专利名称：引物特异荧光pcr检测egfr突变的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及实时荧光PCR检测试剂盒，特别涉及以引物特异的实时定量荧光PCR技术检 测表皮生长因子受体(Epithelium Growth Factor Recptor， EGFR)常见突变的试剂盒。
背景技术：
由阿斯利康公司研制的吉非替尼(gefitinib，易瑞沙)EGFR酪氨酸激酶抑制剂 (EGFR-TKI)，是一种新型的肿瘤靶向治疗药物，有效地切断表皮生长因子受体向细胞内发出 信号，从而阻碍肿瘤的发生发展。美国、日本和中国学者近几年的研究表明，EGFR的体细胞 突变与NSCLC患者对吉非替尼的敏感性相关。对EGFR突变的肿瘤，Gefitinib的有效率高达 80%-90%，而对没有EGFR突变的肿瘤Gefitinib绝大部分没有效果。EGFR蛋白酪氨酸激酶 功能区由EGFR外显子18-24编码，迄今为止发现的EGFR突变主要发生在酪氨酸激酶域ATP 结合域附近，约90%的突变为外显子19的碱基缺失和21外显子在第858为密码子的碱基替 换突变。目前国内外主要采用基因测序技术检测肿瘤组织中EGFR突变，但是测序方法歩骤繁琐、 周期长、对操作人员要求高，难以在临床上广泛开展。更重要的是由于测序方法本身的限制 灵敏度不高，只能检测出突变基因占总基因15% 20%以上的突变，而肿瘤组织是一个异质 性的组织，EGFR突变又是一种杂合性的突变一即肿瘤细胞的含有EGFR基因的两条DNA中只 有一条发生突变，如果突变细胞在手术切除的肿瘤组织中的比例小于20%，则普通的测序方 法无法检出。实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起來的。与传统 的(终点检测)PCR技术相比，实时定量检测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分 析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。扩增 阻碍突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS),是进行根据PCR扩增 引物与模板的匹配程度不同来区分单一位点突变型与野生型序列间差异的一种PCR方法。该 方法设计扩增引物的3'端的最后一个碱基与突变型碱基对应，相应野生型模板就不能有效扩 增。在这种定性的ARMS基础上，结合TaqMan定量技术，又发展了一种TaqMAMA方法(Taqman mismatch amplification mutation assay),该技术进一步将非特异扩增时引物与模板之间 的引物不匹配程度从3'端的最后一个碱基扩展到了倒数第二个，由此得以成功地辨别单一位 点突变[Warren E. Glaab et al, Mutation Research, 430: 1-12(1999)]。本发明主要就基于以上技术检测EGFR外显子中的常见突变。目前文献中用荧光PCR方法检测EGFR突变基本上都是采用Taqman-MGB探针技术，MGB 可以提高探针的Tm值，使探针设计更短，具有更好的淬灭效果，可以实现单点突变的检测。 但是， 一方面Taqman-MGB探针的设计对模板序列要求严格，难以保证在所有突变位置有合适 的探针序列；另一方面，利用Taqman探针的特异性来检测突变需要针对每一个突变类型设计 一对野生型和突变型探针，如EGFR外显子19的缺失突变据文献报道就有20种以上，如果要 检测其中10种突变就需要20个荧光探针，而T叫man-MGB探针价格昂贵，多重探针的使用会 大大增加检测成本。采用引物特异的荧光PCR方法则可以避免这两方面的问题，引物的设计 更加简单，而且合成成本低廉，对同一位置的不同突变类型可以采用多重引物一个探针进行 检测，既体现了荧光PCR方法简便，灵敏度高和特异性好的优点，有达到了降低检测费用的 目的。发明内容本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因突变的实时荧光PCR试剂盒，可用于临床样品 中EGFR基因常见突变检测。为了完成上述任务，本发明的具体技术路线为(1) 针对EGFR19外显子、21外显子突变位点设计的分别能够与野生型和突变型模板的上 游或下游寡核苷酸引物，分别与EGFR 19外显子、21外显子野生型和突变型保守序列结合的下 游或上游寡核苷酸引物和寡核苷酸探针。(2) 配制适宜于PCR扩增的反应体系。核酸扩增反应体系包括19外显子野生型检测体系 (A)、 19外显子突变型检测体系(B)、 21外显子突变型检测体系(C)，每个检测体系中都包括耐热DNA聚合酶、dNTP、 UNG酶、能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物、能 够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探 针、含有镁离子的缓冲液。(3) 从待测样本中提取DNA，加入前述的三个反应体系中，在荧光定量PCR以上进行PCR检测。(4) 确定样本在野生型检测体系、19外显子突变型检测体系、21外显子突变型检测体系 的Ct值，分别标记为CtA， CtB和CtC，如果CtB - CtA 〈阈值，则该标本EGFR外显子19有缺失 突变，如果CtC - CtA <阈值，则该标本EGFR外显子21有缺失突变，否则为野生型。本发明提供的EGFR基因突变检测试剂盒包括以下组分(1)野生型PCR反应液、19外显子 突变PCR反应液、21外显子突变PCR反应液、酶系、阴性质控品、野生型质控品、19突变型质控品、21突变型质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中酶系包含耐 热DNA聚合酶、dNTPs、 UNG酶和纯化水。根据本发明一个优选的实施方案，其中试剂盒的野生型PCR反应液由PCR缓冲液、19型 正向引物、19野生型反向引物、19型荧光探针和纯化水组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩 增的19型正向引物、19野生型反向引物和19型荧光探针的序列分别是 19型正向引物(EGFR19-F): 5'-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3' (SEQ ID N0:1) 19野生型反向引物(EGFR19-W-R): 5'-GCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCT-3' (SEQ ID N0:2) 19型荧光探针(EGFR19-P) : 5， X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC - Y 3， (SEQIDN0:3)， 其中X/Y表示荧光标记检测体系，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团。根据本发明一个优选的实施方案，其中试剂盒的19外显子突变型PCR反应液由PCR缓冲 液、19型正向引物、19突变型反向引物、19型荧光探针和纯化水组成，19突变型反向引物 又包括19突变型1反向引物、19突变型2反向引物、19突变型3反向引物、19突变型4反 向引物、19突变型5反向引物、19突变型6反向引物、19突变型7反向引物，其特征在于 用于靶多核苷酸扩增的19型正向引物、19突变型反向引物和19型荧光探针的序列分别是 19型正向引物(EGFR19-F): 5' TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC 3' (SEQ ID N0:1) 19突变型1反向引物(EGFR19-Ml-R): 5'-TGGCTTTCGGAGATGTTTTGAT -3' (SEQ ID N0:4)19突变型2反向引物(EGFR19-M2-R) 19突变型3反向引物(EGFR19-M3-R) 19突变型4反向引物(EGFR19-M4-R) 19突变型5反向引物(EGFR19-M5-R) 19突变型6反向引物(EGFR19-M6-R) 19突变型7反向引物(EGFR19-M7-R)5，- TGGCTTTCGGAGATGTCTTGAT -3' (SEQ ID NO:5) 5'- TGTTGGCTTTCGGAGATTTGAT -3' (SEQ ID NO:6) 5' -TTGGCTTTCGGAGGTTCCTT -3' (SEQ ID NO:7) 5'- CCTTGTTGGCTTTCGATTCCT -3' (SEQ ID NO:8) 5'- GTTGGCTTTCGGAACCTTGAT -3' (SEQ ID NO:9) 5'-CTTGTTGGCTTTCGGTTCCTT-3' (SEQ ID NO:10) 19型荧光探针(EGFR19-P): 5， X- TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC - Y 3' (SEQ ID NO: 3)， 其中X/Y表示荧光标记检测体系，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团。根据本发明一个优选的实施方案，其中试剂盒的21外显子突变型PCR反应液由PCR缓冲 液、21型正向引物、21突变型反向引物、21型荧光探针和纯化水组成，其特征在于用于靶 多核苷酸扩增的21型正向引物、21突变型反向引物和21型荧光探针的序列分别是 21型正向引物(EGFR2卜F): 5'-GGAGGACCGTCGCTTGG -3' (SEQ ID NO:ll) 21突变型反向引物(EGFR21-M-R): 5' -GCACCCAGCAGTTTGGCTC -3' (SEQ ID NO: 12) 21型荧光探针(EGFR21-P): 5， X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC - Y 3，(SEQ ID NO: 13)其中x/Y表示荧光标记检测体系，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基te。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒中的阴性质控品为生理盐水，野生型质控品、 19突变型质控品和21突变型质控品分别为测序检测结果为EGFR野生型、外显子19突变型和21 突变型的组织、血液或者细胞系提取的DNA。根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒的待检样品是从各种途径获取的含有肿瘤 DNA的临床样品，包括手术切除的癌组织、肺石蜡包埋的肿瘤组织、穿刺组织、血清和胸水等。根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒所检测的EGFR21外显子突变指的是在EGFR 酪氨酸激酶区的21外显子上的L858R点突变，EGFR19外显子突变指的是在EGFR酪氨酸激酶 区的19外显子出现的常见缺失突变和复合突变等，如Del E746-A750(1) ， Del E746-A750(2)， Del E746-T751， Del L747-T751insP， Del L747-S752insS， Del L747-S752ins VI， Del L747-S752等。根据本发明的一个优选实施方案，其中试剂盒用于判定检测方法有效性的标准是每次 检测都使用野生型PCR反应液、突变型PCR反应液分别检测野生型质控品和突变型质控品， 然后根据两次荧光PCR所得出的ACt值作为质量控制标准，对于野生型质控品ACt值应大于阈值，对于突变型质控品ACt值应小于阈值。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒按照下述标准判定被检序列是野生型或者突变 型1)在At大于阈值的情况下，则该样品即可判定野生型；2)在ACt小于阈值的情况下， 则该样品即可判定为突变型。根据本发明的一个优选实施方案，试剂盒检测结果的阈值可以根据不同标本类型或者不 同的灵敏度及特异性要求设为3—9之间的任意值，优选使用5 — 7之间的任意值。根据本发明的一个优选实施方案，可以根据所扩增序列的特殊情况，例如CG碱基含量高 和/或重复序列多等，在试剂盒的PCR缓冲液中加入甜菜碱、甲酰胺和二甲基亚砜等PCR反应 添加剂。本发明所述的EGFR基因突变检测试剂盒，针对用测序方法步骤繁琐、操作复杂、灵敏度 低的缺点，采用引物特异的荧光PCR方法，分别针对TK区的每个外显子的设计野生型与突变型 引物以及公用探针，利用荧光PCR方法灵敏、特异的优点， 一次PCR操作即可检出多种常见突 变，灵敏度至少可以达到1%。本发明与现有的测序技术相比，具有下列优点(1) 灵敏度更高，可以检出1%的突变模板，高于测序方法20%的灵敏度。(2) 全封闭反应，提取基因组DNA后，直接用PCR检测判断结果，避免了用PCR产物测序 造成的污染；(3) 检测速度快，整个过程仅需4 5小时；(4) 操作简单，可控性强，可进行大批量样品检测，有利于临床操作。
图l显示试剂盒质控品的扩增曲线，其中图1A显示野生型质控品的扩增曲线，图1B显示 EGFR19突变型质控品的扩增曲线，图1C显示EGFR21突变型质控品的扩增曲线。 图2显示试剂盒检测EGFR 19外显子突变型的肺癌组织标本的扩增曲线。 图3显示试剂盒检测EGFR 21外显子突变型的肺癌组织标本的扩增曲线。 图4显示DNA提取失败的肺癌组织标本的扩增曲线，其中图4A中反应液A、 B均无扩增曲线， 说明DNA提取失败。图4B中B管无特异性增长曲线且CtA〉23，说明DNA浓度太低，不能用于PCR 检测具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。 实施例l: EGFR基因突变检测试剂盒及其使用(1) 试剂盒的组成PCR反应液A l管(820 ul /管)、PCR反应液B l管(820 ul /管)、PCR反应液C l管 (820 ul /管)、酶系l管(240 yl /管)、野生型质控品l管(30ul/管)、19突变型标准品1 管(30ul/管)、19突变型标准品1管(30ul/管)，阴性对照l管(30, ul/管)。PCR反应液A 包括19型正向引物、19野生型反向引物、19型荧光探针、PCR缓冲液、纯化水；PCR反应液B 中包括19型正向引物、19突变型l-7反向引物、19型荧光探针、PCR缓冲液、纯化水；PCR反应 液C中包括21型正向引物、21突变型反向引物、21型荧光探针、PCR缓冲液、纯化水；Taq酶系 中包括UNG酶、dNTPs、 Taq酶。(2) 核酸提取取10-50mg新鲜组织或石蜡包埋组织样本或者200-500 n l外周血清，建议使用Qiagen或 者RochDNA提取试剂盒提取基因组DNA，提取过程按照试剂盒说明书进行，最后收集到100ul DNA溶液。(3) PCR检测按比例取相应量的PCR反应液、Taq酶系(PCR反应液A和PCR反应液B 41W/人份+Taq酶系4rt/人份)，充分混匀后按45W/管分装至PCR反应管中，备用。向准备好PCR反应液A和B的PCR反应管中，分别加入处理后的同一个样品的DNA提取液5y 1，并盖紧管盖，3000rpm离心2分钟，8荧光定量PCR上机。PCR循环条件是50°C 3分钟一94度3分钟一(预扩增步骤)94度30秒，60 度45秒，10个循环—94度15秒，60度(读荧光)60秒，进行30个循环；或40。C 30分钟一94 度30秒，60度(读荧光)45秒，进行40个循环(参见附图l)。选择荧光定量PCR仪上FAM/TAMRA 通道进行荧光信号检测。(4) 结果分析根据扩增曲线设置Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(start值可以 在1 10、 st叩值可以在5 20、 Value值可以在0.01 0.2范围选择)，在Analysis菜单下选 择Analyze自动分析结果。(5) 结果判定A. 对野生型质控品，A管有特异性增长曲线，B管和C管无特异性增长曲线(图1A); 对E19突变型质控品，A管和B管有特异性增长曲线，C管无特异性增长曲线(图1B);对 E21突变型质控品，A管和C管有特异性增长曲线，B管无特异性增长曲线。同时满足上述 条件本次实验有效(图1C)。B. 每个样品均要同时进行A、 B和C三管的检测，其Ct值分别记为CtA、 CtB、 Cte。试 剂盒检测的最适DNA浓度范围为10ng/反应-500ng/反应，对应的CX值范围约为12-20 (对 应的循环数为22-30)。C. 对同一样品，如果B管呈特异性增长曲线，iCtB-CtA〈6 (图2)，则该标本EGFR 外显子19有缺失突变，否则为野生型。D. 对同一样品，如果C管呈特异性增长曲线，且Ctr CtA 〈 6 (图3)，则该标本EGFR 外显子21有L858R的点突变，否则为野生型。E. 如果A， B， C管均无特异性增长曲线(参见附图4A)或者B， C管无特异性增长曲线且CtA > 23(循环数为33)(参见附图4B)，则该样本检测无效，需重新检测或者提取DNA。<110>中山大学达安基因股份有限公司<120>弓I物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂盒<140><141><160> 13<210> 1 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220><223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400〉 1tcacaattgccagttaacgtcttc<210>2 <211>23 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 2gctttcggagatgttgcttctct<210> 3 <211>26 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 <400> 3tctc3ccttctgggatccagagtccc<210>4 <211>22 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 4tggctttcggagatgttttgat<210> 5 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 5tggctttcggagatgtcttgat<210>6 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 6tgttggctttcggagatttgat<210> 7 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 7ttggctttcggaggttcctt<210>8 <211>21 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 8ccttgttggctttcgattcct<210>9 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 9gttggctttcggaaccttgat<210> 10 <211>21 <212> DNA <213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 10cttgttggctttcggttcctt<210> 11 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220〉<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 11ggaggaccgtcgcttgg<210> 12 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。 <400> 12gcacccagcagtttggctc<210> 13 <211> 26 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的探针。 <400> 13tctcaccttctgggatccagagtccc
权利要求
1、一种采用引物特异的实时荧光聚合酶链反应技术检测EGFR突变的试剂盒，该试剂盒包括野生型PCR反应液、19外显子突变PCR反应液、21外显子突变PCR反应液、酶系、阴性质控品、野生型质控品、19突变型质控品、21突变型质控品和分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中19外显子突变型PCR反应液由PCR缓冲液、19型正向引物、19突变型反向引物、19型荧光探针和纯化水组成，19突变型反向引物又包括19突变型1反向引物、19突变型2反向引物、19突变型3反向引物、19突变型4反向引物、19突变型5反向引物、19突变型6反向引物、19突变型7反向引物，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的19型正向引物、19突变型反向引物的序列分别是19型正向引物5′-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3′19突变型1反向引物5′-TGGCTTTCGGAGATGTTTTGAT-3′19突变型2反向引物5′-TGGCTTTCGGAGATGTCTTGAT-3′19突变型3反向引物5′-TGTTGGCTTTCGGAGATTTGAT-3′19突变型4反向引物5′-TTGGCTTTCGGAGGTTCCTT-3′19突变型5反向引物5′-CCTTGTTGGCTTTCGATTCCT-3′19突变型6反向引物5′-GTTGGCTTTCGGAACCTTGAT-3′19突变型7反向引物5′-CTTGTTGGCTTTCGGTTCCTT-3′。
2、 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于19外显子突变型PCR反应液中19型荧光探 针的序列为5，X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC—Y 3，，其中X/Y表示荧光标记 检测体系，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团。
3、 根据权利要求1的试剂盒，其中21外显子突变PCR反应液由PCR缓冲液、21型正 向引物、21突变型反向引物、21型荧光探针和纯化水组成，其特征还在于用于靶多核苷酸扩 增的21型正向引物、21突变型反向引物的序列分别是 '21型正向引物5'-GGAGGACCGTCGCTTGG-3'21突变型反向引物5'-GCACCCAGCAGTTTGGCTC-3'。
4、 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于21外显子突变PCR反应液中21型荧光探针 的序列是5'X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC-Y 3，，其中X/Y表示荧光标记检 测体系，分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团。
5、 根据权利要求1的试剂盒，其中野生型PCR反应液由PCR缓冲液、19型正向引物、 19野生型反向引物、19型荧光探针和纯化水组成，其特征还在于用于靶多核苷酸扩增的19 型正向引物、19野生型反向引物的序列分别是19型正向引物5'-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3'19野生型反向引物5'-GCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCT-3'。
6、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于野生型PCR反应液中19型荧光探针的序列 是5， X- TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC -Y 3'，其中X/Y表示荧光标记检测体系， 分别为荧光发生基团和荧光淬灭基团。
7、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于酶系中包含Taq酶、dNTP和UNG酶。
8、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于阴性质控品为生理盐水，野生型质控品、19 突变型质控品和21突变型质控品分别为测序检测结果为EGFR野生型、外显子19突变型和21突 变型的组织、血液或者细胞系提取的DNA。
9、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于每个样品野生型和突变型体系荧光PCR测得的 ACt值是指同一样品在突变型PCR体系扩增的Ct值减去其在野生型PCR体系扩增的Ct值的差值。
全文摘要
本发明提供了一种引物特异荧光PCR检测EGFR突变的试剂盒，特别涉及肿瘤组织以及肿瘤患者外周血清中EGFR基因突变的诊断。本试剂盒针对分子靶向抗癌药物疗效相关的特定突变位点，设计特异性的寡核苷酸引物序列和探针序列，对每一个待测样品，分别用野生型PCR体系和突变型PCR体系进行荧光PCR检测，通过两次反应Ct值差值(ΔCt)的大小，判断样品是否存在EGFR19外显子和21外显子的突变。本发明可对EGFR的特定位点是否存在突变进行检测，可用于分子靶向抗肿瘤新药的疗效预测和肿瘤患者临床个体化用药方案的指导。
文档编号C12Q1/68GK101565742SQ20081002767
公开日2009年10月28日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者何蕴韶, 荃 吴, 明 李, 钢 程 申请人:中山大学达安基因股份有限公司