一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法，其利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来检测多重蚊媒传染病病原体，可以一次平行检测包括黄热病毒（YFV）、登革热病毒（DV）Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎（日本脑炎）病毒（JEV）、疟原虫（Plasmodium）（4种，包括：间日疟原虫（PV）、恶性疟原虫（PF）、三日疟原虫（PM）、卵形疟原虫（PO））、西尼罗病毒（WNV）及基孔肯雅病毒（CHIKV），具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的优点。
【专利说明】一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物芯片和诊断试剂【技术领域】，具体涉及一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法，其针对多种蚊媒传染病病原体设计特异性核酸探针并与多重聚合酶链反应(PCR)技术结合、采用液相芯片同步快速检测多种蚊媒病原体及其分型。
【背景技术】
[0002]蚊媒传染病是指有蚊虫叮咬人体而传播的疾病，近年来呈逐年上升趋势。蚊媒传染病一旦发生流行或暴发，将给社会稳定、人民群众的健康、生活、生产带来极大影响。根据国境口岸传染病排查需要，将黄热病、登革热、流行性乙型脑炎(日本脑炎)、疟疾、西尼罗热及基孔肯雅热六种疾病作为口岸重点关注的蚊媒传染病。这六种疾病在非洲等国家广泛流行、极易造成国际间的流行和传播，而这些疾病均有发热等症状，没有实验室的检测结果很难确诊。
[0003]在对上述病原体检测方面，目前常规的检测手段包括分离培养方法、免疫学方法，以及核酸检测方法，如PCR、多重PCR、RT_PCR和基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等。但这些方法或多或少存在一些缺陷:如分离培养方法在技术上比较困难，且获得病原学诊断和药敏结果常需要3~5天以上，在临床上难以及早进行病原学诊断和耐药性测定，无法满足临床救治危重感染者的需要；免疫学方法检测病毒的特异性抗体时，不仅需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清，并且还可能存在抗原抗体间的交叉反应而干扰检测，不利于疾病的早期诊断；在核酸检测方法方面，PCR、多重PCR、RT-PCR方法及基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等的灵敏度高，特异性好，适合于快速检测鉴定，但这些方法大多基于单一反应或较少数重数的多重反应的检测，在对临床样本进行检测时，对每一个样本的数十种指标进行检测和排除时，需要耗费大量的劳动和成本。
[0004]对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速检测为目标的检测平台，典型的高通量多重分析技术包括生物芯片、毛细电泳和质谱等，由于其能在同一反应容器中同时检测多个核酸序列，因此在节约时间、劳动和成本方面更具有优势，是高通量、特异、可靠、快速和经济的核酸检测方法。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒及检测方法，其利用多重聚合酶链反应(PCR)结合液相芯片来检测多重蚊媒传染病病原体，可以平行一次检测12种病原体或亚型，操作便捷，特异性强，灵敏度高，稳定性好。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒，该试剂盒包括用于检测下列病原体的探针:黄热病毒的探针YFV-PF、基孔肯雅病毒的探针CHIKV-PF、西尼罗WNV-PF、乙型脑炎病毒的探针JEV-PF、登革I型病毒的探针DV1-PF、登革II型病毒的探针DV2-PF、登革III型病毒的探针DV3-PF、登革IV型病毒的探针DV4-PF、间日疟原虫的探针PV-PF、三日疟原虫的探针PM-PF、卵形疟原虫的探针PO-PF和恶性疟原虫的探针PF-PF，上述探针的核苷酸序列分别参见表1，SEQ ID No:1-12。
[0007]表1用于检测病原体的探针序列
【权利要求】
1.一种检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括用于检测下列病原体的探针:黄热病毒的探针YFV-PF、基孔肯雅病毒的探针CHIKV-PF、西尼罗病毒WNV-PF、乙型脑炎病毒的探针JEV-PF、登革I型病毒的探针DV1-PF、登革II型病毒的探针DV2-PF、登革III型病毒的探针DV3-PF、登革IV型病毒的探针DV4-PF、间日疟原虫的探针PV-PF、三日疟原虫的探针PM-PF、卵形疟原虫的探针PO-PF和恶性疟原虫的探针PF-PF，上述探针的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:1-12所示。
2.根据权利要求1所述的检测多种蚊媒病原体的试剂盒,其特征在于所述试剂盒还包括用于扩增下列病原体目的片段的PCR引物对: 黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R，其序列参见SEQ ID NO:13-14 ； 基孔肯雅病毒的引物对CHIKV-F和CHIKV-R，其序列参见SEQ ID NO:15-16 ； 西尼罗病毒的引物对WNV-F和WNV-R，其序列参见SEQ ID NO: 17-18 ； 乙型脑炎病毒的引物 对JEV-F和JEV-R，其序列参见SEQ ID NO: 19-20 ； 登革I型病毒的引物对DVl-F和DV1-R，其序列参见SEQ ID NO:21-22 ; 登革II型病毒的引物对DV2-F和DV2-R，其序列参见SEQ ID NO:23-24 ; 登革III型病毒的引物对DV3-F和DV3-R，其序列参见SEQ ID NO:25-26 ； 登革IV型病毒的引物对DV4- F和DV4-R，其序列参见SEQ ID NO:27-28 ； 疟原虫的通用引物对PU-F2和PU-R2，其序列参见SEQ ID NO:29-30。
3.根据权利要求2所述的检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于每对引物对中有一个5’端修饰有生物素标记，每个探针5’端均带有胺基化修饰且连有C12邻接臂序列、并分别与相应突光标记的微球偶联。
4.根据权利要求2或3所述的检测多种蚊媒病原体的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括反转录引物混合液，其反转录引物序列参见SEQ ID N0:31-38。
5.—种多种蚊媒病原体的检测方法,基于微球的液相芯片技术，其特征在于具体包括以下步骤: ①合成权利要求2所述的引物对和探针，将每对引物中的下游引物5’端进行生物素标记；将每个探针5’端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列； ②将所述探针分别与相应荧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性核酸探针的微球组； ③抽提待测样本的DNA和RNA，并采用多重反转录反应的方法将RNA的特定基因序列反转录成cDNA ； ④以cDNA/DNA为模板、采用步骤①中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物； ⑤将PCR扩增产物与微球组温育杂交，然后加入链霉亲和素一藻红蛋白与微球上捕获的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物，利用液相芯片系统对待测样品进行定性和定量分析。
6.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤③中所述反转录采用权利要求3中的反转录引物混合液。
7.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤④中的PCR扩增采用不对称扩增，每对引物对中下游引物的浓度是上游引物浓度的31倍。
8.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤④中所述PCR扩增采用三个PCR反应体系，分别为PCR反应体系1、PCR反应体系II和PCR反应体系III ；其中PCR反应体系I含有西尼罗病毒引物对WNV-F和WNV-R，PCR反应体系II含有黄热病毒的引物对YFV-F和YFV-R、登革I型病毒的引物对DVl-F和DV1-R、以及登革IV型病毒的引物对 DV4- F 和 DV4-R ；PCR 反应体系III包括 CHIKV-F 和 CHIKV-R、JEV-F 和 JEV_R、DV2_F 和DV2-R、DV3-F 和 DV3-R、PU-F和 PU-R ； 步骤⑤中，首先将PCR反应体系1、PCR反应体系II和PCR反应体系III中取等体积的扩增产物加入至同一试管内，然后再与微球组温育杂交。
9.根据权利要求5所述的多种蚊媒病原体的检测方法，其特征在于步骤⑤中温育杂交的条件为:96°C变性5分 钟，55°C杂交30分钟。
【文档编号】C12Q1/70GK103911463SQ201410131703
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】史玲莉, 闫冀焕, 李云, 滑娜, 沈军, 吴志茹, 兰景, 李薇, 付晓昀 申请人:河北国际旅行卫生保健中心