专利名称：一种淋球菌免疫抑制突变基因ΔopaI及其突变方法
技术领域：
本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种淋球菌免疫抑制突变基因及突变方法。
背景技术：
淋球菌的天然宿主是人类，感染后导致性传播疾病淋病，可引起一系列病变，包括局部感染(如尿道炎、副睾炎、宫颈炎，输卵管炎等)和全身播散性感染。输卵管、盆腔等部位的病变可导致不孕症或宫外孕等严重后遗症。淋病患者还大大增加了艾滋病的发病机会。淋病发病率高，全球每年新发病例约6200万。越来越严重的淋球菌耐药性现象给淋病治疗带来了越来越大的困难。因此，研制有效的疫苗是淋病防制工作中的重点方向之一。淋球菌疫苗研制历经艰难，二十世纪七十年代全细胞疫苗的人体试验遭遇失败，研究的重点开始转向亚单位疫苗和基因疫苗等新型疫苗。菌毛是第一个被纯化的淋球菌亚单位成分，尽管纯化后的菌毛能够刺激机体产生较高滴度的抗体，但是由于菌毛表面一些表位变异程度高，这些抗体并不具有显著的免疫保护作用。同样由于高度变异的原因，另一类重要粘附因子Opa蛋白在淋病疫苗研制中也受到了限制。孔蛋白是持续表达在淋球菌表面的I型外膜蛋白，具有免疫原性强、抗原相对保守等特点。90年代初期曾用覆盖多数血清型的porin疫苗进行动物免疫实验，效果并不十分理想。随着基因工程技术的迅速发展，用基因工程技术表达淋球菌抗原成为研制淋病疫苗的重要方向。人们已经成功表达了多种淋球菌抗原，如Porin、NspA, TbpA, TbpB, LOS等，用蛋白质相关技术进行纯化和复性，配合一定佐剂免疫小鼠，发现在小鼠体内均可以诱导产生特异性保护抗体。从目前的淋球菌疫苗的研究现状分析，只用一种抗原的淋球菌疫苗完全预防淋球菌感染是非常困难的。尽管这种疫苗可以产生一定的保护力，但是，如果这种接种只是使淋球菌感染转为无症状型，感染者因而不就医，那反而会增加淋球菌的传播。因此，含有更多甚至全部淋球菌保护性抗原的疫苗是最理想的淋病疫苗候选。本发明提供了一种突变淋球菌免疫抑制基因的有效方法，突变株不能表达淋球菌免疫抑制基因，解除淋球菌感染后对机体造成的免疫抑制，在淋病新型疫苗研制中具有重要意义。
发明内容
野生型淋球菌中含有免疫抑制基因opal，该基因的产物蛋白OpaI可抑制机体免疫系统产生对病菌的抵抗力。本发明提供了一种突变OA3I的方法及突变基因，从而消除了淋球菌的免疫抑制作用，突变菌株进入机体后可刺激产生正常的免疫应答反应，解决了研制淋球菌全细胞疫苗的瓶颈问题。本发明所述的突变免疫抑制基因—al，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。本发明所述的突变免疫抑制基因Δ0/λ3Ι通过以下方法获得以淋球菌基因组DNA为模板，PCR扩增opal基因上游和下游侧翼区DNA片段，二者之间插入卡那霉素抗性基因Kanr，得到的突变基因—eil。将上述突变基因Aoa3I克隆至自杀质粒pGMB151，携带重组自杀质粒的大肠杆菌与淋球菌共孵育使质粒转入淋球菌细胞。自杀质粒带有的基因可诱导细菌脱去质粒并与野生型OA3I发生同源重组，从而得到OA3I-突变株。本发明所述的突变方法，包括如下步骤
(1)o/7aI基因的克隆以淋球菌基因组DNA为模板，以SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列为引物通过PCR扩增出如SEQ ID NO. 3所示淋球菌c^al基因；
(2)opal上下游两侧侧翼区的扩增；将上述以上述(I)0^3I基因扩增产物与T载体pMD-19连接，并以连接产物为模板，以SEQ ID NO. 4和SEQ ID W). 5为引物，扩增得到包含opal基因两侧侧翼区的一个线性片段SEQ ID NO. 6 ；
(3)以质粒pET-28a(+)为模板，以SEQID NO. 7和SEQ ID NO. 8为引物扩增得到Kanr基因序列SEQ ID NO. 9 ；
(4)OAaI基因的插入突变
将SEQ ID NO. 6 (OA3I基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和opal基因上游侧翼区的线性DNA片段)和SEQ ID NO. 9 (Kanr基因)的DNA片段分别用Mlu I和Xho I双酶切，并回收纯化；二者用T4连接酶进行连接，获得的环形DNA片段中即含有opal基因中间部分被有活性的Kanr基因替换的突变基因Lopal和pMP_19载体骨架，命名为pMD19 Aoa3I，其中AopaI 序列如 SEQ ID NO. 10 所示。目前淋球菌疫苗研制中采用单一抗原或2种抗原组合作为疫苗，含有的抗原数量有限，而淋球菌是一种含有数千种蛋白的细菌，有限数量抗原做成的疫苗很难刺激机体产生足够的免疫保护。本发明提供的方法，因突变株不能表达淋球菌免疫抑制基因，解除了淋球菌抑制机体产生正常免疫反应的能力，因而可以刺激机体产生有利于预防再次感染的抵抗力，为淋病新型疫苗的研制带来新的突破。
图1是.opal基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析
图2.包含opal基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和opal基因上游侧翼区线性DNA片段SEQ ID NO. 6琼脂糖凝胶电泳分析
图3是包含opal基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和opal基因上游侧翼区线性DNA片段SEQ ID NO. 6片段结构示意图
图4是Kanr基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析
图5是淋球菌opal-突变株的PCR筛选，其中1为阴性对照；2_3为AopaI已经进入细胞但尚未取代正常opal基因的菌株，可同时扩增出AopaI和opal基因；4为野生菌株，只能扩增出opal基因；5为突变菌株，只能扩增出AopaI基因；
图6淋球菌opal-突变株的Wfestern blotting鉴定，其中1为野生菌株，仍表达OpaI蛋白；2为突变菌株，不表达OpaI蛋白。
具体实施例方式用PCR将淋球菌基因组中的opal扩增出来，将该基因的中间一段用来自pET28a的Kanr抗性基因替换，得到被插入失活的突变基因Δ ο/^Ι，后者连接到自杀载体中，携带AopaI的重组自杀载体放在大肠杆菌中，大肠杆菌与淋球菌共孵育，使自杀载体转化进野生型淋球菌菌株中，然后筛选和鉴定同源重组后野生OA3I被ΔΟΑ3Ι替换的突变株。实施例一
i-)opal基因的克隆及其两侧侧翼区的扩增I, opal基因的克隆
以淋球菌基因组 DNA 为模板，以 F 5’CGGGATCCGCGGGTGAAGGCAATGGC3’ (.Bam H DCSEQID NO. 1)和 R :5，CCCGGATCCGAAGCGGTAGCGCACGCC3，(.Bam H I) (SEQ ID NO. 2)的序列为引物通过PCR扩增出淋球菌基因组中的O^3I基因(图1)，扩增产物经测序，序列如SEQ IDNO. 3所示。SEQ ID NO. 3中，两端部分为汉警H I识别位点。2. opal上下游两侧侧翼区的扩增
将上述OA3I基因扩增产物与T载体pMD-19T连接，并以连接产物为模板扩增包含opal基因两侧侧翼区的一个线性片段，该线性片段的琼脂糖凝胶电泳分析如图2，该线性片段的的结构示意图如图3。扩增包含OA3I基因两侧侧翼区线性片段的正反向引物分别为
F 5' TGCCTCGAGACGGACACGTCAGACATCAGGT 3，{Xho I) (SEQ ID NO. 4)R 5'GTCACGCGTTTATCTACTCATCGTAAATGGTTGACAAGCC 3' (Mlu I) (SEQ ID NO. 5)，其中TTATCTACTCA为终止序列。扩增得到的包含pMD-19载体和opal基因两侧侧翼区的线性片段的序列如SEQ IDNO. 6所示(前端划线大写字母部分为Xho I识别位点；中间^7-3004bp部分为pMD_19骨架；末端为Μυ I识别位点；其中7-296bp部分为nnp基因下游侧翼区，3005_3377bp部分为基因上游侧翼区)。(二)以质粒pET_28a (+)为模板扩增Kanr基因序列引物序列为
F 5' TCGACGCGTGCTCAGTGGAACGAAAACTC ？, ‘ (. Mlu I) (SEQ ID NO. 7)R :5’ GCGCTCGAGCTTAGAAAAACTCATCGAGCAT 3，(Jho I) (SEQ ID NO. 8)经PCR扩增得到的Kanr基因扩增产物(图4)与pMD_19T连接后，使该载体获得了卡那霉素抗性，表明扩增的DNA片段有活性；产物经测序，序列如SEQ ID NO. 9所示(两端分别为Mlu I和炀ο I识别位点)。(三)opal基因的插入突变
将SEQ ID NO. 6 (OA3I基因下游侧翼区、pMD19载体骨架和opal基因上游侧翼区的线性DNA片段)和SEQ ID NO. 9 (Kanr基因)的DNA片段分别用Mlu I和Xho I双酶切，并回收纯化；二者用T4连接酶进行连接，获得的环形DNA片段中即含有opal基因中间部分被有活性的Kanr基因替换的突变基因Lopal和pMP_19载体骨架，命名为pMD19 Aoa3I，其中AopaI 序列如 SEQ ID NO. 10 所示。将包含突变基因—al的重组载体pMD 19 ΔO^I和自杀载体pGMB151分别用召a H I酶消化，回收纯化后二者用T4连接酶连接，获得的连接产物通过电转化导入宿主大肠杆菌SPTO72 λ pir，携带重组自杀载体的大肠杆菌与野生型淋球菌共孵育。传代过程中大肠杆菌死亡裂解，释放的重组自杀载体进入淋球菌，并与淋球菌野生型opal发生同源重组，使野生OA3I被突变的取代，同时丢失自杀载体框架。表现为突变菌株具有kana抗性，但丧失了载体上的amp及sm抗性。提取传代后分离的淋球菌菌落，提取基因组DNA作模板，用印al引物进行PCR，筛选出只扩增出Sopal的菌株，即为opal-突变株(图5)； 用Wfestern blotting鉴定表明该突变株中Rmp蛋白表达缺失(图6)。
权利要求
1.一种淋球菌突变免疫抑制基因ΔΟ/Λ3Ι，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示。
2.—种淋球菌突变免疫抑制基因Δο/^Ι的突变方法，其特征在于，以淋球菌基因组DNA为模板，PCR扩增opal基因上游和下游侧翼区DNA片段，二者之间插入卡那霉素抗性基因Kanr，得到的突变基因Nopal。
3.根据权利要求2所述的突变方法，其特征在于，步骤如下(1)o/7aI基因的克隆以淋球菌基因组DNA为模板，以SEQID NO. 1和SEQ ID NO. 2的序列为引物通过PCR扩增出如SEQ ID NO. 3所示淋球菌c^al基因；(2)opal上下游两侧侧翼区的扩增；将上述以上述(I)0^3I基因扩增产物与T载体pMD-19连接，并以连接产物为模板，以SEQ ID NO. 4和SEQ ID W). 5为引物，扩增得到包含opal基因两侧侧翼区的一个线性片段SEQ ID NO. 6 ；(3)以质粒pET-28a(+)为模板，以SEQID NO. 7和SEQ ID NO. 8为引物扩增得到Kanr基因序列SEQ ID NO. 9 ；(4)OAaI基因的插入突变将SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 9的DNA片段分别用i/Ζ I禾Π IAo I双酶切，并回收纯化；二者用Τ4连接酶进行连接，获得的环形DNA片段即为突变基因—eil和pMP_19载体骨架，命名为pMD19Ao/7aI，其中Δο^Ι序列如SEQ ID NO. 10所示。
全文摘要
本发明涉及微生物学领域，具体涉及一种淋球菌免疫抑制突变基因及突变方法。所述淋球菌突变免疫抑制基因ΔopaI，它的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。该突变基因通过以下方法获得以淋球菌基因组DNA为模板，PCR扩增opaI基因上游和下游侧翼区DNA片段，二者之间插入卡那霉素抗性基因Kanr，得到的突变基因ΔopaI。
文档编号C12N15/31GK102559706SQ201210004939
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月10日 优先权日2012年1月10日
发明者王小兵 申请人:常州大学