专利名称：：一种基孔肯雅病毒的检测方法一种基孔肯雅病毒的检测方法
技术领域：
本领域属于分子生物学检测领域，具体涉及一种基L肯雅病毒的检测方法。技术背景基孔肯雅病(Chikungunyadisease)是由基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus)引起的一种急性传染病。该病繊于非洲，第一次已知的暴发是1952年在坦桑尼亚。到了上世纪60年代以后，基孔肯雅病东移东南亚地区。1965年，印度发生大流行，30万人感染。2005年3月，法属留尼旺岛暴发基孔肯雅病，至2006年3月，已有18.6万人受到感染，93人直接或间接因此病而死亡。2006年3月份，基L肯雅病还在印度洋4个岛国(法属留尼旺岛等)全面爆发，30多万人受到感染并患病，法国大陆也有约40人感染了该病毒。"基L肯雅"是斯瓦西里语，意为"弯曲"，因为得病的人出现关节炎症状，最后弯腰曲背。感染者的典型症状是肌肉酸痛，尤其是脚部疼痛，一周后会自愈，但是期间病情较重，严重影响劳动能力。除了关节和肌肉疼痛外，发病者有时还发热，恶心呕吐，可能并aH膜炎而丧命。本病潜伏期3~12天。发热病人常突然起病，寒战、发热，鄉可达39"，伴有头痛、恶心、呕吐、f欲减退，淋巴结肿大。基孔肯雅病毒是单股RNA病毒，属病毒科甲病毒属。1973年首先在印度尼西亚爪哇岛发现。其动物宿主有绿猴、狒狒、黑猩猩、牛、马、猪、兔等，受感染的动物宿主和病人都是传染源。蚊虫是基L肯雅热的主要传播媒介。此病目前没有有效药物可以治疗，灭蚊为最重要的防范工作。随着与世界各国交通往来的日益频繁，该病随时有在我国传播的危险，因此，需要建立一种基孔肯雅的检验方法，并应用于该病毒的监测，可进一步加强防止该病传入我国的监测工作，具有重要的社会效益和经济效益。
发明内容本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种基L肯雅病毒的检测方法。本发明的一种基L肯雅病毒的检测方法包括如下步骤(1)待测样品的前处理；(2)待测样品RNA的提取；(3)设计并合成引物、探针正向引物5，一TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG—3';反向引物5，一CCGTGTTCGGGATCACTGTTA—3';荧光探针5'—F層-TGC^CACA^TGiGA-BHQl—3',下划线斜黑体字母表示锁核酸(LNA)修饰鹏；(4)荧光定量核酸扩增体系在反应管中加入所述步骤(3)的正向引物、所述步骤(3)的反向引物，所述步骤(3)的荧光探针，2XRT-PCR缓冲液，25X逆转录反应酶混合物、步骤(2)得到的RNA和DEPC水，混合均匀；(5)荧光定量核酸扩增将步骤(4)得到的混合溶液置于荧光定量PCR仪上反应；(6)结果判定无Ct值或Ct〉45，且无明显扩增曲线，判定为阴性；Ct《40,并有明显扩增曲线，判定为阳性；40<Ct《45，重做，若重做结果有明显扩增曲线，则为阳性，否则为阴性。所述步骤(1)为用标本研磨液研磨所述的待测样品，至所述的待观,品的组织碎片邻失，得到研磨混合液。所述标本研磨液为Hank's液。Hanks液按如下成分配制KH2P040.06g，Nacl8.0g，NaHC030.35g，KC10.4g，葡萄糖1.0g，Na2HP04.H200.06g，加朋至1000ml。Hanks液可以高压灭菌，分装于化下保存。所述步骤(4)的正向引物的终浓度为500nM.。所述步骤(4)的反向引物的终浓度为lOOOnM.。所述步骤(4)的荧光探针的终浓度为250nM.。所述步骤(5)的扩增条件为在荧光定量仪5(TC，IO分钟进行逆转录反应，95'C热启动10分钟后，进入扩增循环95。C10秒，62。C30秒循环45次。用Lase巧ene软件包中的SeqMan禾旨分析从GenbankJ:获得的37株基孔肯雅病毒核苷酸序列，选择有核苷酸高度保守的非结构蛋白基因，用PrimerExpress2.0软件设计特异性弓嫩和探针设计。本发明建立了一种基L肯雅的检验方法，可应用于该病毒的监测，进一步加强防止该病传入我国的监测工作，具有重要的社会效益和经济效益。图l是最佳引物浓度的确定的实验结果图；图2是最佳探针浓度的确定的实验结果图；图3是荧光RT-PCR标准曲线；图4是重复性测试结果；图5是模拟基L肯雅病毒感染蚊标本实时荧光RT-PCR扩增图；图6是基孔肯雅病毒RNA模板系列稀释RT-PCR扩增产物电泳图。具体实駄式实施例l、引物、探针的设计与合成用Laseigene软件包中的SeqMangJ^分析从Genbank上获得的37株基孔肯雅病毒核苷,列，选择有核苷酸高度保守的非结构蛋白基因，用PrimerExpress2.0软件设计特异性弓l物和探针设计，引物和探针序列见表l。表l引物和Sfr位置'序列(5'to3')备注正向引物CHIK-FP9933-9953TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG反向引物CHIK-RP10003-9983CCGTGTTCGGGATCACTGTTA荧光微C孤-probe9954"9967FAM-TGQgCACAgTG2GA-BHQl弓l物和探针在基孔肯雅病毒基因组上的定位依据的是GenBank序列号为AF490259的毒株序列。实施例2、阳't^照RNA模板的制备及用^lt异性荆古的病毒RNA提取根据基L肯雅病毒(GenBank序列号AF490259)的序列，合成包含荧^RT-PCR检测片段序列的大小为120bp的DNA片段，克隆于T载^(TOPOTAcloningkit)上，用质粒DNA提取试剂盒纯化质丰加NA,测序证实插入片段正确后，随后进行体外逆转录先用NotI酶切质粒使线性化以排除下^RNA产物，接着用MAXIscriptT7Ki战行体外转录，生成目的RNA，然后用TurboDNase进行DNase处理，去除未转录完的质^DNA模板，最后用乙醇沉淀，提^RNA产物，即为阳'龄寸照腿赚，保存于-70。C超低温職待用。5扩增片段大小为71bpLNA探针，下划线斜黑体字母表示LNA條鹏取5pl体外转录模板RNA，稀释250倍，测定OD250值为0.395，根据公式"RNA浓度(ng/pl):OD湖X稀释倍数X40"计换算得到RNA模板原液浓度为790ng/)al，再根据单链RNA的拷贝数的计算公式"拷贝数(copies/nl)-RNA浓度(ng/|al)X6.02X1014/(330X单链RNA碱基数)"计算得到体外转录模板RNA原液的拷贝数约为3.6X1011copies4d。用鄉行方、赚异性评估的14型登革病毒、乙脑病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒等毒株分别由广东省疾病预防控制中心和广东检验检疫局卫生保健中心提供。病毒RNA的提取用QIAampViralRNAKit(德国QIAGEN公司产品)进行，按试剂盒说明书进行。实施例3、扩增,的确定TaqManRT-PCR反应选用的试剂盒为Ag-Path-IDOnestepRT-PCRKit(美国Ambion公司产品)，扩增和检测在全自动荧光定量仪AppliedBiosystems7500FastReal-TimePCRSystems上或StotageneMx3005P实时荧光定量PCR仪等仪器上进4亍。根据试剂盒的推荐和引物、探针的具体特性，仪器上的反应禾骄在退火延伸斜牛选择上试验了3种温度和3种时间逆转录反应条件为50。C10射巾，95'C热启动10^H中后，进入45次二步法PCR循环:95°C10秒4(5眺0/62)。C(30/40/60)秒;各种试剂的加样量分别为每个反应管中含2xRT-PCR缓冲液10^d，20nM的正向引物CHIK-FPM，20nM的反向引物CHK-RP1^1，5pM探针CHK-Probe0.5|jl，25xRT-PCREnzymeMix0.8nl，RNA的量为5pl，用试剂盒提供的水补足到反应总体积^0^1,荧光信号采集设在退火延伸阶段。结果均可见阳性扩增曲线，但考虑到使弓l物扩增有更好的特异性和缩短反应时间，最后确定扩增程序为50。C10分钟，95。C10^H中，95'C10秒—62。C30秒45次循环。实施例4、最佳引度的确定应用以上扩增,，先固定探针终浓度为250nM，正、反向引物浓度在125nM、500nM、1000nM之间选择。按表2所列浓度加上、下游引物终浓度选择^S的引物浓度。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>如图1所示，是最佳引物浓度的确定的实验结果图。以Ct值最小，扩增曲线也最明显的曲线所对应的弓l物浓度为最佳浓度，见图l。最终确定CHIK-FP终浓度500nM，CHDC-RP终浓度为1000nM。实施例5、最佳探针浓度的确定应用以上扩增程序，根据选择好的最佳正、反向引物浓度CHIK-FP终浓度500nM，CHIK-RP终浓度为1000nM，进一步进行探针浓度的确定，在50nM、125nM、250nM、500nM、750nM、1000nM之间选择。图2是最佳探针浓度的确定的实验结果图。以Ct值最小，扩增曲线也最明显的曲线所Xf应的探针浓度为最佳浓度，见图2。图中可见，各种Ct值基本一致，以1000nM终浓度荧光强度最高，同时终浓度250nM也有较高的荧光^S，最终确定CHIK-Probe终浓度250nM。实施例6、灵iC^、检测P艮及标准曲线体外转录基孔肯雅病毒RNA模板用水进行10倍系列稀释G.6X101Q、3.6X109、3.6X108、3.6X107、3.6X106、3.6X105、3.6X104、3,6X103、3,6X102、3.6X101、3.6X100copies/W)，经优化好的反应体系检测，结果最低可检测到3.6X102copies4il稀释度的RNA，最低检测限约为100copies/反应。3.6XIO1、3.6X1(fropies^1稀释度已检测不至!J，线性范围有9个数量级(3.6X1023.6X101Qcopies/nl)，根据此9个稀释度模板RNA的检测结果由软件自动，标准曲线，得标准曲线的f值为0.998，斜率为-3.40，见图3,根賠'E-10",，％效率=(E-l)><100%"计算，PCR扩增效率为96.8%。实施例7、重复性测试体外转录基孔肯雅病毒RNA模板用水稀释成3.6X109、3.6X106、3.6X1()2copies/nl高、中、低三种浓度，每种浓度重复检测4次，用优化好的反应体系进行，结果见图4。由图4可见，三组实验结果均具有很好的重复性，组内扩增曲线Ct值差异很小，其均，标准偏差见表3，表3为实时荧光RT-PCR方法检测基孔肯雅病毒的重复性。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例8、模拟染毒附示本的检测及特异性测试从国境口岸监测采集的蚊子，每份各50只，分别^&加5W、lOpl、50^1和250pl浓度为3.6X101Qcopies4il的基孔肯雅病毒RNA模板，按^}加lml标本研磨M行研磨处理，取140^1研磨自QIAampViralRNAKit提取RNA，按优化好的禾i/^进行检测，结果4份模拟基L肯雅病毒感染蚊子标本均能扩增到基L肯雅病毒核酸，见图5。(1)待测样品的前处理；(2)待测样品RNA的提取；(3)设计并合成引物、探针正向引物5'—TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG—3，；反向引物5'—CCGTGTTCGGGATCACTGTTA—3，；荧光探针5'—FAM-TGCfACA^TGiGA-BHQ1—3',下划线斜黑体字母表示LNA修饰碱基；(4)荧光定量核酸扩增体系每20nl反应体系中加入20^M所述步骤(3)中的正向引物0.5nl，20^M所述步骤(3)中的反向引物lpl，5nM所述歩骤(3)中的荧光探针0.5^1，2XRT-PCR缓冲液10…，25X逆转录反应酶混合物0.8^11、所述步骤(2)得到的RNA5pl、DEPC水2.2pl，混合均匀；(5)荧光定量核酸扩增^K牛在全自动荧光定量仪5(TC，10射中进行逆转录反应，95'C热启动IO辦中后，进入扩增循环95。C10秒，62。C30秒循环45次；(6)结果判定无Ct值或Ct〉45，且无明显扩增曲线，判定为阴性；Ct《40，并有明显扩增曲线，判定为阳性；40<Ct《45，必须重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，贝,断为阳性，否则为阴性。所述的待测样品的前处理为用标本研磨液研磨所述的待测样品，至所述的待测样品的组织碎片消失，得到研磨混合液。所述的标本研磨液为Hank's液。Hanks液按如下成分配制KH^CX0.06g，Nacl8.0g，NaHC030.35g，KC10.4g,葡萄糖1.0g，Na肌恥0.06g，她0至lOOOral。Hanks液可以高压灭菌，分装于4。C下保存。所述的正向引物的最佳终浓度为500nM.。所述的反向弓(物的最佳终浓度为lOOOnM.。所述的荧光探针的最佳终浓度为250nM.。同时，用荧光RT-PCR方法检测与基孔肯雅病毒传播途径类似的14型登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒等蚊媒病毒，结果均为阴性，说明本方法有较好的特异性。为研究荧光定量PCR法与常规PCR在检验基L肯雅病毒的灵敏度，利用相同的模板，即体外转录基孔肯雅病毒RNA模板用7乂进行10倍系列稀释(3.6X10IQ、3.6X109、3.6X108、3.6X107、3.6X106、3.6X105、3.6X104、3.6X103、3.6X102、3.6X10'、3.6X100copies/nl)，用QIAGENOneStepRT-PCRKit进行常规RT-PCR，与荧光RT-PCR反应体系-样，20正向引物CHIK-FP0.5pl，20nM反向引物CHIK-RPM，模板RNA同祥加5mL反应总体积20nl，其余i式剂按试剂盒说明，除了逆转录和热启动时间稍长，反应^f牛也与荧光RT-PCR方法基本一致50。C30分钟，95°C15射中，95°C10秒—62°C30秒45次循环。扩增产物经2.0%琼脂糖在0.5XTBE中电泳80伏40分钟后，利用凝胶成像系统照相，结果见图6，图中可见当RNA浓度为3.6Xl(^copies/ial时已不能得到目的扩增片段，灵鹏约比荧光RT-PCR方齒氐10倍。图6为基L肯雅病毒RNA,系歹iJ稀释RT-PCR扩增产物电泳图，繊RNA浓度(单位copies/l4)分别为1.3.6X10";2.3.6X1010;3.3.6x109;4.3.6x108;5.3.6x107;6.3.6x106;7.3.6x105;8.3.6x104;9.3.6x103;10.3.6X102;M:100bpMarker。权利要求1.一种基孔肯雅病毒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)待测样品的前处理；(2)待测样品RNA的提取；(3)设计并合成引物、探针正向引物5’-TTTAGCCGTAATGAGCRTCGG-3’；反向引物5’-CCGTGTTCGGGATCACTGTTA-3’；荧光探针5’-FAM-TGCid="icf0001"file="S2008100278702C00011.gif"wi="3"he="3"top="94"left="75"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>ACAid="icf0002"file="S2008100278702C00012.gif"wi="3"he="3"top="94"left="85"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>Gid="icf0003"file="S2008100278702C00013.gif"wi="3"he="3"top="94"left="91"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>A-BHQ1-3’，下划线斜黑体字母表示锁核酸修饰碱基；(4)荧光定量核酸扩增体系在反应管中加入所述步骤(3)的正向引物、所述步骤(3)的反向引物，所述步骤(3)的荧光探针，2×RT-PCR缓冲液，25×逆转录反应酶混合物、所述步骤(2)得到的RNA以及DEPC水，混合均匀；(5)荧光定量核酸扩增将所述步骤(4)得到的混合溶液置于荧光定量PCR仪上反应；(6)结果判定无Ct值或Ct＞45，且无明显扩增曲线，判定为阴性；Ct≤40，并有明显扩增曲线，判定为阳性；40＜Ct≤45，重做，若重做结果有明显扩增曲线，则为阳性，否则为阴性。2、根据权利要求1所述的一种基L肯雅病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)为用标本研磨液研磨所述的待观,品，至所述的待领,品的组织碎片消失，得到研磨混合液。3、根据权利要求2所述的一种基L肯雅病毒的检测方法，其特征在于，所述标本研磨液为Hank's液。4、根据权利要求1所述的一种基L肯雅病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)的正向引物的终浓度为500nM.。5、根据权利要求1所述的一种基孔肯雅病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)的反向引物的终浓度为lOOOnM.。6、根据权利要求1所述的一种基L肯雅病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)的荧光探针的终浓度为250nM.。7、根据权利要求1所述的一种基孔肯雅病毒的检测方法，其特征在于，所述步骤(5)的扩增条件为在荧光定量仪50。C，IO射中进行逆转录反应，95"热启动10射中后，进入扩增循环95°C10秒，62°C30秒循环45次。全文摘要本发明提供了一种基孔肯雅病毒的检测方法，包括如下步骤待测样品的前处理；待测样品RNA的提取；设计并合成引物、探针；确定的最佳的荧光定量PCR反应体系为正向引物CHIK-FP终浓度500nM，反向引物CHIK-RP终浓度1000nM，探针CHIK-Probe终浓度250nM；扩增程序为50℃10min，95℃10min，95℃10s→62℃30s45次循环；最后根据Ct值来判定结果。本发明建立了一种基孔肯雅的检验方法，并应用于该病毒的监测，可进一步加强防止该病传入我国的监测工作，具有重要的社会效益和经济效益。文档编号C12Q1/68GK101270394SQ200810027870公开日2008年9月24日申请日期2008年5月5日优先权日2008年5月5日发明者师永霞,幸芦琴,李小波,烨洪,相大鹏,夔郑,郭波旋,钟玉清,黄吉城申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心