检测和分析病原体的方法和设备的制作方法

专利名称：检测和分析病原体的方法和设备的制作方法
技术领域：
tt^^很快。 一些装 置含有用于高通量分析的多通道隔离装置和在单个芯片上集成了样品制备和分析功能的分析器。同时结合了多通道分析和^MW羊品制备的装置能够减少进 行多个测定^r睑所需的资源和成本量。在基因组学领域可以找到一个例证在单个装置中集成测序样品的制备、纯化和电泳分析可以使测定时间和成本降低 并且提高测定的通量效率和耐用性。在所有情况下，微^y空装置中高水平的集狄都需要芯片才W勾具有耐用性以便分离、絲、》v^、分流、和储存大量的 流体。用于硅、玻璃硅、聚^f勿、和棒性微^空装置中的一些阀技术以有限的方 式满足了这些需要。然而，许多这些技术与许多化学或生化测定A睑在化学或物理'^t上不兼容。而且，对J贿的玻璃微^U空装置来说，许多技术缺乏耐用表面修饰的各种化学性质。此外，典型地制造单个微流控阀;UM]单独的膜件，其通常保持打开。具有通常为打开的阀就需要持续驱动以保持对流动的控制。采用这种阀的微;iU空装置不能够从控制系统中去掉，否则会失去对装置中流动成分的控制能力。此外， 一些典型的装置采用单独设置的乳月^M件。单独设置的气动乳月^M件虽然有所M， ^il种制造方法阻碍了 ^!^莫^A化为多通道、 高通量的分析装置。另 一些孩G;U空装置是利用阳45^合的#玻璃晶片制成，并通its电驱动。然而，由于硅的导电性和化学相容性it^其在分析装置中的应用较复杂。结合或者沉积^ iJi的薄膜只能部分^咸少其导电性和化学相容性。人们还礼睑了弹性装置。然而，斷生材料的疏水性和多孔性使得斷生装置与许多化学和生化测定试验不相容。因itLA们希望与举性体表面的流^^触最 小化。复杂的制作、化学相容性、不可靠的流^^控性以及其它的问^itA了 现有的流,空技术不适合于t^到;^见模、高通量的芯片式实验室 (lab-on-a-chip)装置上。因此，本发明的技#才/^勾提供了一种适合于高密度絲到銜緒装置上 的*膜件阀结构。，，供:各种基于该^^膜件阀结,的湳控构，。、，壯置的一个实例。才M居多种实施方式，病原体检测系统包括免疫捕获和DM分析 机构，例如聚合S^iC^应(PCR)，和毛细管电泳(CE)机构。在一个实施例 中，该病原^^r测系统可以在具有树^U空构造的玻^^i^装置上实现。

图1A-1E是可以在玻璃微^空装置上实现的^^膜件阀的图示。图1A为整 体膜件阀的顶浮见示。图1B为具有该阀的三层式装置的侧视示。图1C为具有该阀的四层式装置的僻现示。图1D为三层式装置的一种打开式阀的 侧-f见示。图1E为四层式装置的一种打开式阀的僻f见示。根悟图1A和 IB中所示的各种实施方式，三层式玻^(鼓^U空装置包括夹在两个玻璃晶片101 和105之间的萍性膜件111。在一个实施例中，该举性膜件为聚二甲^lJi^ (PDMS)膜件，购自Bisco Silicons of Elk Grove, IL, 254um厚的HT-6135 和HT-6240型膜件。也可以采用其它的柔性膜件。举^^件111使得晶片之间 的结合可逆而牢固。
在结合之前，晶片中蚀刻了流体通道103用于承栽流体。类^a4蚀刻出集
该阀。典型的是，:充^it道107和(09位于一个晶片;05、上，i^E称之为充 气晶片，而流体通道蚀刻在第二晶片IOI上，il^称为流体晶片。这些蚀刻的 通道特征可直接与膜件接触并形成"^式玻璃/沣性体通道，如图1B所示。
或者，膜件可位于热接合的全玻璃流体晶片夹层(XY)与充气晶片159之 间，如图1C的四层式装置150中所示。具有全玻璃的通道可以让装置受益于玻 璃的良好物理和化学'性质。任何具有良好物理和化学性质的层被称作化学惰性 层。该化学惰性层可用于制造XY。在一个实施例中，构成XY的151和155夹
层就由玻璃制成。
四层式装置的例子包括热丰給到连结晶片155上的流体晶片151。小直径 的通孔设置在流体通道153中的间断点上。举性膜件157粘附在该流体/连结晶 片夹层XZ的连接晶片155 —侧。阀偏流腔室161蚀刻在集管晶片159中并与膜 件157粘合，完成了该四层式装置150。这样，流体通道153保持了全坡^f匕 学上有益的构造，同时可以实现大^^莫^M匕的流控构造。在一些实施方式中， 图1C中所示的四层式装置相比较三层式装置具有相当的优点，因为其减小了样 品和萍t生膜件之间的接触。
才M居多种实施方式，^^膜件装置内的各沐JU空成分是通过向充气晶片上 的孑U^口压力或真空来驱动的。iU^f^可单个的膜件称为IH^膜件。具有整 体膜件的任何单个装置在j^皮称为M装置。用于向与充气晶片相伴随的蚀刻 通ii^加压力或真空的机构在》W皮称为气口或充气口。在三层式装置中，充气 晶片中的蚀刻通道将驱动真空分軟于举性膜件111的阀区域109内。通过阀区 域109处的集管通it^加的真空推动膜件远离通道的间断点，并为流体流动提 供了穿过该间断点的路径，从而打开阀，如图1D所示。利用充气压力可开关的阀在itbf皮称为可开关阀或气动开关阀。
施加充气压力包括加压或者^p真空的情况。因而膜件157能够调节附近 流体通道中的流体流动，如图1D中所示。在图1D中，通过与充气晶片105相 伴随的蚀刻通道向阀区域109 口真空来打开流体通道103。当不再向阀区域 109^/口真空或者吸力时，膜件111关闭流体通道103，如图1B所示。图1E表 示了一种四层式装置。该四层式装置包4顿道层151、通道153、连接层155、 膜件层157，以及充气层159。如上所述，该四层式装置比三层式装置具有相当 的好处，因为其使样品与萍性膜件之间的接触最小化，在一些情况下只在阀区 域161处有接触。
应当注意，所示构造可以朝着任何方向。在一些实施例中，阀可以在装置 上倒置。充气层可以位于流动层的上方或下方。本发明的技术方案允许朝着各 种方向，因为重力并不会对该膜件阀ii^不利的影响。
^y空构造具有多种优点。例如，^^膜件阀通常为关闭的阀，也，^U3兌该 阀即使在装置不与驱动压力源连接时也^#关闭状态。现有的通常为打开式的 微^|空阀需要持续驱动以^#对装置流动成分的控制能力。而且，不像形状记 忆^r的结构，该阀构造的开关温度都是处于环境温度之下，这有利于在水溶 液的生物流体情况下工作。
在许多典型的实施方式中，微^U空装置之间需要许多接口以便操控各种流 控才M勾。然而，才M居本发明的多种实施方式，膜件的多个区域可以通iti^接它 们的充^空制通狄并行驱动。在一个实施例中，利用单个充气口就可以控制 一系列阀。因此，仅使用有PM欠量的外部接口或充气口就能够控制相当多的阀。 这就简化了实现过程并最小化了装置接口的问题。才M居各种实施方式，以这种 方式控制阀能够对M膜件进行大量并行的充^区动，用以操控阀、泵、储液
池、选路器、以錄置内的其它;^空构造。
膜件阀可用于构成各种;劇封/^勾。图2A和2B为采用膜件阀构成的泵的图 示。才M居图2A和2B中所示的多种实施方式，串联设置的三个阀构成了隔膜泵 210。按照五个步骤的循环驱动这些阀就可以实现抽吸过程。图2A表示了一种 三层式，膜件隔膜泵的顶视图。图2B表示了该三层式整体膜件P鬲膜泵的侧视 图。该P禺膜泵包括输入阀201、隔膜阀203和输出阀205。应当注意该隔膜^ 两个方向上都可以工作，因而输入阀和输出阀的指定为任意的。该泵包括具有 蚀刻的流体通道211的流动层209，整体膜件207，以及集管层213。阀的气密特征使该泵能自动充满并且除了其它气体和流^M^卜还能够抽吸空气。
才財居各种实施方式，抽吸过程可通过一系列阶#狄实施。第一步，输出阀
205关闭，输入阀201打开。第二步，隔膜岡203打开。第三步，输入阀201 关闭。第四步，输出阀205打开。第五步，P禺膜阀203关闭，通过打开的输出 阀205抽吸分析物流体。
每次循环4由吸的量取决于打开的隔膜阀内所包含的^^P、，该^^P、又依次取 决于隔膜阀中充气腔室的大小。因此，可以通过调节隔膜阀充气腔室的大小来 制造为了测量已知在納升至微升,Ji^的流体量而设计的泵。该隔膜泵能自动充 满并且能够向前抽吸流体或者通iH向运行所述驱动循环过程向后抽吸流体。 还应当注意的是，膜件接触玻璃密封表面处的阀所在位置可以蚀刻成具有凸脊 或者其它的表面修饰，以控制膜件与玻璃表面的粘着性。
發沐阀还可以用于形成^i^路器、混合器和分流器。应当注意的是，尽管以 下构造将通过三层式构造的文字来说明，但该构造也可以用于四层或更多层式 的结构。图3为一种选路器300的图示。该选路器包4舌阀301、 303、 305和317, 充，道331、 333、 335、 337和339,流体通道321、 323、 325和327,以及 P鬲膜阀309。该i^器将流体从任一输入口抽吸到^""输出口，其取决于在该 抽吸循环过程中在什么部位驱动了哪个输入/输出阀。同时驱动两个或多个输入 阀可在输出阀处将几股不同的流体流';^^成一股流。相反，同时驱动两个或多 个输出阀可在输出阀处将单股流体流分^A几股不同的液流。
例如，为使流体从通道327选路到通道321，阀301和305要保持关闭。 然后如上面所述用阀317、 309和303做为泵。选路器包括;a^和分流流体通道 的功能。为将流体AUa道325和327';^^到通道323，阀303^#关闭。为 将流体从通道321分流到通道323和327,阀301要4呆持关闭。而在另一个实 施例中，为将经通道327引入的流体选路到通道325,阀303和305 ^f緣关 闭。打开阀317和301以使流体通iM道327流到通道325。各种设置方式皆 有可能。
利用整体阀还可以形成混合环"洛。在一个实施例中，通过流体在装置的两 个区域之间流动可实现〉'^^过考呈。混合过程可用于实现在芯片上进行的所有类 型的操怍。图4为一种"^环"洛400的图示。该混/^环>^或混合器包括阀401、 403和405，流体通道411、 413和415，以及充^道421、 423和425。该环 路上连接着其它的有阀的通道，向流^4^供通向或来自濕合器的路径。通itit道413和415可使两种或多种流量的流体i^A该;^^环"洛中，并且如上所述， 将^^由吸到循环中直到这些流体通iiT散作用而^/^。再将该';^^f勿抽吸出该
';^^环路。混合过程&可以通过使流体在两个储液池之间来回流动而实现。
图5A-5C为储液池500的图示。图5A为具有蚀刻的排総室的储液池顶视 图。图5B为该储液池的侧视图。图5C为表示注满后的储液池的侧视图。图5D 为具有钻孑U^M室和用于自发填注/分配过程的泵的大容量储液池的侧视图。 该储液池包含在充气晶片513上，其中膜件505夹在该充气晶片513与流体晶 片511之间。通iiit道501储液池可以注满或排空。才娥多种实施方式，阀区 域503中打开的M膜件阀^t储液池的作用以用于芯片上流体的储存。充气 晶片513中腔室的大小决定了储存在储液池内的流体体积，当^口真空时该储 液池填满，施加压力时其排空。
才M居多种实施方式，制造用于储存大量流体的储液池时可以用钻孔来代替 蚀刻充气腔室，并可直接向该钻孑Ufe加驱动压力或真空。或者，可以## 连接到隔膜泵上来制造不具有直接充气连接的储液池。图5D表示了一种连接到 泵上的储液池503。该储液^M居抽吸的方向被注满或抽空，其具有可变^K 的优点。在一个实施例中，泵例如阀531、 533和535可用于对储液池503进行 填注或分配流体。
具有一个或多个流皿入口的^^膜件储液^^芯片M器的作用。如 同储液池一样，该反应器可以利用通过充气集管晶片^口的直接压力或真空来 直接引A^物或排出产物。或者，该M器可以利用M的泵、';^器、和/ 或选路器构it^间接引A^物或排出产物。才M居多种实施方式，由于^器 的容积受到充气晶片中腔室503的尺寸限制，在不大幅改变流体晶片内结构设 计的情况下，在装置的任何部位都可以具有任意容积的反应器。而且，才娥芯 片上涉及不同体积反应物的反应需要，可以部分填注该反应器。
大多数举性膜件为透气性的，因而这种'M目前被利用以简化所有举性装 置的流体注入it考呈。
才M居多种实施方式，膜件的透气性可消除气泡或着气穴。当向^^膜件反 应器或其它流动结构^M区动真空时，来自于产生气体的反应中的气泡可以被 消除。例如，透气性膜件可减少PCR反应物在芯片上的热循环过程中形成的气 泡，该气泡会导lt^^^讨的损耗。
复杂的微流控装置可包括一些与流动总^f目连接的独立模块。在一个实施例中，向多个不同的流体通道提^^析物流似艮有用处。在另一个实施例中，
可将能获得的多种试剂引入微^空装置中。图6是可用于分配分析物流体的总 线阀600的图示。该总线阀600包括阀601、 603、 605和607，其被制成使流 体从流体总线通道611选路到流体通道621、 623、 625和627中。充^it道631、 633、 635和637分管控制流体分配的阀。典型的总线阀在总线一侧具有死体积。 死体积^it^难以彻底沖洗流体i^l^作之间的总线。根悟多种实施方式，本发 明的技^4€供的总线阀在总线侧的死体树艮少或者没有。这使得流体i^^t 之间的总线能够被彻底地沖洗，并且防止了在装置，过程中不同流体之间的
';a^或交叉污染。
微^空装置才;U勾可以采用各种技术来制造。才M居多种实施方式，通道特征
被蚀刻进玻璃晶片，例如，利用标准的湿法化学蚀刻技术。玻璃晶片(厚度1. lmm, 直径100,)用硝^/it!U匕氢(piranha)清洗(20: 1)并利用LPCVD炉或溅 射系统来涂覆牺牲层(200nm)多晶硅蚀刻掩41^。将Borof loat玻璃晶片或者 Schott D263硅酸硼玻璃晶片用于所述具有三层式或四层式设计的装置。多晶 硅沉积之后，用阳性it^胶旋涂该晶片，温和烘烤并用接触iW〉斜几制成图案。 用Microposit显影剂去除光刻胶的紫外线膝光区域。通过在SF6等离子中进行 蚀刻去除多晶硅的曝光区域。在HF溶液中(49%的HF用于Borof loat晶片，1: 1: 2的HF: HC1: H20用于D263晶片)以7 um/min的i^l等向蚀刻晶片，直 到达到所需的蚀刻深度。
才M居多种实施方式，三层式装置的流体通道晶片蚀刻成20um深，而四层式 装置蚀刻成40um深。三层式装置的集管晶片蚀刻70um深，而四层式装置在阀 位置钻孔。然后分别用PRS-3000和SF等离子将剩余的光刻胶和多晶^晶片 上剥去。钻出贯穿流体和集管晶片的通孔并再次用硝^/it^化氢清洁该晶片。
在一些实施例中，采用三层式设计的装置的组装是通过将PDMS膜件(254um 厚的HT-6135和HT-6240， Bisco Silicones, Elk Grove, IL)加到流体通道 晶片中的蚀刻构iUi，并且无论集管上钻孑Lil蚀刻排維室是如何朝向的，都 直4^^压具有阀的集管混合玻璃-PDMS流体通it^阀位置横过PDMS膜。采用四 层式设计的装置的组^:通过首先将流体通道晶片热津給到具有直径为254um 的M钻孑Ut孔的210um厚的D263连接晶片上，其中该通孑W立置对应通道间隙 的位置。该流体通#连接晶片在真空炉(J. M. Ney， Yucaipa， CA)中以570 匸加热3. 5h而粘合。然后将得到的含有全玻璃通道的两层式结构粘合在PDMS膜和集管晶片上。这样形成的玻璃-PDMS键合是可逆的，但仍然足够牢固以承 受施加到该装置上的真空和压力范围。^E^，在组装之前通ii^ UV臭氧清洁 器(Jelight Company Inc. ， Irvine, CA)中清洁集管晶片和PDMS膜可获得不 可逆的玻璃-PDMS键合。
上述的微流控装置的机构可用于实现^^种装置。可以灵活地设置包括阀和 泵的构造以提供多通道的芯片式实验室仪器，使其能够在单个装置上集成样品 制备和分析步骤。该微流控平台特别适合于用作一个能够实现M化病原^f企 测系统的装置。
测定法(FIA) ^i^t^则。典型:也，4&则会^5J;分析物特异性^体的固定、 与样品溶液的温育、连接着酶或焚光团的夹心抗体的识别，然后是显色和;j^则 过程。也可以^^1免疫荧>^^则测定法。然而，^-种测定法都相对具有;^则 局限性。
采用各种形式的基于PCR的基因检测和类型测定^艮"fi4，因为其具有高 度的特异性和获得量。然而，尽管基于DNA的PCR方法功能强大，但它们对活 和死的病原体都呈阳性^，这就有可能产生假阳性的结果。因而可^^^RNA 目标物进m&则，因为其能够很快地降解，也就意味着需要活的目标物才能够 被御'J出，
人们还提出了多种可选择的4&则方法。已开发出质^^析法通过冲^则中性 脂质体、极4生质脂体和芽孢特异性生物标记来检测病原体、芽孢以及其它生物 试剂。然而，质语分析法的速度、通量和便携性并不出色而且其特异性还未得 到证实。
对来自于土壤、空气等的芽孢(例如炭必的称则是个难题，因为其具有高
大多凄汰进的冲^则原理是利用^具有薄膜加热器和絲荧m^和检测过程的 硅制微型^器中对PCR产物进行实时冲^则的。该系^^iM皮扩^J'J了一种十 通道的高级核酸分析仪UNAA)以及一种便携的形式。该系统的各种形式还被 开发用于军事上和邮局中。还开发出了一种具有集成(多微升)样品处理过程 的GeneXpert样品制备系统用于进行实时PCR分析。
开发出能够快速实施自动和复杂的前述化学M并定量病原体浓度和抗生 素抗性的便携式分析仪是一个很大的进步。类似地，当需要筛选大量样品或者可肯^"在的受感染个体时，能够在高通量、多样品筛选应用中快ii^r测和测 定大量样品的类型并且假阳性率非常^^沐用处。这类自动化临床分析仪的 ^ 也有所进步。在一个实施例中，开发出了;Ut为脊遏自动分析仪的微型形 式的复杂微:^空回路系统用于血液临床分析。还开发出了一种全面M的分析 仪U鼓升体积身见格)，可用于血液样品制备用以在微阵列上进行HIV分析。该 系统可进行包括多个核酸步骤的复杂测定，并且采用了 > 100 nL的死体积充气 膜件阀，该阀将在下面作更详细的M。
已经开发出透明塑料(lucite)微流控管用于控制溶液在六个不同的免疫 阵列传感器上流动，该传感器以小型便携式系统的形式控制流体，其具有简单 的减压系统从而有利于其免疫测定的性能。所开发的这种形式的系统如，利用 集成式流动系统和纤维光学生物传感器毛细管的Raptor便携式分析仪，可在十 分绅的操作时间内分析四种不同的试剂，人们已经认识了可寻址阵列的独特性 质从而开发出一种集成式的叠层微型实验室，其可以实现自动化电场驱动免疫 捕获和DNA杂交阵列分析。例如，赫免疫捕获细菌被释放出用于链置换扩增 (SDA)，然后进行扩增志贺样(Shiga like)毒素基因的杂交分析。然而，其 不能进行多样品分析也没有研究过检测的局限性。
尽管常规的微细加工是^ kh进行的，^SA们已发5W于化学和生化分析 来说，玻^(敫流控结构呈现出优选的化学和电泳性能，并且塑料结构的范围也 在不断扩展。在高通量应用中，本发明的技术具有径向的通道设计，其能够快 速并行地分析96至384个片段大小或者平行M^布则序分离。在芯片上直接集 成PCR与CE分析并具有DNA酶切和亲和捕获的功能。
才M居多种实施方式，本发明的微^U空装置才/^勾可以形成复杂的通道构造， 其能够制iU空室、阀和CE分析通道的复杂阵列。这些小型的CE通道与交叉注 射器一起使用有助于实现十分决速的高分辨率电泳分离。差本上在色傳柱或毛 细管中进行的所有"^ft^减小到了芯片的形式，所需的样品量随之减少，分 析时间和灵敏性得到了提高。
根据多种实施方式，本发明的病原^^企测系统具有灵敏性与特异性和定量 能力相结合的特征，从而提供了一种特别有用的测定方法。许多病原体在4HA 细菌量〉103时具有感染性，而K c/ o/wa (霍乱病毒)在经口揭入量低于105 时都不会引起症状，或者A a/^rac7\f (炭疽杆菌)在量^^多的7jc平上^M皮 认为具有影响力。识别菌抹以便将致病菌林与非致病菌林区分开来，以及鉴定特异性毒素或抗生素抗性基因的存树于鉴^险性和确定治疗方法来说^M艮 关键。此外，能够确定细菌的浓度或剂量并且随着所述鉴定结果一起进行定量
报告不同于背景技术的 _测定^^睑，負y^供重要'^测定^^果。
图7为一种病原体检测系统700的一个实施例图示。分析物通过通道701 引入到免疫亲和性捕l^室703、 713和723中，通道731处收集残余物。才M居 多种实施方式，免疫亲和性试剂用于将输入的细菌"^^捕获、集中并分层到 一系列分离的免M室703、 713和723中。该便易的过程将重要的大型界面处 理为微小界面，原先它们是应用微流控系统进行痕量病原体枱邻J的一个障碍。 免疫捕获的第一阶^i^提高测定的特异性方面^ij 了重要的作用。为达到较 高的灵城，病原^M^测系统的^ ]者可接着对存在试剂进行基于PCR的重复 确认，还开发出了利用DNA分析;N勾705、 715和725进行的基于特定引物的方 法或者更普通的测U因类型的方法，例如PCR,用以鉴定特定的菌林、毒素 基因的存在以及抗生物素抗性标记的存在。在一个实施例中，DNA分析才鳩705、 715和725包括PCR和CE。
才M居多种实施方式，免疫亲和性捕微室703、 713和723与PCR腔室絲， 但CE才/U納橫独立。联合免疫捕获与核酸分析大大提高了个体测定礼睑的灵敏 度和特异性。
AUt传学上区分病原体和非病原体在许多应用中很重要。联合免疫捕获作 为PCR分析的上游端对输入的细菌种群具有重要的纯化作用，可以处理通常存 在于不纯的复杂"现实"样品中的PCR抑制物。根据多种实施方式，病原体才企 测系统将建立起实施i^环4欠(非渐近的)方案的PCR，这样可^Mt并报告输 入的目#^群的数量。在许多实施例中，处理的样品可接着供以CE分析。^JD 现^f效^空技术可以制造廉价、快速和耐用的测定系统，其体积小、便于携带、 并且只需要很少的能量、资源和腾技能。
病原体分析仪中包含了 ^A式免疫亲和捕自室。可以^UM捕获机构， 例如缺、孩沐、凝胶、餅件(monoliths)、以及聚合物。图8和图9;i^ 示利用二氧^i ^块和樣沐实现的免疫捕获腔室图示。根据多种实施方式，免
疫捕 室包括一 系列用二lUt^)^硅酸钠粘结剂的〉'^^勿填充晶片孔而制 成的二氧4W媳块。经舰水和沖洗，该硅雖凝结^5勤交并JUt801、 803、 805和807处形成了不溶的二氧^^姆块。
根椐多种实施方式，在1. l咖厚的玻璃晶片中形成的每个^iil^直径为l咖。免疫捕，室与用于引入和排出分析物的通道821相伴随，晶片内的;tm 很容易集成到含有膜件811和813以及阀和泵结构的装置上。在图8中，四个 石i^块801、 803、 805和807通过膜件811和813封闭住。每个'缺的较大硅 表面适合于通过各种有枳^^试剂来化学W汙生。为进一步简化装置的制造， 在PDMS非热津給到其余装置上之^T以化学衍生所述，晶片。
在一个实施例中，诸如,或1. 5um的孩i^il样的才;U勾孚i^口入捕，室中 以便能够捕获许多大的物质种类，例如芽孢和细菌。固相捕获许多大的物质种 类对本领域技术人员来il^已知的，并且其特征曾描述于Weimer, B. C. ， M. L Walsh，C. Beer，R. Koka,以及X. Wang， 2001 Solid Phase Capture Of Proteins, Spores, and Bacteria. 紐/r肌飾ro6/o/柳,67: 1300-1307。在一 些实施例中，为采用樣^N式剂进行捕获，要用围堰结构来修饰腔室以便提供微 珠的止动件以及孩沐的$ 1入通道。电动式孩i^K床装填与围堰孩i^Mt获对于本领 域技术人员来^A已知的。或者，可以将具有免疫功能的磁性孩沐引入没有围 堰的腔室中。
图9是表示具有不再密封的胁件的打开阀图示。才M居多种实施方式，在 区域901、 903、 905、 907和909处^i口气动真空以使得分析物沿着通道921流 动通itfc^块931、 933、 935和937。在所制造的装置中可以含有^f可数量的熔 块。
图10A是表示分析物捕获的图示。4W居多种实施方式，包括三个膜件阀 1001、 1003和1005的泵1000用于抽吸含有寡核苷酸、蛋白质、细胞等的分析 物溶^it过一系列免疫捕l^室。
腔室可^^各种才/i4勾来捕获感兴趣的目标物。在免疫捕iyt室中捕获的任
何感兴趣的物质在》t^皮称为目标物。携带目标物的流体或物质在J^皮称为分析 物。在一个实施例中，目标物为流体分析物中携带的沙门氏菌或利斯特氏菌 (Listeria)。
在另 一个实施例中，每个捕mit室填充了含有寡核苷酸探针的粘性聚^f勿 基质，以便选择'lli也结合目标物分子。在DNA分析时，Sanger DM序列延伸产 物，包括高盐浓度中的引物和聚^S^式剂，电泳通il^疫捕获腔室，其中该免 疫捕自室中包含了含有MS^苷酸探针的固定化丙烯^^M。捕获的序 列是这样选择的，使只有DNA扩增产物被探针捕获，而引物和聚合酶试剂随同 盐^流过该装置。这就像需要从分析时遇到的复杂、不纯的混合物中純化目标物W那样。
制备具有功能性聚合物捕g质的微捕获腔室的一个可选择方法包括制备
具有10-20um范围的孔的餅件，以及制备具有较大的、表面^^了功能性薄 交联聚合物层的微细加工元件(大约100um)的腔室。该方法很有用，因为有 时候^^于填^J'j捕，室中并JUI^K^t于常M^常常缺4X够的才;L^ 稳定性。才娥多种实施方式，多孔(IO-20um)的表面功能性聚^f勿^^件的成
形成:捕旨室中的。 、1 5 'Z
由于聚合过程是利用UV光来实现的，通过 ']法可以在微^4空装置的^^可 需要区域形成多孔聚^f勿。利用填絲前体》;^4勿的玻璃芯片的这种"孩浏法" 聚合过程的动力学对本领域技^A员来^A已知的，例如描述于Yu, C. ， F. Svec,和J. M. J. Frechet 2000中的Towards stationary phases for chromatography on a microchip: Molded porous polymer monoliths prepared in capillaries by photoinitiated in situ polymerization as separation media for electrochromatography.(在微芯片上进行的固相色镨才支术通过 M始原位聚合反应在毛细管中制备成型的多孔聚^f勿，件作为电色镨隔离 介质)，f/ec"o/7力o/^/s， 21: 120-127，以及Yu， C. , M. Xu, F. Svec,和 J. M. J. Frechet 2002中的Preparation of monolithic polymers with controlled porous properties for microfluidic chip applications using photoinitated free radial polymerization.(利用ife^会自由基聚^^^制 备具有可控多孑L特征的餅件聚^^勿用于微力tl空芯片应用)，/ ^/戸^5W,，
40: 755。类似地，可以控制装置上，件材料的精确位置以及其表面化学仏贫， 这对于本领域技术人员也是已知的，如描述于Rohr， T. C， C. Yu, H. M. Davey， F. Svec,和J. M. J. Frechet 2001. Simple and efficient mixers prepared by direct polymerization in the channels of microfluidic chips.(通过 在微流控芯片的通道中的直接聚合反应制备简单而有效的混合物)， f/e"ro/ 力o/^/s， 22: 3959。胁件聚^f勿的多孑L4争性可以通过调节致孑U^剂 的组分来实现。
无论4^]具有微细加工元件的，件还是表面，都可以使用同样的#方 法来引入所需的4給元件。由于目的在于将抗体固定在这些糾件的孑L^面上， 因》b^的化学物质特别易于与生物聚^4勿发生反应。在一个实施例中，加入表面4^f勿的2-乙烯-4， 4-二曱基吖内酯可以与蛋白质iiliii^。这样的才A^) 对本领域技术人员是已知的，如描述于Peterson, D. S. ， T. Rohr， F. Svec， 和J. M, J, Frechet, 2002中所述,Enzymatic microreactor-on-a-chip: protein Mapping using trypsin immobilized on porous polymer monoliths molded in channels of microfluidic devices.(酵芯片樣i^I器利用孩i: ;JM空装置通道中成型的多孔聚^4勿^^件上固定的胰岛素作蛋白质图镨)，力朋/. C力e瓜，74: 4081: 4088。可将JH'歸的表面(多孑L^^件，或者微细加工元件)
》'l:A单体溶液中，并且用uv光，装置从而在于选定区域上实sy^过程。表
面功能化的程度由a溶液中单体的浓度、，时间，和UV光的强度控制。
在另一个实施例中，胰岛素被固定在由2-乙烯-4， 4-二曱基吖内酯、二曱 基丙烯酸乙酯和丙烯,或2-甲基丙烯酸羟乙酯构成的多孔聚^4勿皿件上。 吖内酯的功能是容易与酶的胺和石辦基M形^il定的^f介键。在一些实施例 中，胁件优化的多孔性特征形成了非常低的背压，使得能够^ )简单的才M勾 进行抽吸来既实现Ai容液中固定酶又实现随后的底物溶液分析。反应器的 MicheallS"Menten动力学特征可以利用低分子量的底物，如N-a-苯曱酰-L-^奇 氨酸乙酯^U^则。
人们详细研究了固定化变量，例如溶液中胰岛素浓度和吖内酯的百分比在
M件中的泛函性作用，以;^A应时间对酶活性的作用，和过程变量如底物流
速和在反应器中的停流时间的作用。芯片上酶孩汰应器的蛋白水解活性在不同 流速下随着作为底物的荧光标记酪蛋白的裂解而得到证实。该整^^议应器的 优良特,f組可以通过快速流动速率为0.5 uL/min时的朋ii蛋白消化作用来证 实，其中停留时间仅为11.7s。然后利用MALDI-T0FMS ;J^4征消化物，在"3 条可能的肽片断中识别了 102条，序列;^率达67%。
已经作出了巨大的努力来开发新型的微细加工分析装置及其^/(匕，以制 成微型全面分析系统(Ptas)。这些系乡^yi供了比原尺寸仪器具有更高通量、 更少的样品和试剂消耗量、更小尺寸以及更j^t成本的可能性。在微流控装 置的各种应用中，分析技术，例如电泳、电色谱、涉;sj酶的测定法，以及免疫 测定法都通itit种方式得到了证实。尽管孩";M空芯片4支术不可否i人取得了成功， 但仍存在一些问题。例如，大多数的微;iU空芯片特征是开放的通道构造。因此， 这些通道的表面积与体积tbf目当小。在,于与固相表面发生^I的应用中， 例如在色谦分离、固相提#多相催化中，其可能成为严重的问题。由于只有通道壁可以用于提供所需的相互作用，所述《效型装置只能处理孩￡量的4^物。
图IOB是表示使用二维分析系统的图示。在^NM牛1027捕获了由具有阀 1001、 1003和1005的泵提供的目标物之后，M件1027封闭。在一个实施例 中，每个腔室f^勸口热以熔化双链DNA并分离出单链DNA产物。才財居多种实 施方式，纯化作用发生在120秒内，可以錄初的3uLii^仅仅20nL的200倍 浓缩物。每条管线1011、 1013、 1015、 1017、 1019和1021都包括用于控制或 抽吸被捕获目标物的阀以用于进一步的分析步骤。
在一个实施例中，测试装置上提供了捕获的目标物用于PCR和CE分析。利
成测i錄^^i^4争征包括i;免疫捕微室，其蚀刻进具有微细加工的加热
器和温度传感器的玻璃基fc 2 ) 100-300 nL的聚^miC^应腔室，用于扩 增从目标细胞裂解所获得的DNA;以及3)毛细管电泳微通道，其蚀刻进用于分 离和^J则PCR扩增子的玻璃_1^反。
4链的第四^f争征，絲DNA预^^宿/纯化腔室也可以加到该装置上，用于 纯^*改的病原体基因组DNA或者，在注入CE微通道之前如果需要的话用于预 浓縮扩增的DNA。尽管先前的研究表明，为进行成功的分析，将PCR扩增子直 接;iXCE孩域iiJi，可以狄需要这样额外的复杂性，但是要获得高质量的电 泳图谗这种纯化过程是必要的。利用^f亥苷酸捕l^t的化学'瞎可以实5 i广 增子的纯化过程。如果需要純化基因组DNA，可以在纯化腔室中填^^f匕的二 氧^ft^封tt,并在PCR之前用作全面捕获细菌DNA的基质。
集成化的一种方法是在玻璃芯片上仅仅制a疫捕获、才m纯化、PCR、扩 增子纯化、以及CE的单独模块。再利用微通道和各种PDMS阀结构将这些才狄 彼jtbf目接。图11中给出了一种被制成具有单独的免疫捕获和PCR^器的病原 体分析芯片的示意图。该集成化病原体检测系统包括免疫亲和性捕l^室1101。 分析物通过该免疫亲和性捕，室1101引A^该病原^^测系统中。PCR腔室 1103与该免疫亲和性捕获腔室1101 4繊并接收由该免疫亲和性捕获腔室1101 捕获的目标物。CE通道1105与该PCR腔室1103 4喊用以进行进一步的分析。 微细加工的电极1113可用于提供电势差。还可以具有一个与该免疫捕自室和 /或PCR腔室4^的加热器(未画出)。各种阀控制了分析物流动通过该^/f匕 系统。才M居多种实施方式，这些阀为，阀。
尽管在装置上提供免疫捕获、PCR、 CE和纯^+多財^A—个合理的方案，^#悟多种实施方式建议使用为更简单的装置，以便有利于捕l^:率、PCR效
率以及DNA片段的高灵M分离和4&则。尽管免疫捕获和PCR可以在单独的腔 室中进行，^E^—个实施例中，免疫捕获和PCR可以相结合以便简化装置和处 理过程。在该实施例中，PCR可以成功地从固体基质和固相免疫捕获试剂中引
发。在一个实施例中，PCR可以利用免疫标记的孩沐iM^行。
图12是表示联合免疫捕获和PCR腔室1201的图示。根据多种实施方式， 该联合腔室具有在该纳升，室内制造的iy^电PiU口热机构(未画出)和电阻 式温度检测器(RTD) 1205。在一些实施例中，分析物通过输入口 1211并通过 膜件阀1221引入。利用压力驱动流体流动将目标病原体固定在腔室1201内， 而废^it过阀1223在出口 1213处被收^M^。病原体固定^，用緩沖液冲 洗该腔室1201以去除松弛附着的细胞或者非特异性结合的试剂。
PCR緩冲液要么通过原始的样品入口 1211引入，要么通过单独的专用入口 来引入。才^居腔室1201中的目标病原体，化学自剂可直接包含在该PCR緩冲 液中。引入裂解试剂和/或PCR緩沖液之后，用捕获/PCR腔室中的^U^p热 器1203将样品温度升高到一温度下，使得病原体从捕11^中同时#^文出并且 才M居试剂种类而发生溶菌。
最简单但通常是最有效的，方法是仅^ii行加热/^卩循环。只加热或者 在低浓度的化学,溶剂下加热时，革兰氏阴性细菌和一些具有较薄夕卜部细胞 膜的真核细胞更易于裂解。在一些情况下，例如对于芽孢或者革兰氏阳性细菌 来说，就可能需要使用能干扰PCR反应的较强的,试剂。例如，通常需M 溶菌酶、蛋白酶K、溶葡萄球菌素、和变溶菌素单独或先后船0入，以裂解一 些顽固的革兰氏阳性葡萄球菌和&葡萄球菌菌林。在这些情况下，^JD单独的免 疫捕获腔室再加上纯化/预浓缩腔室可以使在细胞IUf^后PCR扩增之前进行 DNA的中间捕获过程。
在该方案的捕获和^^后，提取的DNA可以通过电泳而驱动itA纯化腔 室，由幾基孩沐吸收而务賭下来。利用加热或者改变离子强度可以将純化的DNA 从该纯化腔室中释放出来，并通过电^漸ili^PCR腔室中用于扩增。 一旦来自 于IU^细胞的DNA出J脉具有PCR緩冲液的腔室中，利用微细加工的加热器和 温度传感器，就可以在该释放的基因物质上直接进行PCR 了。
应当注意在一些情况下，由于其复杂性或对PCR的抑制性，兼有捕获和PCR 用途的单个腔室会出现问题。在这些特殊的情况下，仅仅需刻寻这两个阶段分开进行。在一些实施例中，如^4在的捕^t或孩^M印制了PCR反应或者如
果输入的样品引入了不能洗去或中和的PCR抑制剂时，就应该这冲W坎。这样， 棒改的DNA可以从捕自室中的勤醉细菌中被抽吸到或者电泳到单独的PCR反 应器中用于分析。
一旦完成了 PCR，可以将扩增子直接注入到CE孩域道中用于分离和4&则， 根据所需的分辨率，可采用在分离基质中的嵌入染料或者荧光标记的引物并变 性分离M。在一些情况下，在注入CE樣at道之前，可引入DNA纯化腔室以便 脱盐和浓缩扩增的DNA。通过将扩增的DNA电泳i^A纯化腔室，其中它结合到
羧似I^M戈者斜亥苷酸捕I^ (与所需目标物互补的捕H^f亥苷酸)，实现 了純化过:程。结合^进行洗涤并利用孩W口热器^ii布显度相关的释放，然后 通过注入CE微通道的十字，对,和脱盐化的PCR扩增子进行电泳用以分离和糊。
采用^^膜件阀建立病原^^r测和分析系统的装置构造可以有很大的变 化。图13A是表示一种病原^"测和分析系统设计的一个实施例图示。该设计 包括三个玻璃层，包括通ii^1303，连接层1305,和集管层1309。连接层1305 与集管层1309之间设置了一PDMS膜件层。集管层1309包括了可以向膜件1307 施加真空的才W勾用以控制阀机构。
层1301上设置了电源接头，层1311上具有集管卡盘层。通道层1303包括 免疫捕获/PCR/纯化腔室和CE微通道，以及位于该晶片的Ji4面的加热器。根 据多种实施方式，通itJ: 1303与含有玻^4占孔作为阀连接的薄玻璃晶片1305 热键合。PDMS阀/泵膜件1307可逆或者不可逆地与该多层叠层结构相键合。底 部蚀刻的集管层1309将真空或压力传递给装置上的阀和泵。
利用i贿的薄膜技术制造温控元件提供了构建测i錄置的第 一种可行途 径。然而，通itijl用IUt40锡UTO)加热器可制氐该装置的加工难度。ITO加 热器以其低电阻率、任选的透明度、以及与玻璃J^反的兼容性而著称。这些加 热器可以沉积在同一个晶片上作为温度传感器，以避免需要背面加工和电镀形 成加热器。加热器可以直接设置在腔室内用于但选的热传递，或者其可以设置 成抵靠在腔室上以便通iii皮璃晶片传导热能。ITO的^i4的透明度也使得可以 在流^^b逸道的上方选择电加热器引线的路线，而不^碍样品或PCR扩增子 的可舰絲松则。
图13B是表示根悟多种实施方式的微细加工过程图示。1381和1383表示了微细加工过程。在一些实施例中，先清洁玻璃晶片(550ium厚的D263，购自 Schott of Yonkers， NY)，然后通过直^5兹控'减射系统(购自于UHV Sputtering of SanJose， CA)将2000 A的无定形名i^;^Li。在该晶片的一面。利用购自Karl Suss of Waterbury Center, VT的接触i^)^Mf购自Shipley 1818 of Marlborough, MA的;^ij胶旋涂上并形成光刻图案，然后利用购自Plasma Therm of St. Petersburg, FL的平行M应离子蚀刻(RIE)系统中的SF6将底层硅
蚀刻掩^t选择地去除掉。
在一些实施例中，流体通道、电泳通道、和PCR腔室在49y。的氢氟酸中被 蚀刻成36Mm的深度。用购自Flashcut CNC of Menlo Park, CA、具有金刚石 钻头的CNC磨机钻出PDMS阀的储液池入孔(直径1. 5 mm)和流动通孔(直径 0.020")。然后用晶片划片^M夸晶片切割成两个20 rnrnx75 ,的滑片。
要形成RTD和电极，首先可将200 A的Ti和2000 A的Pt (UHV)賊涂在 550)am厚的D263晶片上。利用购自Suss Microtec of Waterbury Center, VT 的接触W^4M夸购自Shipley (SJR 5740 ) of Marlborough, MA的厚光刻胶 旋涂上并形成图案。4財居多种实施方式，在70'C下将it^月辨千2小时。利用 热王水(3: l的HCl: HN03， 90'C )蚀刻金属可形成RTD元件。M式加热器 的形威^^通过首先利用购自于Perkin Elmer of Wellesiey， MA的RF'减射系 统将200 A的Ti和2000 A的Pt的多层薄膜沉积在RTD晶片的背面。将厚光 刻胶旋涂在该面，利用背面接触^t〉斜几(Suss)使该晶片形成图案，然后烤 干。利用购自Technic(TG 25 E) of Anaheim, CA的亚石jfl^金电镀液以4. 3mA/cm2 的电流密度^^r电镀在所述Ti/Pt种层上23分钟，厚度达5mm，从而制^f口 热器导线。
才娥多种实施方式，去除^，]胶并利用厚;^iJM背面重新形成图案。利 用购自Veeco Instruments of Plainview, NY的离子束蚀刻系统将力口热元件蚀 刻成Ti/Pt种层。将RTD/加热器晶片切割成两个25咖x 75 ,的滑片(Disco )。 在一些实施例中，利用购自Centurion VPM， J. M. Ney, of Yucaipa， CA的可 编程真空炉^4占孑Ut道晶片与RTD/加热器晶片热^^合。
尽管J^反上可以包括单个的免疫捕获、PCR、和CE系统，但本发明的技术 认识到，开发用于临床诊断的并行免疫捕获、PCR、和CE系统也是有效的。在 一个实施例中， 一种便携式病原体分析仪包括三个连续的免疫捕获/PCR系统， 目标在于抬3则样品中的三种不同的病原体。直接并行排列了流控系统、加热器
24电路、温度传感器以及用于三个系统的电泳装置，单个显微载玻片具有足够的 表面积来制造三个完全并行的系统。
在另一个实施例中，提供了用于临床诊断的糾并行免疫捕获/PCR系统。
这种能够分析来自多个个体或者威ia个体的多种不同试剂的能力提供了 一种强
有力的方法来鉴别和在疫病学上追踪感染物。图14是一种径向平行的免疫捕获 /PCR装置1400的部分图示。围绕圆环轴排列的^f可具有多个免疫捕获和DNA 分析机构的系统或装置在j^皮称为径向平行装置。
才W居多种实施方式，该设计包括財的分析器阵列，每个分析器含有一个 与CE分析器集成的免疫捕ll/PCR腔室1423。样品连续i4itii^置的给定小单 元内的所有腔室，使得连续捕获多种试剂。装置的单个小单元1401、 1403、 1405、 1407、 1409、 1411能够并行地分析不同的物质。储B 1447和1445提供了微 珠的输入和孩沐的排出。储液池1443和1441分别为常规的毛细管电泳的阴极 储液池和废液储液池。
将腔室相互连接用于，式免疫亲和捕获。阀1431和1433在,环4上 封闭了所微室。阀1435和1437从孩沐引入和废舰狄封闭了腔室。CE微 通道连接着常规的中心阳极，以利用现有的旋转共焦荧光扫描仪(未画出)进 #^则。提供了联合捕 室1423的平行阵列和具有引线1451的加热器，以 及改进的阀和泵的耐用阵列。由于与腔室1423相伴随的加热器和温度传感器在 分析通iUi平行工作，使用简单的环形加热器就绰绰有余了 。因而不再需要单 个的加热器和温度传感器，从而提供了经济和有效的平行病原^^则系统。
尽管上面为简^^L以单数形^笛述了许多元件和加工方法，^a^领域技 ^A员应当明白，也可以使用多个元件和重复的过程来实践本发明的技术。
尽管本发明是才M居其特定的实施方式^^^i兌明的，^M页域技术人员 工应明白在不偏离发明实质和范围的情况下，可以对所公开的实施方式的形式 和细节作出改变。例如，上述实施方式可以利用各种材料来实现。因此，本发 明的范围应当参考所附的权利要求来确定。
权利要求
1.一种病原体检测系统，该系统包括集成在微流控装置上的免疫捕获腔室，该免疫捕获腔室可用于捕获通过微流控通道提供给所述免疫捕获腔室的目标物；与所述免疫捕获腔室相伴随的DNA分析机构，该DNA分析机构集成在所述微流控装置上，所述DNA分析机构可用于对目标物进行DNA分析。
2. 权利要求1所述的病原^^则系统，其中所述DNA分析才/U勾包括PCR 和CE。
3. 权利要求2所述的病原^(^"测系统,其中PCR包含在与所述免疫捕雌 室相分离的腔室中。
4. 权利要求2所述的病原^M^则系统，其中PCR包含在所狄疫捕雞室中。
5. 权利要求2所述的病原体检测系统，其中所述PCR的腔室用于扩增/^^斤 需目标4勿，所得到的DNA。
6. 权利要求3所述的病原体枱侧系统，进一步包括蚀刻的毛细管电泳孩诚 道，用于分离和^"测PCR扩增子。
7. 权利要求6所述的病原^^测系统，进一步包括DNA预,与纯化腔室， 用于纯^#^的病原体基因组DNA，或者在注入CE獨通iUi之前用于脱盐^f贞 ^t扩增的DNA。
8. —种病原祸4企测系统，该系统包括^M数^空装置上的免疫捕皿置，该免疫捕g置可用于捕自过微;iU空通道4^供的目标物；与所述免疫捕l^置相伴随的DNA分析装置，该DNA分析装置|1^在所述 微^M空装置上，所述DNA分析装置可用于对目标物进行DNA分析。
9. 权利要求8所述的病原^^则系统，其中所述DNA分析装置包括与所述免疫捕l^置相分离的PCR腔室。
10. 权利要求9所述的病原^^测系统，所述PCR的腔室用于扩增从所需目 标物裂解所得到的DNA。
11. 位于M装置上的病原^^则系统，该系统包括 M在该整沐装置上的多个免疫捕自室，该免疫捕，室可用于捕获通过微刷空通道提供给所il^疫捕，室的目标物；与所iiit疫捕获腔室相伴随的多个DNA分析机构，所述多个DNA分析;tM勾 集成在该整体装置上，所述多个DNA分析机构可用于对目标物进行DNA分析。
12. 权利要求11所述的病原^^则系统，其中所述多个DNA分析才赠包括 PCR和CE。
13. 权利要求11所述的病原^^则系统，其中PCR是在与所述多个免疫捕 室相分离的腔室中进行的。
14. 权利要求13所述的病原体抬邻J系统，进一步包括多个烛刻的毛细管电 》Wtit道，用于分离和^ri则PCR扩增子。
15. 权利要求14所述的病原^^r测系统，进一步包括多个絲的DNA预浓 缩与纯化腔室，用于純^^改的病原体基因组DNA，或者在注入CE微通iUi之 前用于脱盐和预浓缩扩增的DNA。
16. 权利要求11所述的病原^^则系统，其中所狄疫捕舰室进一步可 用于纯化和浓缩目标物。
17. 权利要求11所述的病原体抬r测系统，其中所述多个微细加工的免疫捕 自室被制成以##所选择的抗体。
18. 权利要求17所述的病原^#^则系统，其中所选择的抗体由孩沐、舰、 溶胶^^交、^^交、或者聚^4勿，件所##。
19. 权利要求17所述的病原^^则系统，其中所选择的抗体由直接形絲 捕刻空室内的多孔、表面功能化聚^4勿成型块所##。
20. 权利要求19所述的病原^(4^r测系统，其中所狄型^A通过含有单体 和致^L^剂的前体"^物的光聚合反应而形成的。
21. 权利要求17所述的病原^#"测系统，其中所述多个免疫捕雜室被制 成径向平行的方式。
22. 权利要求21所述的病原^^则系统，进一步包括与所述多个免疫捕获 腔室偶联的环形加热器，该环形加热器可用于加热所述多个免疫捕自室以释 方W斤捕获的目标物。
23. 权利要求17所述的病原体检测系统，其中所述多个免疫捕获腔室在玻 璃层上制成。
24. 权利要求23所述的病原^M&则系统，其中所i^L璃层与餅膜件层偶联。
25.权利要求23所述的病原^f^则系统，其中所itJ^璃层包括多个蚀刻通 道，该蚀刻通道可用于提供流体流动的路径。
26，权利要求25所述的病原体枱邻j系统，其中所述玻璃层和充气层夹着所 舰件层。
27. —种用于病原体分析的方法，该方法包括通过^^M装置上的微^空通道将流体分析物提供给多个免疫捕M^室；在免疫捕获腔室中捕获与所述流体分析物相关的目标物；以及 利用与多个免疫捕，室相伴随的多个DNA分析;fcM勾对所述目标物进行DNA 分析，所迷多个DNA分析才;U勾M在所述整体装置上。
28. 权利要求27所述的方法，其中所迷多个DNA分冲;HM勾包括PCR和CE。
29. 权利要求27所述的方法，其中PCR才;U勾包含在与所迷多个免疫捕皿 室相分离的腔室中。
30. 权利要求29所述的方法，其中所述多个DNA分析才;U勾包括PCR的腔室， 用于扩增^MJ斤需目标物IU^所得到的DNA。
31. 权利要求29所述的方法，进一步包括多个蚀刻的毛细管电泳孩腿道， 用于分离和4&则PCR扩增子。
32. 权利要求31所述的方法,进一步包括多个城的DNA预鹏/纯化腔室， 用于纯^#放的病原体基因组DNA,或者在注入CE微通iUi之前用于脱盐， 浓缩扩增的DNA。
33. 权利要求27所述的方法，其中所述免疫捕获腔室进一步可用于纯化和 浓缩目标物。
34. 权利要求27所述的方法，其中所述多个微细加工的免疫捕获腔室被制 成以^#着所选择的抗体。
35. 权利要求34所述的方法，其中所选择的抗体由微珠、熔块、溶胶^l交、 鄉交、或者聚^4勿^^件所##。
36. 权利要求34所述的方法，其中所选择的抗体由直接形M捕自室内 的多孔、表面功能化聚^4勿成型块州緣。
37. —种用于检测病原体的设备，该设备包括通过|1^*装置上的微:^空通道将流体分析物提供给多个免疫捕， 室的装置；用于捕获与所述流体分析物相关的目标物的装置；以及 利用与多个免疫捕l^空室相伴随的多个DNA分析机构对所述目标物进行DNA 分析的装置，所述多个DNA分析;f/^勾M在所述M装置上。
全文摘要
本发明提供了用于实现微流控分析装置的方法和设备。与集成的充气集管相伴随的整体弹性膜件可以设置有和驱动多种流控结构的密集阵列，例如用于隔离、选路、混合、分流和存储流体量的结构。该流控结构可用于实施病原体的监测和分析系统，包括集成式免疫亲和性捕获和分析，例如聚合酶链式反应(PCR)和毛细管电泳(CE)分析。将分析物溶液引入并且泵压通过微细加工腔室中的一系列免疫亲和性捕获基质，其中具有靶向各类微生物有机体的抗体，例如细菌、病毒和细菌芽孢的抗体。该免疫亲和性腔室能够捕获、纯化和富集目标物以便进行进一步的分析步骤。
文档编号C12M1/34GK101613660SQ20091016047
公开日2009年12月30日 申请日期2003年12月29日 优先权日2002年12月30日
发明者A·斯克利, B·佩格尔, C·N·刘, E·拉加利, R·A·马蒂斯, R·布拉泽, W·H·格罗弗 申请人:加州大学评议会