本发明无特别说明，均用此种培养基)在37°C，5% C02环境的培养箱中培养，细胞融合度85%左右的时候用于细胞转染。1. 2载体构建根据GenBank中的的线虫序列(ACCESSION NM_001028389)，采用化学合成法合成针对哺乳动物进行过密码子优化的i^atl基因序列，并在起始密码子 ATG之前加上一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含有利于基因表达的Kozak序列，并在其上下游分别引入了 Hindlll、KpnI限制性内切酶的酶切位点及相应的保护碱基；合成的序列连接到克隆载体PUC57载体中，获得重组质粒pUC57-FatI ；将pUC57_FatI和真核表达载体P⑶NA3. 1 (+)用限制性内切酶Hindlll、KpnI进行双酶切；胶回收相应的片段， 将!^atI基因连接入真核表达载体pCDNA3. 1 (+)中获得重组质粒pCDNA3. 1 (+)-FatI ；由于 PCDNA3. 1 (+) -FatI上具有2个Mil酶切位点，将质粒pCDNA3. 1 (+) -FatI用Mil酶切后胶回收含有I^atl的相对大的片段，以备转染。1. 3细胞转染在细胞汇合度达到85%左右时，进行细胞转染；转染的步骤如下 用胰酶消化收集细胞，并用PBS冲洗2次，以彻底去掉胰酶，用无抗生素的细胞培养基稀释细胞，加入经过酶切回收的带有i^atl基因的DNA，混合后冰浴lOmin，用电穿孔仪ECM830 进行电转染；所用的电击条件为:M0DE =HV ；Voltage :600v，P. length :400us，Pulses :2 ； Interval :800ms ；取出电击杯，冰浴IOmin后，将细胞转移至培养皿中在37°C，5% C02环境的培养箱中培养；同时设阴性对照(未加入质粒)和阳性对照(转入线性化的PEGFP-N1)， 转染成功后，转入pEGFP-Nl的阳性对照中，绿色荧光蛋白会在CMV启动子的驱动下发出绿色荧光。1.4阳性克隆筛选细胞培养至对小时后加G418，进行抗性筛选，由于转入的基因带有新霉素抗性基因(Neo)，因此转入了该外源基因的细胞就会对G418产生抗性，而正常细胞在G418筛选压力下死亡；经过11天的培养筛选，培养皿中开始出现阳性克隆，将阳性克隆挑出后培养于96孔板中，然后逐级放大到M孔板和6孔板中，得到稳定表达促使细胞内n-6脂肪酸向n-3脂肪酸转化的!^atI基因序列的细胞株。实施例2 本实施例对细胞株检测及其脂肪酸分析，按下列步骤进行2. 1基因组PCR初步检测阳性细胞克隆放大培养过程中留在原培养板上的细胞继续培养，待细胞铺满培养板时用胰酶消化收集细胞，基因组抽提试剂盒提取细胞的基因组，RT-PCR初步检测外源基因是否进入细胞，所用引物为i^itI-F:5' -CAT GGT CGC TCA CTC CAG C-3'，FatI-R :5' -GGT ACC TTA CTT AGC TTT GGC CTT TTC-3‘；反应条件 940C 5min，94°C lmin,60°C 30sec，72°C Imin ；30 个循环，72°C 5min ；琼脂糖凝胶电泳检测阳性的细胞株用于下一步实验。2. 2Southern Blot 检测将 1. 2 中构建好的载体 pCDNA3. 1 (+) -FatI 用 HindIII, KpnI限制性内切酶的酶切后切胶回收!^atI片段作为模板，1 μ g模板加灭菌双蒸水到 16μ 1，沸水浴变性lOmin，迅速在冰上冷却；加入4μ 1 DIG-High I^rime，37 °C孵育lh， 65°C IOmin终止反应获得地高辛标记的探针；细胞株基因组酶切后电泳转膜，经过预杂交、 杂交、漂洗步骤后显色。2. 3FatI的mRNA水平表达检测基因组PCR检测为阳性的一个细胞株提取RNA，反转录后PCR检测细胞株中!^atI的mRNA表达水平；所用引物为!^atI-F 5' -CAT GGT CGC TCACTC CAG C-3'，FatI-R :5' -GGT ACC TTA CTT AGC TTT GGC CTT TTC-3‘；反应条件 940C 5min，94°C lmin,60°C 30sec，72°C Imin ；30 个循环，72°C 5min ；未转染的细胞作为阴性对照，做同样处理。2. 4转染CHO细胞系后脂肪酸分析DNA处理及转染、阳性筛选和克隆放大步骤同前；转染线性化PEGFp-Nl的CHO细胞为阳性对照，未转染外源基因的CHO为阴性对照；阳性克隆放大到IOcm细胞培养皿上后，添加10 μ mol/L的亚油酸和花生四烯酸进行培养，细胞完全长满后，用胰酶消化收集细胞；细胞用去离子水洗涤，加入2. 5% H2SO4/甲醇溶液lmL， 80°C加热90min，冷却到室温后加入1. 5mL 0.9% NaCl溶液和ImL正己烷，震动、低速离心(2000-3000r/min)将脂肪酸提取到有机相；吸取上层清液经液氮吹干后用于气相色谱 (GC_MS)分析；转pEGFP-Nl的CHO细胞作为对照做相同处理。实施例3 本实施例对优化结果进行分析如下3. 1密码子优化、基因合成及表达载体的构建根据哺乳动物密码子偏好性，对线虫的htl基因序列进行了密码子优化；优化后的序列CAI由0. 65提高到0. 81 (附图2)， 通常认为CAI大于0. 9时非常有利于基因表达，并在起始密码子ATG之前加上了一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含了有利于基因表达的Kozak序列，并在其上下游分别引入了 Hindlll，KpnI限制性内切酶的酶切位点及相应的保护碱基；优化过的序列与原始序列比对如附图1，优化过的序列部分用红字表示；优化后的序列通过化学合成法合成，并连接到克隆载体PUC57载体中，获得重组质粒pUC57-FatI ；将pUC57_FatI和真核表达载体 PCDNA3. 1(+)分别用限制性内切酶HindIILKpnI进行双酶切；胶回收相应的片段，将!^atI 基因连接入将连接入真核表达载体PCDNA3. 1(+)中获得重组质粒？0)嫩3.1(+)呼站1(如附图3)。3. 2细胞转染和阳性克隆筛选将真核表达载体P⑶NA3. 1 (+)-FatI用MlI酶切后胶回收相对大的片段对CHO细胞系进行细胞转染；只转入pEGFP-m的阳性对照80% (蓝光激发下的细胞数(附图4-B)/白光下细胞数(附图4-A))以上的细胞都发出绿色荧光， 表明转染效率较高 ’转染48小时后加入G418进行抗性筛选，筛选到第11天开始出现细胞克隆，对这些克隆增值由96孔板逐级放大培养到6孔板，获得阳性克隆细胞群。3. 3基因组PCR初步检测阳性细胞及Southern Blot分析对获得的细胞克隆提取基因组进行RT-PCR初步检测，电泳结果附图5所示，阳性细胞具有清晰的1. 2K左右的条带，所用分子量Marker为DL2000(附图幻；Southern Blot分析进一步表明所得细胞株为阳性(附图6)。3. 4阳性细胞株mRNA表达水平检测基因组PCR检测为阳性的细胞提取RNA，反转录后PCR，电泳结果如附图7所示阳性细胞株有清晰的1.业左右的条带，而阴性对照无相应条带，所用分子量Marker为DL2000。3. 5脂肪酸组成分析为了证明该!^atI基因序列在细胞内具有脂肪酸去饱和酶的功能，检测了转染ρ⑶NA3. I-FatI的CHO细胞和转染pEGFP-Nl的CHO细胞(对照)中脂肪酸含量，检测结果如表1所示；表1 CN 102533807 A
权利要求
1.一种经过密码子优化的脂肪酸脱氢酶基因序列，其特征在于具有序列表中序列1 所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的经过密码子优化的脂肪酸脱氢酶基因序列，其特征在于将该基因构建促使细胞内n-6脂肪酸向n-3脂肪酸转化的真核表达载体。
3.根据权利要求1所述的经过密码子优化的脂肪酸脱氢酶基因序列，其特征在于将该基因培养促使细胞内n-6脂肪酸向n-3脂肪酸转化的细胞株。
4.根据权利要求1所述的经过密码子优化的脂肪酸脱氢酶基因序列，其特征在于应用于培育富含n-3多不饱和脂肪酸的动物新品种。
全文摘要
本发明涉及一种经过密码子优化的脂肪酸脱氢酶(以下称FatI)基因序列及应用；通过构建真核表达载体，并转染CHO细胞，G418筛选后获得稳定表达FatI的细胞株；经过基因组PCR及Southern Blot确定外源基因整合入基因组，且该外源基因能在此细胞内转录为mRNA；成功转染后的CHO细胞系，其细胞n-3/n-6值比对照细胞提高8.47％，说明该FatI基因序列能促进细胞内n-6脂肪酸向n-3脂肪酸的转化。
文档编号C12N15/85GK102533807SQ20121000496
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者孙晓凤, 李兰, 李秀娟, 沈伟 申请人:青岛农业大学