人血管生成素-2的特异结合剂的制作方法

专利名称：：人血管生成素-2的特异结合剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及识别血管生成素-2(Ang-2)并且与之结合的特异结合剂。更具体地说，本发明涉及特异性结合Ang-2的所述特异结合剂及其片段的制备，诊断用途，和治疗用途。
背景技术：
：血管发生，从存在的血管生成新的血管，对于很多生理和病理过程都是比需的。一般来说，血管发生由血管生成因子原和抗血管生成因子严格调节，但是在象癌症，眼新血管病，关节炎，和牛皮癣这样的疾病的情况下，该过程可能错误进行。Folkman，J.，Nat.Med.，1:27-31(1995)。有很多种疾病已知与不受调节的或者不期望的血管发生相关。这样的疾病包括但不限于，眼新血管形成，例如视网膜病(包括糖尿病视网膜病)，与年龄有关的黄斑变性，牛皮癣，成血管瘤(hemangioblastoma)，血管瘤，动脉硬化，炎性疾病，例如类风湿性或风湿性炎症，尤其是关节炎(包括类风湿性关节炎)，或者其他慢性炎症，例如慢性哮喘，动脉粥样硬化或者移植后动脉粥样硬化，子宫内膜异位，和瘤，例如所谓的实体瘤和液体(或血液)肿瘤(例如白血病和淋巴瘤)。与不期望的血管发生相关的其他疾病对于那些本领域技术人员是显而易见的。虽然很多信号转导系统在血管发生的调节中涉及，但是表征得最充分并且最具内皮细胞选择性系统之一涉及Tie-2受体酪氨酸激酶(称作〃Tie-2〃或〃Tie-2R〃(也称作〃0RK〃)；鼠Tie-2也称作〃tek〃)及其配体，血管生成素(Gale，N.W.和Yancopoulos，G.D.，GenesDev.13:1055-1066[1999])。有四种已知的血管生成素；血管生成素-l("Ang-1〃)至血管生成素-4("Ang-4〃)。这些血管生成素也称作〃Tie-2配体〃(Davis，S.，等，Cel1，87:1161-1169[1996];Grosios，K.，等，CytogenetCellGenet，84:118-120[1999];Holash，J.，等，InvestigativeOphthalmology&VisualScience,42:1617-1625[1999];Koblizek，T.I.，等，CurrentBiology,8:529-532[1998];Lin，P.，等，ProcNatlAcadSciUSA，95:8829-8834[1998];Maisonpierre，P.C.，等，Science,277:55-60[1997];Papapetropoulos，A.，等，LabInvest,79:213-223[1999];Sato，T.N.，等，Nature,375:70-74[1998];Shyu，K.G.，等，Circulation,98:2081-2087[1998];Suri，C.，等，Cell,87:1171_1180[1996];Suri，C.，等，Science,282:468-471[1998];Valenzuela，D.M.，等，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUSA，96:1904-1909[1999];Witzenbichler，B.，等，JBiolChem，273:18514-18521[1998])。Ang-1与Tie-2结合剌激培养的内皮细胞中的受体磷酸化作用，发现Ang-2剌激和拮抗Tie-2受体磷酸化作用(Davis，S.，等，[1996]，上文；Maisonpierre，P.C.，等，[1997]，上文；Kim，I.，J.H.Kim，等，Oncogene19(39):4549-4552(2000);Teichert-Kuliszewska，K.，P.C.Maiso即ierre，等，CardiovascularResearch49(3):659-70(2001))。小鼠Tie-2和Ang-1敲除物的表型是类似的并且提示Ang-l-剌激的Tie_2磷酸化作用通过保持内皮细胞-支持细胞附着而介导子宫中发育血管的改变和稳定(D翻nt，D.J.，等，Genes&Development，8:1897-1909[1994];Sato，T.N.，等，Nature,376:70-74[1995];Suri，C.，等，[1996]，上文)。认为Ang-1在血管稳定中的作用在成年人中是保守的，而且广泛而基本性表达(Hanahan，D.，Science,277:48-50[1997];Zagzag，D.，等，ExperimentalNeurology,159:391-400[1999])。相反，Ang_2表达主要限于血管改造部位，认为在那里阻断Ang-1功能，从而诱导有益于血管发生的血管可塑性状态(Hanahan，D.，[1997]，上文；Holash，J.，等，Science,284:1994-1998[1999];Maisonpierre，P.C.，等，[1997]，上文)。很多公开的研究支持证明病态血管_选择性Ang-2表达与血管发生有关。这些病理学情况包括，例如，牛皮癣，黄斑变性，和癌症(Bunone，G.，等，AmericanJournalofPathology,155:1967-1976[1999];Etoh，T.，等，CancerResearch,61:2145-2153[2001];Ha卿i，M.，等，InvestigativeOphthalmology&VisualScience,42:1617-1625[2001];Holash，J.，等，[1999]上文；Kuroda，K.，等，JournalofInvestigativeDermatology,116:713_720[2001];Otani，A.，等，InvestigativeOphthalmology&VisualScience,40:1912-1920[1999];Stratmann，A.，等，AmericanJournalofPathology，153:1459-1466[1998];Tanaka，S.，等，JClinInvest,103:34-345[1999];Yoshida，Y.，等，InternationalJournalofOncology，15:1221-1225[1999];Yuan，K.，等，JournalofPeriodontalResearch,35:165-171[2000];Zagzag，D.，等，[1999]上文)。这些研究大多数聚焦在癌症上，其中很多癌症类型表现出显示血管Ang-2表达。与在病理性血管发生中的表达相反，正常组织中Ang-2表达十分有限(Maisonpierre，P.C.，等，[1997]，上文；Mezquita，J.，等，BiochemicalandBiophysicalResearchComm皿ications，260:492-498[1999])。在正常成年人体内血管发生的三个主要部位是卵巢，胎盘，和子宫；这些是其中检测到Ang-2mRNA的正常(即，非癌)组织中主要组织。—些功能研究提示Ang-2可能在肿瘤血管发生中涉及。Ahmad等(CancerRes.，61:1255-1259[2001])描述Ang-2超量表达并且支持性证明这与小鼠异种移植模型中肿瘤生长增加有关。也参见Etoh等，上文，和Tanaka等，上文，其中给出支持Ang_2超量表达与肿瘤血管过多相关的数据。但是，相反，Yu等(Am.J.Path.，158:563-570[2001])报道数据支持证明Lewis肺癌和TA3乳房癌细胞中Ang-2超量表达延长用相应的转染子注射的小鼠的存活。在过去的几年中，很多出版物提出Ang-l，Ang-2和/或Tie_2可能是抗癌治疗的耙物。例如，美国专利Nos.6，166，185，5，650，490，和5，814，464各自公开了抗_Tie_2配体抗体和受体的概念。Lin等(Proc.Natl.Acad.SciUSA，95:8829-8834[1998])对小鼠注射腺病毒表达可溶Tie-2;声称可溶Tie-2减小小鼠产生的肿瘤的数目和大小。在最近的研究中，Lin等(J.CLin.Invest.，100:2072-2078[1997])对大鼠注射可溶形式的Tie_2;声称这种化合物减小大鼠的肿瘤大小。Siemeister等(CancerRes.，59:3185-3189[1999])制备出表达Tie-2胞外结构域的人黑素瘤细胞系，对裸鼠注射这些细胞系，得出结论声称可溶Tie-2导致肿瘤生长和肿瘤血管发生的〃显著抑制〃。从这个信息看，并且已知Ang-l和Ang-2都结合Tie-2，从这些研究不能清楚地看出iAng-l，Ang-2，或Tie_2会是抗癌治疗的有吸引力的靶物。提高这些分子的半寿期的一些肽与稳定的血浆蛋白例如Ig恒定区的融合体描述于，例如，PCT公开W000/24782,2000年5月4日公开。先前描述过提高分子半寿期的一种蛋白质或者其片段与一种稳定的血浆蛋白质例如Ig恒定区的融合体(例如，实施例，美国专利No.5，480，981;Zheng等，J.Immunol.，154:5590-5600，(1995);Fisher等，N.Engl.J.Med.，334:1697-1702，(1996);VanZee，K.等，J.Immunol.，156:2221-2230，(1996);美国专利No.5，808，029，1998年9月15日公开；C即on等，Nature,337:525-531，(1989);Harvill等，Immunotech.，1:95-105，(1995);W097/23614，1997年7月3日公开；PCT/US97/23183，filedDec.11，1997年12月11日申i青;Linsley，J.Exp.Med.，174:561-569，(1991);W095/21258，1995年8月10日公开)。有效的抗-Ang-2疗法可能使大量的癌症患者受益，因为大多数实体肿瘤需要新血管化生长直径超过1-2毫米。这样的疗法对其他与血管发生相关的疾病例如视网膜病，关节炎和牛皮癣有广泛的应用。对于特异性识别并结合Ang-2的新的药物有着未开发的需求。这样的药物将有用于对与Ang-2活性相关的病态的诊断筛选和治疗干预。因此，本发明的一个目的是提供调节Ang-2活性的Ang-2的特异结合剂。本发明这样的药物采取肽抗体(p印tibodies)形式，即，与其他分子例如抗体的Fc结构域融合的肽，其中肽部分特异性结合Ang-2。本发明概述在一个实施方案中，本发明涉及结合Ang-2的肽(在这里也称作多肽)。本发明还包括这样的肽的变体和衍生物。在另一个实施方案中，本发明的肽和其变体和衍生物与载体连接。在另一个实施方案中，所述肽可以和Fc结构域融合，从而提供肽抗体。任选地，所述肽抗体包括例如SEQIDN0:3-SEQIDN0:6，或SEQIDNO:76_SEQIDN0:157，以及其变体和衍生物的至少一种肽。此外，所述肽可以包括根据SEQIDN0:65-SEQIDN0:75，和SEQIDN0:158所示的结构式的至少一种肽。在另一个实施方案中，本发明提供编码特异结合剂，和其变体和衍生物的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供编码肽抗体，和其变体和衍生物的核酸分子。任选地，所述核酸分子包括SEQIDN0:33-SEQIDNO:53。在另一个实施方案中，本发明提供通过对需要的受试者施用有效量的特异结合剂而减小肿瘤的方法。本发明还提供抑制受试者血管发生的方法，包括对需要的受试者施用有效量的特异结合剂。本发明进一步提供治疗受试者癌症的方法，包括对需要的受试者施用有效量的特异结合剂。本发明还涉及能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，其中所述多肽包括氨基酸序列WDPWT(SEQIDNO:65)，并且其中所述多肽长度5-50个氨基酸。所述多肽还包括氨基酸序列WDPWTC(SEQIDNO:66)以及其生理可接受盐。另外，所述多肽可以包括氨基酸序列Cz2WDPWT(SEQIDNO:67)其中z2是酸性或中性极性氨基酸残基，以及其生理可接受盐。所述多肽可以进一步包括氨基酸序列Cz2WDPWTC(SEQIDNO:68)其中z2是酸性或中性极性氨基酸残基，以及其生理可接受盐。在另一个实施方案中，本发明涉及能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，包括下式的氨基酸序列aVa3Ca5WDPWTCa1231V4(SEQIDNO:69)其中a1，a2，和a3各自独立地是氨基酸残基；a5是氨基酸残基；a12不存在或者是氨基酸残基；a13不存在或者是中性疏水性，中性极性的，或者碱性氨基酸残基；a"是中性疏水性或中性极性氨基酸残基。在优选的实施方案中a丄是V，I，P，W，G，S，Q，N，E，K，R，或H;a2是V，P，M，G，S，Q，D，E，K，R，或H;a3是A，V，P，M，F，T，G，D，E，K，或H;a8是A，V，G，Q，N，D，或E;a12是S，Q，N，D，E，K，或R;a"是L，T，或H;禾口a"是V，L，I，W，或M。在更优选的实施方案中，a1是Q;a2是E;a3是E;a5是D或E;a12是D或E;a13是H;禾口a丄4是M。要明白在这里使用带有角注的小写字母(例如^和b1)意在鉴别氨基酸位置，不是意指给定氨基酸的单字母縮写。在这里用大写字母表示单字母氨基酸縮写。本发明进一步涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受bVbVbVCbSWDPWTCb'WWV^SEQIDNO:70)其中b1不存在或者是氨基酸残基；b2不存在或者是中性疏水的，中性极性的，或者碱性氨基酸残基；b3，b4，b5，和b6各自独立地不存在或者是氨基酸残基；b8是氨基酸残基；b15不存在或者是氨基酸残基；b16不存在或者是中性疏水的，中性极性的，或者碱性氨基酸残基；b17不存在或者是中性疏水的或中性极性氨基酸残基；1318，1319，和132°各自独立地不存在或者是氨基酸残基。在优选的实施方案中b1不存在，或者是A，V，L，P，W，F，T，G，S，Q，N，K，R，或H;b2不存在，或者是A，V，L，I，P，W，M，T，G，S，Y，N，K，R，或H;b3不存在，或者是A，L，I，P，W，M，T，G，S，Q，N，E，R，或H;b4是V，I，P，W，G，S，Q，N，E，K，R，或H;b5是V，P，M，G，S，Q，D，E，K，R，或H;b6是A，V，P，M，F，T，G，D，E，K，或H;b8是A，V，G，Q，N，D，或E;b15是S，Q，N，D，E，K，或R;b"是L，T，或H;b"是V，L，I，W，或M;b18不存在，或者是A，V，L，P，W，F，T，G，Y，Q，D，E，或R;b^不存在，或者是V，L，I，P，T，G，S，Y，Q，N，D，E，或R;并且b2°不存在，或者是V，L，P，W，M，T，G，S，Y，Q，N，D，K，或R。在更优选的实施方案中，b1不存在，或者是P，或T;b2不存在，或者是I，或N;b3不存在，或者是R，或I;b4是Q;b5是E;b6是E;b8是D或E;b15是D或E;b16是H;b17是M;b18不存在，或W，或P;b19不存在，或G，或E;和b2°不存在，或V，或K。还明白本发明优选涉及包括选自SEQIDN0:4，和SEQIDNO:76至SEQIDNO:118的至少一种氨基酸序列的多肽以及其生理可接受盐，其中包含的多肽能结合Ang-2。下面给出肽序列表1肽SEQIDNO.肽序列Con4-4476PIRQEECDWDPWTCE丽EVCon4-4077TNIQEECEWDPWTCDHMPGKCon4-478WYEQDACEWDPWTCE薩EVCon4-3179NRLQEVCEWDPWTCEHMENVCon4-C580AATQEECEWDPWTCEHMPRSCon4-4281LRHQEGCEWDPWTCEHMFDWCon4-3582VPRQKDCEWDPWTCEHMYVGCon4-4383SISHEECEWDPWTCEHMQVGCon4-4984WAAQEECEWDPWTCEHMGRMCon4-2785TWPQDKCEWDPWTCEHMGSTCon4-4886GHSQEECGWDPWTCEHMGTSCon4-4687QHWQEECEWDPWTCDHMPSKCon4-4188NVRQEKCEWDPWTCEHMPVRCon4-3689KSGQVEC丽DPWTCEHMPRNCon4-3490VKTQEHCDWDPWTCEHMREWCon4-2891AWGQEGCDWDPWTCEHMLPMCon4-3992PVNQEDCEWDPWTCEHMPPMCon4-2593RAPQEDCEWDPWTCAHMDIKCon4-5094HGQNMECEWDPWTCEHMFRYCon4-3895PRLQEECVWDPWTCEHMPLR13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>*要明白一些肽和/或肽抗体可以包含前缀〃TN〃，〃TN8〃，或〃TN12"，对于给定的肽抗体这个前缀可以存在或不存在。这样，例如，术语〃TN8-Con4〃和〃Con4〃在这里可互换使用。在另一个实施方案中本发明涉及具有下式的物质成分(compositionofmatter)及其多聚体(XVFDb其中F'是载体；X'和f各自独立地选自-(L1)c-P1;—(L0c-P^(L2)d-P2;-(L1)c—P1-(L2)d_P2-(L3)e-P3;禾口-(L1)c—P1-(L2)d_P2-(L3)e-P3-(L4)f_P4;其中P、P、P和PA的一个或多个各自独立地包括这里描述的多肽。例如，在优选的实施方案中，P、P2，P3，和P4能各自独立地包括SEQIDNO:3至SEQIDN0:6，和/或SEQIDNO:76至SEQIDNO:157的多肽。在另一个优选的实施方案中，物质成分是下式X丄-F1或F丄-Y2及其生理可接受盐，其中X1，F1，和X2如这里所定义。在另一个实施方案中，物质成分是下式F1-(L1)c-P1及其生理可接受盐，其中L1，F1，和P1如这里所定义。在另一个实施方案中，物质成分是下式F1-(L1)c—P1-(L2)d-P2及其生理可接受盐，其中L1，F1，P1，P，和c和d如这里所定义。在另一个实施方案中，物质成分是下式F1-(L1)c—F1-(L2)d_P2及其生理可接受盐。在优选的实施方案中，F1是其片段的Fc结构域。本发明进一步涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受Pc2Dc4LcVc8LY(SEQIDNO:71)其中c2是中性疏水氨基酸残基c4是A，D，或E(36是酸性氨基酸残基c7是酸性氨基酸残基；并且c8是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基。在优选实施方案中，c2是L或M。在另一个优选实施方案中，c6是D或E。本发明进一步涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受dMMWPcfDdSLcrdncPLYd15d16d17d18d19d2°d21d22(SEQIDNO:72)其中，d1不存在，或者是氨基酸残基；d2不存在，或者是中性极性，酸性，或碱性氨基酸残基；d3不存在，或者是中性疏水性或中性极性氨基酸残基；W不存在，或者是氨基酸残基；d6是中性疏水氨基酸残基；d8是A，D，或E;cT是酸性氨基酸残基；d"是氨基酸残基；d12是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基；d15不存在，或者是中性极性，酸性，或碱性氨基酸残基；d"不存在，或者是中性极性，酸性，或碱性氨基酸残基；d"不存在，或者是中性疏水，或中性极性氨基酸残基；d"不存在，或者是中性疏水，或中性极性氨基酸残基；d19不存在，或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基；d2°不存在，或者是氨基酸残基；d21不存在，或者是中性疏水，酸性，或碱性氨基酸残基；(122不存在，或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基。在优选的实施方案中d1是T，S，Q，R，或H;d2是T，Q，N，或K;cP是F;d4是M，Q，E，或K;d6是L或M;d8是D或E;cT是E;d"是Q或E;cP是T或R;d"是Y，D，E，或K;d化是Q;d"是W或F;d"是L，I，M，或T;c^9是L，F，或Y;(T是Q，D，或E;cP不存在，或者是Q，或H;cP不存在，或者是A，L，G，S，或R.在优选的实施方案中，下面给出包括选自SEQIDN0:6，和SEQIDN0:119至SEQIDNO:142的至少一种氨基酸序列的多肽，其中包含的多肽能结合Ang-2，以及其生理可接受盐。下面给出SEQIDNO:6，禾PSEQIDNO:119-142:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>肽SEQIDNO.肽序列Ll-15131QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQGLl-16132QKFQPLDELEETLYKQWTLQQRLl-17133VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQLl-18134QKFMPLDELDEILYEQFMFQQSLl-19135QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYHLl-20136EDYMPLDALDAQLYEQFILLHGLl-21137HTFQPLDELEETLYYQWLYDQLLl-22138YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHAAC6-L1139TNYKPLDELDATLYEHWILQHSLl-Cl140QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQRL1-C2141TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQRL1-C3142TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR6KFNPLDELEETLYEQFTFQQ本发明还涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受盐RpeVe5e6e7G(SEQIDNO:73)其中e3是中性极性氨基酸残基；e4是酸性极性氨基酸残基；e5是中性极性或酸性氨基酸残基；e6是中性疏水氨基酸残基；J是中性疏水氨基酸残基。在优选的实施方案中，^是Y或C。在另一个优选的实施方案中，e4是D或E。在另一个优选的实施方案中，e6是I或M。本发明进一步涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受fif2f3f4Rpf7f8f9fl。fllGfl3fl4fl5fl6fl7fl8fl9f2。(seqidN0:74)其中，f1是中性疏水或中性极性氨基酸残基；f2是中性疏水或中性极性氨基酸残基；f3是中性极性或酸性氨基酸残基；f4是中性疏水或中性极性氨基酸残基；f7是中性极性氨基酸残基；f8是酸性氨基酸残基；f9是中性极性或酸性氨基酸残基；f1Q是中性疏水氨基酸残基；f11是中性疏水氨基酸残基；f13是中性疏水或中性极性氨基酸残基；f14是中性疏水或中性极性氨基酸残基；f15是中性极性氨基酸残基；f16是中性极性氨基酸残基；f17是中性极性或酸性氨基酸残基；f18是中性疏水或碱性氨基酸残基；17f19是中性疏水或中性极性氨基酸残基；并且f2Q是中性疏水或中性极性氨基酸残基。在优选的实施方案中f是S，A，或G;f2是G，Q，或P;f3是Q，G，或D;f4是L，M，或Q;f7是C或Y;f8是E或D;f9是E，G，或D;f"是I或M;f"是F或L;f"是C或W;f"是G或P;f"是T或N;f化是Q，Y，或K;f"是N，D，或Q;严是L，V，W，或R;严是A，Q，Y，或I;并且f20是L，A，G，或V。在更优选的实施方案中，本发明涉及包括选自SEQIDN0:3，和SEQIDNO:143至SEQIDN0:148的至少一种氨基酸序列的多肽，及其生理可接受盐，其中所述多肽能结合Ang-2。SEQIDN0:3，和SEQIDNO:143至SEQIDN0:148如下。肽SEQIDNO.肽序列Conl-1143AGGMRPYDGMLGWPNYDVQAConl-2144QTWDDPCMHILGPVTWRRCIConl-3145APGQRPYDGMLGWPTYQRIVCon1-4146SGQLRPCEEIFGCGTQNLALConl-5147FGDKRPLECMFGGPIQLCPRConl-6148GQDLRPCEDMFGCGTKDWYGConl3KRPCEEIFGGCTYQ另一方面，本发明涉及能结合Ang-2的包括下式的氨基酸序列的多肽及其生理可接受盐Cg2Gg4g5DPFTg10GCg13(SEQIDNO:75)其中^是酸性氨基酸残基；g4是中性疏水氨基酸残基；g5是E，D，或Q;g1Q是中性疏水或中性极性氨基酸残基；g"是酸性残基。在优选的实施方案中，g2是E或D。在另一个优选的实施方案中，18^是V或M。在另一个优选的实施方案中，g"是F或Q。在另一个实施方案中，g"是D或E。本发明进一步涉及能结合Ang-2的包括下式氨基酸序列的多肽及其生理可接受hVhVCheGhVDPFThMGCWVVV0,IDNO:158)其中，h1不存在或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基；h2是中性疏水或中性极性氨基酸残基；h3是酸性氨基酸残基；h4是中性疏水或中性极性氨基酸残基；h6是酸性氨基酸残基；h8是中性疏水氨基酸残基；h9是E，D，或Q;h14是中性疏水或中性极性氨基酸残基；h17是酸性氨基酸残基；h18是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基；h19是中性疏水或中性极性氨基酸残基；禾口h2°不存在或者是氨基酸残基。在优选的实施方案中，h1不存在或者是A，L，M，G，K，或H;h2是L，F，或Q;h3是D或E;h4是W或Y;h6是D或E;h8是V或M;h14是F或Q;h17是D或E;h18是M，Y，N，或K;h19是L或Q;禾口h20不存在或者是M，T，G，S，D，K，或R。在更优选的实施方案中，本发明涉及包括选自SEQIDN0:5，或SEQIDNO:149至SEQIDNO:157的至少一种氨基酸序列的多肽，和其生理可接受盐，其中所述多肽能结合Ang-2。SEQIDN0:5，和SEQIDNO:149至SEQIDNO:157如下。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在高度优选的实施方案中，本发明涉及具有下式的物质成分及其多聚体；及其生理可接受盐(XVfMX其中F1是载体；X'和f各自独立地选自-(L1)s-P1;-(LOs-P'-O^t-P2;-(L1)s—P1-(L2)t_P2-(L3)U-P3;并且-(L1)s—P1-(L2)t_P2-(L3)U-P3(L4)V_P4;其中P1，P2，P和P4中的一个或多个各自独立地包括选自下组的多肽(a)氨基酸序列WDPWT(SEQIDNO:65)，其中所述多肽长度是5-50个氨基酸；(b)氨基酸序列WDPWTC(SEQIDNO:66);(c)氨基酸序列Cz2WDPWT(SEQIDNO:67)，其中z2是酸性或中性极性氨基酸残基；(d)氨基酸序列Cz2WDPWTC(SEQIDNO:68)，其中z2是酸性或中性极性氨基酸残基；(e)氨基酸序列Pc2DC4Lc6C7C8LY(SEQIDNO:71)，其中c2是中性疏水氨基酸残基；(^是A，D，或E;c6是酸性氨基酸残基；c7是氨基酸残基；c8是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基；(f)氨基酸序列RpeVeWG(SEQIDNO:73)，其中e3是中性极性氨基酸残基；e4是酸性氨基酸残基；e5是中性极性或酸性氨基酸残基；e6是中性疏水氨基酸残基；67是中性疏水氨基酸残基；(g)氨基酸序列Cg2Gg4g5DPFTgCg13(SEQIDNO:75)，其中g2是酸性氨基酸残基；g4是中性疏水氨基酸残基；g5是中性极性或酸性氨基酸残基；g1Q是中性疏水或中性极性氨基酸残基和；g"是酸性残基；(h)SEQIDNO:1的多肽；(i)SEQIDNO:2的多肽；并且(j)SEQIDNO:7的多肽;其中L1，L2，L和L4各自独立地是连接体；并且q，r，s，t，u，和v各自独立地是0或1，前提是q和r中至少一个是。可以明白本发明进一步涉及包括这里描述的至少一种肽和载体的融合多肽，及其生理可接受盐，其中所述融合多肽能结合Ang-2。在融合多肽中，载体优选是至少一个Fc结构域，聚乙二醇，脂质，胆固醇基团，糖类，和寡糖。本领域技术人员明白其他合适的载体，例如白蛋白等，都包括在本发明的范围内。本领域技术人员认识到能将各种各样的分子插入特异结合剂结构中。因此，给定的分子能被插入，例如，肽和特异结合剂的载体部分之间，或者插入到肽本身部分中，同时保持特异结合剂的期望的活性。人们能够容易地插入例如象下面的分子，例如Fc结构域或者其片段，聚乙二醇或其他相关的分子，例如葡聚糖，脂肪酸，脂质，胆固醇，小的碳水化合物，肽，细胞毒性物质，化学治疗药物，这里描述的可检测部分(包括荧光剂，放射标记例如放射性同位素)，寡糖，寡核苷酸，多核苷酸，干涉(或其他)RNA，酶，激素，或者类似物。本领域技术人员明白适合在这种形式中插入的其他分子，并且包括在本发明的范围内。这包括例如在两个连接的氨基酸之间插入期望的分子，任意地连接合适的连接体。作为例子，在Con4(C)肽抗体序列中M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE(SEQIDNO:23)本领域技术人员容易例如在两个相邻谷氨酰胺(〃QQ〃)残基之间插入期望的分子来实现期望的结构和/或功能，同时保留肽结合Ang-2的能力。因此，这个序列可以如下进行修饰M-Fc-GGGGGAQ-[分子]-QEECEWDPWTCEHMLE如果期望，能加入合适的连接体分子。进一步明白在分子的很多位置能插入分子，包括在合适的侧链上，如下在载体和肽序列之间M-Fc-[分子]-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE或者在本领域技术人员期望的任何其他位置中插入。其他合适的实施方案对于本领域技术人员是显而易见的。在另一个实施方案中，本发明涉及这里描述的编码本发明的特异结合剂(包括但不限于肽和/或肽抗体)的多核苷酸。本领域技术人员明白在氨基酸序列已知的情况下，应用公知技术能容易地测定相应的核苷酸序列。参见，例如Suzuki,D.，AnIntroductiontoGeneticAnalysis，W.H.FreemanPub.Co.(1986)。下面给出编码本发明的肽的举例的核苷酸序列。本领域技术人员认识到多于一个的密码子能编码给定氨基酸，因此本发明涉及编码本发明的肽和/或肽抗体的任何核苷酸序列。肽序列鉴定号肽序列举例的DNA序列C。n4-4476PIRQEECDWDPWTCEHMWEVccgalccgtc3ggaagaMgcg3ctgggax;ccgtggax;ctgcgaacax;algtgggaagtt(SEQIDNO159)C。n4-4077TNIQEECEWDPWTCDHMPGKax;caacalcc3ggaagaMgcg3atgggax;ccgtggax;ctgcgax;cax;algccgggtaaaXSEQIDNO160)C。n4-478WYEQDACEWDPWTCEHMAEVtggtax;g3ac3ggax;gcttgcg3algggax;ccgtggax;ctgcgaacax;alggctgaagtt(SEQIDNO161)C。n4-3179亂QEVCEWDPWTCEHMENVaaccgtctgcaggaagtttgcgaatgggax;ccgtggax;ctgcgaac3calggaaaacgtt(SEQIDNO162)C。n4-C580MTQEECEWDPWTCEHMPRSgctgctax;cc3ggaagaMgcg3atgggax;ccgtggax;ctgcgaacax;algccgcgttcc(SEQIDNO163)C。n4-4281LRHQEGCEWDPWTCEHMFDWctgcgtcax;c3ggaaggttgcg3atgggax;ccgtggax;ctgcgaacax;algttcgax;tgg(SEQIDNO164)Con4-3582VPRQKDCEWDPWTCEHMYVGgttccgcgtcagaa^gactgcgaatgggacccgtggacctgcg貼cacatgtacgttggt(SEQIDNO165)Con4-4383SISHEECEWDPWTCEHMQVGtccatctcccacga^gaatgcga^tgggacccgtggacctgcg貼cacatgcaggttggt(SEQIDNO360)Con4-4984WMQEECEWDPHTCEHMGRMtgggctgctca^g貼g貼tgcga^atgggatccgtgga^ttgcg貼c3catgggtcgtatg(SEQIDNO166)Con4-2785TWPQDKCEWDPWTCEHMGSTscttggccgcaggaca^atgcgaatgggatccgtggacttgcg貼cacatgggttctact(SEQIDNO167)Con4-4886GHSQEECGWDPWTCEHMGTSggtcactcccagga^gaatgcggttgggacccgtggacctgcg貼cacatgggtacgtcc(SEQIDNO168)Con4-4687QHWQEECEWDPWTCDHMPSKcagcactggcagg貼gaatgcgaatgggacccgtggacctgcgaccacatgccg"tcc貼aXSEQIDNO169)Con4-4188NVRQEKCEWDPWTCEHMPVRa^cgttcgtcagga^a^atgcga^tgggacccgtggacctgcg貼cacatgccggttcgt(SEQIDNO170)Con4-3689KSGQVEC,PWTCEHMPRNa^atccggtcaggttgaatgca^ctgggacccgtggacctgcg貼cacatgccgcgt貼c(SEQIDNO171)Con4-3490VKTQEHCDWDPWTCE證EWgtt貼a^cccagga^cactgcgactgggacccgtggacctgcg貼cacatgcgtg貼tgg(SEQIDNO172)Con4-2891AWGQEGCDWDPWTCE亂PMgcttggggtca^g貼ggttgcg3ctggga^ccgtgga^cctgcg貼c加atgctgccgatg(SEQIDNO173)Con4-3992PVNQEDCEWDPWTCEHMPPMccggtt貼ccagga^gactgcgaatgggacccgtggacctgcg貼cacatgccgccgatg(SEQIDNO:174)Con4-2593RAPQEDCEWDPWTC歷DIKcgtgctccgcagga^gactgcgaatgggacccgtggacctgcgctcacatggacatc貼aXSEQIDNO:175)Con4-5094HGQNMECEWDPWTCEHMFRYcacggtcaga^catggaatgcgaatgggacccgtggacctgcg貼cacatgttccgttac(SEQIDNO:176)Con4-3895PRLQEECWDPWTCEHMPLRccgcgtctgcagga^gaatgcgtttgggacccgtggacctgcg貼cacatgccgctgcgt(SEQIDNO:177)Con4-29%RTTQEKCEWDPWTCEHMESQcgtaccacccagga^貼atgcgaatgggacccgtggacctgcga^cacatggaatcccag(SEQIDNO:178)21<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>gaagacccgttcaccttcggttgcgaaaaacagcgt(SEQIDNO:235)12-9-CI157LQDYCEGVEDPFTFGCEKQRctgcaggactactgcgaaggtgttgaagacccgttcaccttcggttgcgaaaaacagcgt(SEQIDNO:241)12-95FDYCEGVEDPFTFGCDNHttcgactactgcgaaggtgttgaagacccgttcactttcggctgtgataaccac(SEQIDNO:242)在另一个实施方案中，本发明涉及包括至少一个本发明的多核苷酸的表达载体。在另一个实施方案中，本发明涉及包括该表达载体的宿主细胞。明白宿主细胞优选是原核细胞(例如大肠杆菌细胞)或真核细胞。本发明还涉及含有与药学可接受载体混合的有效量的这里描述的成分的药物组合物。本发明还涉及抑制哺乳动物不期望的血管发生的方法，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物。本发明还涉及调节哺乳动物血管发生的方法，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物。本发明还涉及抑制哺乳动物不期望的血管发生为特征的肿瘤生长的方法，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物。另外，本发明涉及治疗哺乳动物癌症的方法，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物，和化疗药物。在优选的实施方案中，所述化疗药物至少是5-FU，CPT-11，和脱乙酰基紫杉醇(Taxotere)中的一种。但是要明白也能使用其他合适的化疗药物和其他癌症疗法。本发明还涉及调节哺乳动物血管渗透性或血浆渗漏中至少一项的方法，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物。本发明进一步涉及治疗哺乳动物中以下病症中的至少一种的方法眼新血管病，肥胖，成血管瘤，血管瘤，动脉硬化，炎性疾病，炎性紊乱，动脉粥样硬化，子宫内膜异位，肿瘤性疾病，骨相关疾病，或者牛皮癣，包括施用治疗有效量的这里描述的多肽或组合物。可以明白本发明的特异结合剂能被用来治疗与失去调节的或不期望的血管发生相关的多种疾病。这样的疾病包括但不限于，眼新血管化，例如视网膜病(包括糖尿病视网膜病和与年龄相关的黄斑变性)，牛皮癣，成血管瘤，血管瘤，动脉硬化，炎性疾病，例如类风湿性或风湿性炎症，特别是关节炎(包括类风湿性关节炎)，或者其他慢性炎性紊乱，例如慢性哮喘，动脉或移植后动脉粥样硬化，子宫内膜异位，和肿瘤性疾病，例如所谓实体瘤和液体瘤(例如白血病)。通过施用特异结合剂能治疗的另外的疾病对于本领域技术人员是显而易见的。这样的另外的疾病包括但不限于肥胖，血管渗透，血浆渗漏，骨相关疾病，包括骨质疏松。因此，本发明进一步涉及治疗这些与失去控制或不期望的血管发生相关的疾病的方法。本发明的其他实施方案通过这里提供的公开内容容易变成显而易见的。附图的简要说明图1描述用本发明的肽抗体TN8-Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)治疗的携带A-431肿瘤的小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。图2小鼠肽抗体PK(50iig剂量)。描述用50微克剂量的2*Con4_C，Ll-7-N，或Ll-21-N肽抗体处理过的野生小鼠的肽抗体浓度(y-轴)对给药后时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。图3抗-Ang2肽抗体抑制A431肿瘤异种移植物生长。描述用根据本发明的肽抗体2Won4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)或对照肽抗体处理过的携带A431肿瘤的小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。图41mg/ml的抗_Ang2肽抗体对培养的A431细胞的生长没有影响。描述代表用23根据本发明的肽抗体Con4-C，对照肽抗体处理过的，或者未处理的培养的A431细胞的体外生长的曲线图。实施例中描述了详细情况。图5抗-Ang2肽抗体抑制Colo205肿瘤生长。描述用根据本发明的肽抗体Con4-C，肽抗体Ll-7-N，肽抗体Ll-21-N，或肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，抗-Ang_2抗体(Ab536)，或Fc处理过的Colo205肿瘤细胞的肿瘤体积(y_轴)对时间(x_轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。图6抗-Ang2肽抗体抑制Colo205肿瘤生长。描述用不同剂量的根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或Fc处理过的携带Colo205异种移植肿瘤小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。图7抗-Ang2肽抗体治疗减小Colo205肿瘤异种移植物的CD31-染色密度。描述用根据本发明的肽抗体2Won4-C，或者用对照肽抗体处理过的携带Colo205异种移植肿瘤小鼠肿瘤体积(y_轴)对时间(x-轴)的曲线图。图7还描述CD31染色面积/这些肽抗体总的肿瘤面积的曲线图。实施例中描述了详细情况。图8抗-Ang2Pbs抑制Colo205肿瘤生长，与何时开始给药无关。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或对照肽抗体处理过的携带Colo205异种移植肿瘤小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。该曲线图表明与何时开始给药无关，抗-Ang-2肽抗体能抑制Colo205肿瘤生长。图9长期给药研究中的完全反应率。描述对A431和Colo-205异种移植模型，使用抗体Ab536或者用肽抗体2Won4-C，从雌性裸鼠获得的完全反应(CR)率的总结。实施例中描述了详细情况。图10AColo205肿瘤模型中Pb与脱乙酰基紫杉醇的组合。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，2*Con4-C和脱乙酰基紫杉醇的组合，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或用PBS加脱乙酰基紫杉醇处理过的携带Colo205异种移植肿瘤小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。图10BColo205肿瘤模型中Pb与5_FU的组合。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，2*Con4-C和5-FU的组合，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或用PBS加5-FU处理过的携带Colo205异种移植肿瘤小鼠肿瘤体积(y-轴)对时间(x-轴)的曲线图。实施例中描述了详细情况。图11A佐剂-诱导的关节炎模型中抗_Ang2肽抗体抑制爪肿胀。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或用对照肽抗体处理过的大鼠佐剂诱导的关节炎模型，或者正常或关节炎对照物的爪肿胀水平(AUC+-SE)曲线图。实施例中描述了详细情况。图11B佐剂-诱导的关节炎模型中抗_Ang2肽抗体抑制骨矿物质密度减小。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或用对照肽抗体处理过的大鼠佐剂诱导的关节炎模型，或者正常或关节炎对照物的爪骨矿物质密度(BMD)曲线图。实施例中描述了详细情况。图11C佐剂-诱导的关节炎模型中抗-Ang2肽抗体对体重减轻的影响。描述用根据本发明的肽抗体2*Con4-C，或者用磷酸缓冲盐水(PBS)，或用对照肽抗体处理过的大鼠佐剂诱导的关节炎模型，或者正常或关节炎对照物的体重变化曲线图。实施例中描述了详细情况。图12C0N4-C肽抗体抑制VEGF-诱导的角膜血管发生。描述说明VEGF-诱导的大鼠角模血管发生的抑制作用的两个图。第一个图描述对用牛血清白蛋白(BSA)，VEGF加磷酸缓冲盐水(PBS)，或VEGF加本发明的肽抗体Con4-C处理过的大鼠测定的血管数目。第二个图说明用BSA，VEGF加磷酸缓冲盐水(PBS)，或VEGF加本发明的肽抗体Con4_C处理过的大鼠的血管面积。实施例中描述了详细情况。图13A，13B，和13C表位定位。描述分别在全长人Ang_2(hAng-2)，hAng-2的N-末端，和hAng-2的C-末端，对于根据本发明的肽抗体TN8-Con4-C，Ll-7-N，和12_9-3_C，以及对于对照肽抗体，Tie2-Fc，C2B8，或5B12的表位定位数据。实施例中描述了详细情况。图14描述利用S即idyneKinExA分析测定的根据本发明的2*Con-4_C肽抗体的结合亲和力(KD)。本发明的详细描述这里使用这部分的标题只是为了组织的目的，而不是为了在任何方面限制描述的主题。对于重组DNA分子，蛋白质，和抗体制备，以及对于组织培养和细胞转化可以应用标准技术。酶促反应和纯化技术一般根据厂商说明进行或者根据现有技术通常公开的使用常规方法进行，例如Sambrook等(分子克隆实验室手册"MolecularCloning:ALaboratoryMa皿al"冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.[1989])中给出的那些，或者根据这里描述的。除非提供具体的定义，这里描述的相关术语，试验方法和分析化学，合成有机化学，药学和药剂化学技术是本领域公知的和常规使用的。标准技术可以用于化学合成，化学分析，药物制备，制剂，和送递，和对患者的治疗。除非另外具体说明，贯穿说明书使用的术语如下定义。术语〃Ang-2〃指美国专利No.6，166，185的图6中给出的多肽(〃Tie_2配体-2〃)或者其片段以及相关的多肽，包括等位变体，剪接变体，衍生物，取代，缺失，和/或插入变体，融合肽和多肽，和种间同系物或者其片段。Ang-2多肽可以包括或可以不包括另外的末端残基，例如，前导序列，引导序列，氨基末端甲硫氨酸，和赖氨酸残基，和/或标记或融合蛋白序列，取决于制备它的方法。术语〃生物活性〃当与Ang-2或Ang-2特异性结合剂相关联使用时指具有Ang-2或Ang-2特异性结合剂的至少一种活性特征的肽或多肽。Ang-2的特异性结合剂就Ang-2的至少一种生物活性来说可以具有激动剂，拮抗剂，或中和或阻断活性。术语〃特异性结合剂〃指一种分子，优选蛋白质分子，其特异结合Ang-2，及这里定义的其变体和衍生物。一种特异性结合剂可以是一种蛋白质，肽，核酸，碳水化合物，脂质，或者优先与Ang-2结合的小分子量化合物。在优选的实施方案中，根据本发明的特异性结合剂是肽或肽抗体，以及其片段，变体或衍生物，或者单独地或者与其他氨基酸序列组合，是公知技术提供的。这样的技术包括但并不限于酶促裂解，化学裂解，肽合成或重组技术。本发明的抗-Ang-2特异性结合剂能结合Ang-2的部分，调节，例如，抑制或促进，Ang-2的生物活性和/或其他Ang-2-相关活性。这里使用的术语〃变体〃包括其中天然存在的(至少一种公知的)结合剂的氨基酸序列中的氨基酸残基被插入，缺失和/或取代的那些肽或多肽。本发明的变体包括如下所述的融合蛋白。〃衍生物〃包括以不同于插入，缺失或取代的变体的一些方式化学修饰的那些结合剂。〃特异性结合Ang-2〃指本发明的特异性结合剂(例如肽抗体，或者其肽部分)识别并结合成熟的，全长或部分长度的人Ang-2多肽或者其直向同源物的能力，这样其亲和力(根据例如这里描述的亲和力ELISA或BIAcore分析测定)或者其中和能力(根据这里描述的例如，中和作用ELISA分析或类似分析来测定)至少是相同的任何其他血管生成素或其他肽或多肽的亲和力或中和能力的大小的10倍，但是任意地是50倍，100,250或500倍，或者甚至至少1000倍，其中肽抗体的肽部分第一次与人Fc部分融合用于在这样的分析中评价。术语〃表位〃指在一个或多个结合剂的抗原结合区能被特异性结合剂例如肽抗体识别和结合的任何分子的部分。表位通常由化学活性表面分子基团例如氨基酸或糖基侧链组成，并且具有特异三维结构特征以及特异电荷特征。这里使用的表位可以是连续或不连续的。术语〃抑制和/或中和表位〃是一种表位，当被特异结合剂例如肽抗体结合时，它导致体内，体外，或者原位包含这样的表位的分子，细胞，或生物体的生物活性的丧失(或者至少降低)。在本发明的上下文中，中和表位位于Ang-2的生物活性区或者与Ang-2的生物活性区有关。或者，术语〃活性表位〃是一种表位，当被本发明的特异结合剂例如抗体结合时，导致Ang-2的生物活性构象激活，或者至少维持。术语〃肽抗体片段〃指肽或多肽，其包括完全完整肽抗体的部分。当与象核酸分子，多肽，宿主细胞等这样的生物材料相关使用时，术语〃天然存在的〃指在自然界发现的没有被人改变的那些。术语〃分离的〃当与Ang-2相关或与Ang-2的特异性结合剂相关的使用时，指没有至少一种其天然环境中发现的污染多肽或化合物的化合物，优选基本上没有会干扰其治疗或诊断用途的污染哺乳动物多肽。术语〃成熟〃当与Ang-2肽抗体或者其片段相关使用时，或者与Ang-2的其他蛋白质特异性结合剂相关使用时，指没有前导序列或信号序列的肽或多肽。在例如在原核宿主细胞中表达本发明的结合剂时，〃成熟〃肽或多肽还可以包括另外的氨基酸残基(但是仍然没有前导序列)，例如氨基末端甲硫氨酸，或者一个或多个甲硫氨酸和赖氨酸残基。可以使用用这种方法制备的肽或多肽，这些另外的氨基酸残基已经被去除或者没有被去除。术语〃有效量〃和〃治疗有效量〃与Ang-2的特异性结合剂相关使用时，指对于支持Ang-2的一种或几种生物活性水平可观察变化是有用的或必需的量。所述变化可以是Ang-2活性水平的提高或降低。优选地，所述变化是Ang-2活性水平的降低。术语〃肽抗体〃指包括与至少一种肽连接的抗体Fc结构域的分子。2000年5月4日公开的PCT公开W000/24782中一般性描述了肽抗体的制备。这里使用的术语〃变体〃包括例如肽或肽_载体化合物的那些分子，例如其中这样的分子的氨基酸序列中氨基酸残基被插入，缺失和/或取代的本发明的肽抗体。具有插入的一个或多个氨基酸的变体包括下面描述的融合蛋白。〃衍生物〃包括象以不同于插入，缺失或取代变体的一些方式化学修饰的肽抗体这样的那些肽和/或肽_载体化合物。术语〃片段〃指包括小于这样的肽和/或肽-载体化合物全长氨基酸序列的部分的肽和/或肽_载体化合物。这样的片段例如可以从所述肽或肽_载体化合物的氨基酸序列的氨基末端截短，羧基末端截短，和/或中间缺失一个残基而得到。从供选择的RNA剪接或者从体内或体外蛋白酶活性可以得到片段。通过化学肽合成方法，或者通过修饰编码肽，肽_载体化合物，或者肽抗体的Fc部分和/或肽部分的多核苷酸也可以构建这样的片段。术语〃Fc〃指本发明载体的一种类型，并且包括整个单体的蛋白分解消化得到的抗体的非抗原结合片段的序列，不管是单体形式还是多聚体形式。本发明中Fc来源优选是全人Fc，并且可以是任何免疫球蛋白，但是IgGl和IgG2是优选的。但是，这里也包括部分人Fc分子，或者从非人物种获得的Fc分子。Fc's由单体多肽构成，单体多肽可以通过共价键(即，二硫键)和非共价键连接成二聚体或多聚体形式。根据类别(例如，IgG，IgA，IgE)或亚类(例如，IgGl，IgG2，IgG3，IgAl，IgGA2)，天然Fc分子的单体亚基之间分子内二硫键的数目范围是1-4。天然Fc的一个例子是从IgG的木瓜蛋白酶消化得到的二硫键键合的二聚体[参见Ellison等(1982)，Nucl.Acids.Res.10:4071-9]。这里使用的术语"天然Fc〃一般是单体，二聚体，和多聚体。术语〃Fc结构域〃包括天然Fc和如上定义的Fc变体分子和序列。关于Fc变体和天然Fc's，术语〃Fc结构域〃包括单体或多聚体形式的分子，不管是从整个抗体消化而来还是其他方法制备的。术语〃多聚体〃对于Fc结构域或者包括Fc结构域的分子使用时，指具有共价，非共价，或者通过共价和非共价相互作用结合的两条或几条多肽链的分子。IgG分子典型地形成二聚体；IgM，五聚体；IgD，二聚体；和IgA，单体，二聚体，三聚体，或四聚体。通过开发序列并且得到Fc天然Ig源活性或者通过将这样的天然Fc衍生化(如下定义)可以形成多聚体。术语〃二聚体〃对于Fc结构域或者包括Fc结构域的分子使用时，指具有共价或非共价结合的两条多肽链的分子。术语〃载体〃指防止治疗蛋白质降解和/或提高治疗蛋白质半寿期，降低毒性，降低免疫原性，或者提高其生物活性的分子。载体的例子包括Fc结构域以及线性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG)，多熔素，葡聚糖，等)；支链聚合物(参见，例如，Denkenwalter等人的美国专利No.4，289，872，15，1981年9月15日公布;Tam的美国专利No.5，229，490，20，1993年7月20日公布；Frechet等的WO93/21259，1993年10月28日公开)；脂质；胆固醇基团(例如类固醇)；碳水化合物或寡糖；或者与补救受体结合的任何天然或合成蛋白质，多肽或肽。下文进一步描述载体。术语〃衍生〃和〃衍生物〃或〃衍生化〃分别包括方法和得到的产物，其中(1)化合物具有环状部分；例如，化合物中半胱氨酰残基之间的交联；(2)化合物被交联或者具有交联位点；例如，化合物具有半胱氨酰残基，因此培养物中或者体内形成交联二聚体；(3)非肽基键置换一个或多个肽基键；(4)N-末端被下面的基团置换-NRRl，NRC(O)Rl，-NRC(O)ORl，-NRS(0)2R1，-NHC(0)NHR，琥珀酰亚胺基团，或者取代的或未取代的节氧羰基-NH-，其中R和Rl和环取代基如下文定义；(5)C-末端被-C(0)R2或-NR3R4置换，其中R2，R3和R4如下文定义；和(6)通过用能与选择的侧链或末端残基反应的试剂处理而修饰其中各氨基酸部分的化合物。下文进一步描述衍生物。术语〃肽〃指大约3至大约75个氨基酸的分子，优选大约5至50个氨基酸的分子，8至40个氨基酸的分子更优选，大约10至25个氨基酸的那些分子最优选。肽可以是天然存在的或人工的(即，非天然存在的)氨基酸序列。举例的肽可以通过这里提出的任何方法制备，例如肽文库中包含的(例如，噬菌体展示文库)，通过化合合成制备，通过蛋白质消化衍生，或者利用重组DNA技术制备。术语"药学活性"指测得如此描述的物质具有影响药学参数(例如血压，血细胞量，胆固醇水平)或疾病状态(例如癌症，自身免疫失调等)的活性。术语"拮抗剂肽"或"抑制剂肽"指阻断或者一定程度干扰感兴趣的相关蛋白质的生物活性，或者具有与感兴趣的相关蛋白质的已知的拮抗剂或抑制剂相比的生物活性的肽。因此，术语"Ang-2-拮抗剂肽"包括鉴定为或衍生为具有Ang-2-拮抗剂特征的肽。另外地，这里也包括本发明的化合物的生理可接受盐。所谓"生理可接受盐"意指已知或者后来发现是药学可接受的任何盐。一些具体的例子是乙酸盐，三氟乙酸盐，氢卤化物，例如盐酸盐和氢溴化物；硫酸烟；拧檬酸盐；酒石酸盐；乙醇酸盐；和草酸盐，甲磺酸盐，和磷酸盐。肽抗体本发明的一个方面涉及开发Ang-2肽抗体。蛋白质配体和它的受体的相互作用经常在相对大的界面发生。但是，根据对人生长激素及其受体所证明的，只有界面处几个关键残基是大部分结合能的致因。Clackson等，Science267:383-6(1995)。大多数蛋白质配体只是展示正确拓扑学中的结合表位或者发挥与结合不相关的功能。因此，只有"肽"长度(一般2-40个氨基酸)的分子能结合给定大的蛋白质配体的受体蛋白质。这样的肽可以模拟大蛋白配体的生物活性("肽激动剂")，或者，通过竞争结合，抑制大蛋白配体的生物活性("肽拮抗剂")。噬菌体展示技术是鉴定这样的肽激动剂和拮抗剂中的有力方法。参见，例如，Scott等，Science249:386(1990);Devlin等，Science249:404(1990);美国专利No.5，223，409，1993年6月29日；美国专利No.5，733，731，1998年3月31日；美国专利No.5，498，530，1996年3月12日；美国专利No.5，432，018，issuedJul.11，1995年7月11日；美国专利No.5，338，665，1994年8月16日；美国专利No.5，922，545，1999年7月13日；W096/40987，1996年12月19日公开；和W098/15833，1998年4月16日(这些文献在此引作参考)。在肽噬菌体展示文库中，通过与丝状噬菌体的外被蛋白融合能展示随机肽序列。如果期望，展示的肽能相对抗体-固定的受体的胞外结构域被亲和力洗脱。通过连续几轮亲和力纯化和反复持续培养可以富集保留的噬菌体。对最好的结合肽测序，鉴定肽的一个或多个结构相关家族中的关键残基。参见，例如，Cwirla等，Science276:1696-9(1997)，其中鉴定了两个不同的家族。可以提出肽序列，其残基通过丙氨酸扫描或者通过DNA水平诱变可以被安全置换。可以制备诱变文库并且筛选，进一步优化最佳结合剂的序列。Lowman，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:401-24(1997)。可以利用蛋白质-蛋白质相互作用的结构分析提出模拟大蛋白配体结合活性的肽。在这样的分析中，晶体结构可以提示从中可以设计肽的大蛋白配体的决定性残基的身28份和相对取向。参力口，例如，Takasaki等，NatureBiotech15:1266-70(1997)。也可以使用这些分析方法来研究受体蛋白质和噬菌体展示筛选的肽之间的相互作用，可以提出对肽的进一步修饰来提高结合亲和力。肽研究中有与噬菌体展示相竞争的其他方法。肽文库可以与lac阻抑蛋白的羧基末端融合并且在大肠杆菌中表达。另一个以大肠杆菌为基础的方法通过与肽聚糖_结合脂蛋白(PAL)融合在胞外膜上展示。下文中，这些和相关的方法通称为〃E.Coli展示〃。在另一个方法中，在核糖体释放之前随机RNA的翻译停止，产生多肽文库，它们相关的RNA仍然连接着。在下文中，这种以及相关的方法通称为〃核糖体展示〃。其他方法利用月太与RNA的化学键合。参见，例如，Roberts和Szostak，ProcNatlAcadSciUSA，94:12297-303(1997)。在下文中，这种以及相关的方法通称为〃RNA-肽筛选〃。开发化学衍生的肽文库，其中肽固定在稳定的非生物材料上，例如聚乙烯棒或溶剂可渗透树脂。另一个化学衍生的肽文库使用光刻法扫描固定在载玻片上的肽。在下文中，这种以及相关的方法通称为〃化学-肽扫描〃。化学-肽扫描的优点在于它让使用D-氨基酸和其他非天然类似物，以及非肽元件。生物和化学方法综述见Wells和Lowman，Curr.Opin.Biotechnol.，3:355-62(1992)。概念上，人们利用噬菌体展示和提到的其他方法可以发现任何蛋白质的肽模拟物。这些方法已经被用于表位定位，用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用中决定性氨基酸，这引导发现新的治疗物质。参见，例如，Cortese等，Curr.Opin.Biotech.7:616-21(1996)。现在最经常在免疫学研究中使用肽文库，例如表位定位。参见Kreeger，TheScientist10(13):19-20(1996)。噬菌体展示文库筛选鉴定的肽被认为引导治疗药物的研发而不是作为治疗药物本身。和其他蛋白质和肽一样，它们在体内可能通过肾滤，通过网状内皮组织细胞清除机理，或者通过蛋白水解降解作用[Francis,(上文)]而被快速去除。结果，目前本领域使用肽验证药物靶物或者作为通过化学文库筛选可能不会容易地或快速地鉴定的有机化合物的设计平台[Lowman，(上文)；Kay等，(上文)]。本领域从通过其方法这样的肽能更容易地获得抗血管发生治疗药物的方法中受益。肽抗体的结构在根据本发明制备的物质成分中，肽可以通过肽的N-末端或C-末端与载体连接。这样，本发明的载体-肽分子可以通过下面五个化学式及其多聚体描述(X上-F「(X2)b(式I)(式II)(式III)(式IV)(式v)其中巳是载体(优选FC结构域)；和X2各自独立地选自-(L》A，_(L》C_P「(L2)d_P2，_(L》C_P「(L2)d_P2_(L3)e-P3，禾P-(L》c-P「(L2)d-P2-(L3)e-P3-(L4)f-P4Pp&，P3，和P4各自独立地是这里描述的药学活性肽的序列；29L2，L3，和L4各自独立地是连接体；禾口〃a"，〃b〃，〃c〃，〃d〃，〃e〃，和〃f〃各自独立地是O或l，前提是"a"禾口"b"至少一个是1。肽本发明涉及选择性结合或特异性结合Ang-2的肽。与本发明结合可以使用任何数目的这种肽，噬菌体展示，特别地，用于产生在本发明中使用的肽，已经证明对随机肽文库进行亲和力筛选能用来鉴定任何基因产物的任何位点的肽配体。Dedman等，J.Biol.Chem.268:23025-30(1993)。通过本领域公知的任何方法可以制备本发明的肽。使用单字母氨基酸縮写。在任何序列中(贯穿说明书始终，除非在特殊情况下另外具体说明)，"X"意思是可以存在20种天然存在的氨基酸残基或者非天然存在的氨基酸(下文在提到〃变体〃时描述)的任一种。这些肽的任一个可以串联连接(即，顺序地)，有或没有连接体，表中提供了串联连接的实施例。连接体列为〃L〃并且可以是这里描述的任何连接体。为了清楚起见，串联重复和连接体用短线隔开。任何含有半胱氨酰残基的肽可以与另一个含有Cys-的肽交联，其中任一个或者两者可以与载体连接。具有一个以上Cys残基的任何肽还可以形成肽内二硫键。这些肽的任一个可以根据这里所述被衍生化。关于其中羧基末端可以被氨基带帽的衍生物，带帽氨基_NH2。对于其中氨基酸残基被氨基酸残基之外的部分取代的衍生物，S表示取代作用，它表示Bhatnagar等，J.Med.Chem.39:3814-9(1996)，和Cuthbertson等，J.Med.Chem.40:2876-82(1997)中描述的任何部分，这两篇文献被引作参考。除非另外注明，所有的肽都通过肽键连接。在一个实施方案中，本发明提供至少一种与至少一种载体(F1，F2)通过肽的一个氨基酸残基的N-末端，C-末端或侧链连接。也可以使用多个载体；例如，各末端的几个Fc或一个末端的一个Fc，和在另一个末端和侧链处的一个PEG基团。Fc结构域是一个优选的载体。Fc结构域可以被用来与肽的N-末端或C_末端或者N-末端和C-末端融合。如上文所指出的，Fc变体是本发明范围内合适的载体。天然Fc可以被广泛修饰形成根据本发明的Fc变体，前提是保持与救助受体结合。参见，例如WO97/34631和WO96/32478。在这样的Fc变体中，人们可以去除提供本发明的融合分子不是必需的结构特征或功能活性的天然Fc的一个或多个位点。例如通过在所述位点取代或缺失残基，插入残基，或者截短含有所述位点的部分，人们可以去除这些位点。插入或取代的残基也可以是改变的氨基酸，例如肽模拟物或D-氨基酸。有很多原因使得Fc变体是所期望的，下面描述其中的几个。举例的Fc变体包括分子和序列，其中1.去除二硫键形成中涉及的位点。这样的去除可以避免与用来产生本发明的分子的宿主细胞中存在的其他含有半胱氨酸的蛋白质反应。为此目的，N-末端含有半胱氨酸的片段可以被截短，或者半胱氨酸残基可以被缺失或者被其他氨基酸取代(例如，丙氨酰，丝氨酰)。即使当半胱氨酸残基被去除时，单链Fc结构域仍然能形成非共价连接在一起的二聚体Fc结构域。2.修饰天然Fc，使得它与选择的宿主细胞更相容。例如，人们可以去除典型天然Fc的N-末端附近的PA序列，它可以被大肠杆菌中的消化酶例如脯氨酸亚氨基肽酶识别。人们还可以加上一个N-末端甲硫氨酰残基，特别是当在细菌细胞例如大肠杆菌中重组表达该分子的时候。3.去除天然Fc的N-末端的一部分，防止在选择的宿主细胞中表达时的N_末端不均匀性。为此目的，在N-末端可以缺失头20个氨基酸残基的任何氨基酸残基，特别是位置1，2，3，4和5处的那些。4.去除一个或多个糖基化位点。一般糖基化的残基(例如，天冬酰胺)可以带来细胞溶解反应。这样的残基可以被缺失或被没有糖基化的残基取代(例如，丙氨酸)。5.去除与补体的相互作用中涉及的位点，例如Clq结合位点。例如，人们可以缺失或取代人IgGl的EKK序列。补体收集对于本发明的分子可能不是有利的，因此可以用这样一种Fc变体避免。6.去除影响与补救受体之外的Fc受体结合的位点。天然Fc可以具有与对于本发明的融合分子不是必需的一些白细胞相互作用的位点，因此可以被去除。7.去除ADCC位点。ADCC位点是本领域公知的。有关IgGl中的ADCC位点，参见，例如，Molec.Immunol.29(5):633-9(1992)。这些位点也是对于本发明的融合分子不是必需的，因此可以被去除。8.当天然Fc是从非人抗体衍生的时，天然Fc可以被人源化。典型地，为了将天然Fc人源化，人们可以用人天然Fc正常发现的残基取代非人天然Fc中选择的残基。抗体人源化技术是本领域公知的。可供选择的载体可以是蛋白质，多肽，肽，抗体，抗体片段，或者能与补救受体结合的小分子(例如，肽模拟化合物)。例如，热敏可以使用Presta等人的1998年4月14日公布的美国专利No.5，739，277中描述的多肽作为载体。通过噬菌体展示也可以选择用于与FcRn补救受体结合的肽。这样的补救受体_结合化合物也包括在"载体"的意义中并且包括在本发明的范围内。应该对这样的载体选择延长的半寿期(例如，通过避免蛋白酶识别的序列)和降低的免疫原性(例如，通过抗体人源化中发现的有利的非免疫原性序列)。如上文指出的，对于^和F2也可以使用聚合物载体。现在可以获得连接用作载体的化学部分的各种方法，参见，例如，专利合作条约(〃PCT〃)国际公开No.WO96/11953，标题〃N-末端化学修饰的蛋白质成分和方法〃，这里全文引作参考。该PCT公开其中公开了水溶性聚合物与蛋白质的N-末端的选择性连接。优选的聚合物载体是聚乙二醇(PEG)。PEG基团可以是任何常规分子量并且可以是支链或支链的。PEG的重均分子量优选范围是大约2千道尔顿(〃kDa〃)至大约100kDa，更优选大约5kDa至大约50kDa，最优选大约5至大约10kDa。PEG基团一般通过PEG部分上的反应团(例如，醛基，氨基，巯基，或酯基)与本发明化合物上的反应团(例如，醛基，氨基，或酯基)通过酰化作用或还原性烷基化作用而与本发明的化合物连接。合成肽的PEG化作用的优用策略包括，通过在溶液中形成共轭键，化和肽和PEG部分，所述肽和PEG部分各自带有彼此相互反应的特定官能度。应用本领域公知的常规固相合成方法能容易地制备肽。预先在特定位置用合适的官能团将肽〃预活化〃在与PEG部分反应之前纯化母体并且完全表征。肽和PEG的连接通常在水相中发生并且能通过反相分析HPLC容易地监测。PEG化肽能容易地通过制备HPLC纯化并且通过分析HPLC，氨基酸分析和激光解吸质谱表征。多糖聚合物是可以用于蛋白质修饰的水溶性聚合物的另一种类型。葡聚糖是由主要通过一个1-6键连接的葡萄糖的各个亚基构成的多糖聚合物。葡聚糖本身有很多分子量范围，并且容易获得大约lkDa至大约70kDa的分子量。葡聚糖是在本发明中其本身或者与另一种载体(例如，Fc)联合用作载体的合适的水溶性聚合物。参见，例如，W096/11953和WO96/05309。有人报道过与治疗性或诊断性免疫球蛋白偶联的葡聚糖的使用；参见，例如，欧洲专利公开No.0315456，在此引作参考。当将葡聚糖用作根据本发明的载体时，大约lkDa至大约20kDa的葡聚糖是优选的。连接体所有的〃连接体〃是随意的。当存在时，其化学结构不是关键的，因为它主要作为间隔基团。连接体优选由肽键连接在一起的氨基酸制成。因此，在优选的实施方案中，连接体由肽键连接的l-20个氨基酸构成，其中氨基酸选自20中天然存在的氨基酸。这些氨基酸中的一个或多个可以被糖基化，这是本领域技术人员公知的。在更优选的实施方案中，1-20个氨基酸选自甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，和赖氨酸。更优选地，连接体由大多数无空间位阻的氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸构成。因此，优选的连接体是聚甘氨酸(特别是(Gly)5，(Gly)s)，聚(Gly-Ala)，和聚丙氨酸。Gly和Ala的组合也是优选的，它是这里称作Kl的连接体并且具有这里的实施例中提出的氨基酸序列。非肽连接体也是可能的。例如，能使用烷基连接体，例如-NH-(CH丄-C(O)-，其中s=2-20。这些烷基连接体可以进一步被任何没有空间位阻的基团例如低级烷基(例如，CfCe)低级酰基，卤原子(例如，Cl，Br)，CN，NH2，苯基，等取代。一个举例的非肽连接体是PEG连接体，并且具有100至5000kDa的分子量，优选100至500kDa。用和如上所述一样的方法可以改变肽连接体形成衍生物。变体和衍生物特异性结合剂的变体和衍生物包括在本发明的范围内。包括的变体是插入，缺失，和取代变体。明白本发明的特定特异性结合剂可以包含一种，两种，或所有三种类型的变体。插入和取代变体可以包含天然氨基酸，非常见氨基酸(如下文提出的)，或者两者。在一个实施例中，提供插入变体，其中肽或肽抗体氨基酸序列中插入一个或多个氨基酸残基，或者是天然存在的或者是非常见氨基酸。插入可以位于蛋白质的一端或两端，或者可以位于肽抗体氨基酸序列的中间部分。在一个末端或者两个末端有附加残基的插入变体能包括，例如，包括氨基酸标记或标记的融合蛋白和蛋白质。插入变体包括肽和肽抗体，其中肽或肽抗体氨基酸序列或者其片段被加入一个或多个氨基酸残基。本发明的变体产物还包括成熟肽或肽抗体，其中去除了前导序列或信号序列，得到的蛋白质有附加的氨基末端残基，所述氨基酸可以是天然的或非天然的。包括氨基酸位置-1有附加的甲硫氨酰残基的特异性结合剂(例如肽抗体)(Met—^肽抗体)，这些是在位置-2和-l有附加的甲硫氨酸和赖氨酸残基(Met—2_Lys—的特异性结合剂。有附加的Met,Met-Lys，Lys残基(或一个或多个碱性残基，一般地)的变体特别用于在细菌宿主细胞中提高重组蛋白质生产。本发明还包括使用特异表达系统产生的具有附加的额氨基酸残基的特异性结合剂。例如，使用表达作为谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合产物的一部分的期望的多肽的商售载体提供从期望的多肽裂解GST成分之后在氨基酸位置-1具有附加的甘氨酸残基的期望的多肽。也包括在其他载体系统表达得到的变体，包括其中一般在序列的羧基和/或氨基末端向氨基酸序列中插入聚组氨酸标记的那些。插入变体还包括融合蛋白，其中肽或肽抗体的氨基和/或羧基末端与另一个多肽，其片段或者一般没有识别是任何特异蛋白质序列的一部分的氨基酸融合。这样的融合蛋白的例子是具有长循环半寿期的免疫原性多肽，蛋白质，例如免疫球蛋白恒定区，标记蛋白，有利于纯化期望的肽或肽抗体的蛋白质或多肽，和促进多聚体蛋白质形成的多肽序列(例如在二聚体形成/稳定性中有用的亮氨酸拉链结构基序)。这种类型的插入变体一般具有在N-或C-末端与第二多肽的全部或部分连接的天然分子的全部或大部分。例如，融合蛋白一般使用来自其他物种的前导序列以允许在异源宿主中重组表达蛋白质。另一种有用的融合蛋白包括免疫活性结构域例如抗体表位的加入，以有利于融合蛋白的纯化。融合连接处或附近裂解位点所包含的会有利于在纯化之后去除外来多肽。其他有用的融合物包括功能结构域的连接，例如来自酶的活性位点，糖基化结构域，细胞定向信号或跨膜区。有很多可以在本发明中使用的商售融合蛋白表达系统。特别有用的系统包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)系统(Pharmacia)，麦芽糖结合蛋白系统(NEB，Beverley,Mass.)，FLAG系统(IBI，NewHaven，Co皿.)，禾口6xHis系统(Qiagen，Chatsworth，Calif.)。这些系统能产生只带有少数附加氨基酸的重组肽和/或肽抗体，这少数附加氨基酸不可能显著影响肽或肽抗体的活性。例如，FLAG系统和6xHis系统只加入短序列，已知这两种系统免疫原性不好并且不会不利地影响多肽折叠成它的天然构象。另一种有用的N-末端融合体是蛋白质或肽的N-末端区Met-Lys二肽的融合体。这样的融合体可以产生蛋白质表达或活性的有利的提高。其他融合体系产生多肽杂合体，其中期望从期望的肽或肽抗体切除融合配偶体。在一个实施方案中，融合配偶体通过含有蛋白酶的特异识别序列的肽序列与重组肽抗体连接。合适的序列的例子是烟草Etch病毒蛋白酶(LifeTechnologies,Gaithersburg，Md.)或因子Xa(NewEnglandBiolabs，Beverley,Mass.)识别的那些。本发明还提供了融合多肽，其包括与截短的组织因子(tTF)组合的本发明的肽抗体或肽的全部或部分。TTF是由作为肿瘤血管凝固剂发挥作用的人血凝固-诱导蛋白质的截短形式构成的血管靶向剂，如美国专利Nos.:5，877，289;6，004，555;6，132,729;6，132，730;6，156，321;和欧洲专利No.EP0988056所述。TTF与抗-Ang_2肽抗体或肽，或者其片段的融合有利于抗-Ang-2向靶细胞的送递。另一方面，本发明提供缺失变体，其中肽或肽抗体中一个或多个氨基酸残基被去除。从肽抗体的一个或两个末端进行缺失，或者在肽抗体氨基酸序列中去除一个或多个残基。缺失变体必须包括肽或肽抗体的所有的片段。另一方面，本发明提供本发明的肽或肽抗体的取代变体。取代变体包括其中一个或多个氨基酸残基被去除或者被一个或多个供选择的氨基酸置换的那些肽和肽抗体，其中所述氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的。取代变体产生与原来肽或肽抗体"类似的"肽或肽抗体，在于两个分子具有一定百分比的氨基酸是相同的。取代变体包括肽或肽抗体中1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，个氨基酸的取代作用，其中取代的数目最多可以是肽或肽抗体的氨基酸的10%或更多。一方面，取代作用性质是保守的，但是本发明包括也是不保守的取代作用并且还包括非常规氨基酸。通过公知的方法能容易地计算相关的肽和肽抗体的同一性和相似性。这样的方法包括但不限于下面文献描述的那些ComputationalMolecularBiology,Lesk，A.M.，编著，0xfordUniversityPress,NewYork(1988);Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.，编著，AcademicPress,NewYork(1993);ComputerAnalysisofSequenceData,Part1，Griffin，A.M.，禾口Griffin，H.G.，编著，HumanaPress,NewJersey(1994);SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje，G.，AcademicPress(1987);SequenceAnalysisPrimer,Gribskov，M.禾口Devereux，J.，编著，M.StocktonPress,NewYork(1991);和Carillo等，SIAMJ.A卯liedMath.，48:1073(1988)。设计测定两个肽或肽抗体，或者多肽和肽的相关性或同一性百分比的优选方法，得到测试序列之间的最大匹配。公众能够得到的计算机程序中描述了测定同一性的方法。测定两个序列之间的同一性的优选的计算机程序方法包括但不限于，GCG程序包，包括GAP(Devereux等，Nucl.Acid.Res.，12:387(1984);GeneticsComputerGroup,UniversityofWisconsin,Madison,WI，BLASTP，BLASTN，和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.，215:403-410(1990))。公众从theNationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)禾口其他来源(BLASTManual,Altschul等NCB/NLM/NIHBethesda，Md.20894;Altschul等，上文(1990))能获得BLASTX程序。也可以使用公知的SmithWaterman算法来测定同一性。用于将两个氨基酸序列比对的一些比对方案可以导致两个序列只有一个短的区匹配，这个小的比对区可以具有非常高的序列同一性，即使两个全长序列之间没有显著相关性。因此，在一些实施方案中，选择的比对方法(GAP程序)可以导致跨距至少是比较的耙多肽全长的10%对齐，S卩，比较至少400个氨基酸序列时至少40个连续的氨基酸，比较至少300至大约400个氨基酸序列时至少30个连续的氨基酸，比较至少300至大约400个氨基酸序列时至少30个连续的氨基酸，比较200至大约300个氨基酸序列时至少20个连续的氨基酸，比较大约100至200个氨基酸序列时至少10个连续的氨基酸。例如，利用计算机算法GAP(GeneticsComputerG丽p，UniversityofWisconsin,Madison,Wis.)，将要测定序列同一性百分比的两个多肽对它们各个氨基酸进行最佳匹配比对(〃匹配跨度〃，根据算法确定)。在一些实施方案中，空位罚分(一般计算为3X平均对角线；〃平均对角线〃是使用的比较矩阵的对角线的平均值；〃对角线"是特定比较矩阵分配给每一个完全氨基酸匹配的分数或数目)和空位长度罚分(它通常是空位罚分的1/10倍)，并且与算法联合使用象PAM250或BLOSUM62这样的比较矩阵。在一些实施方案中，算法还使用标准比较矩阵(关于PAM250比较矩阵，参见Dayhoff等，AtlasofProteinSequenceandStructure,5(3)(1978);关于BLOSUM62比较矩阵，参见Henikoff等，Proc.Natl.Acad.SciUSA，89:10915-10919(1992))。在一些实施方案中，多肽序列比较参数包括如下算法Needleman等，J.Mol.Biol.，48:443-453(1970);比较矩阵上文Henikoff等(1992)的BLOSUM62;空位罚分12空位长度罚分4相似性阈值0使用上述参数的GAP程序是有用的。在一些实施方案中，使用GAP算法，上述参数对于多肽比较是默认参数(对于末端空位没有罚分)。在一些实施方案中，对于多核苷酸分子序列(与氨基酸序列相对应)的参数包括如下算法Needleman等，上文(1970);比较矩阵匹配=+10，错配=0空位罚分50空位长度罚分3使用上述参数的GAP程序也是有用的。上述参数对于多核苷酸分子比较是默认参数。其他例举的算法，空位罚分，空位长度罚分，比较矩阵，相似性阈值等也可以使用ProgramManual,WisconsinPackage,第9版，1997年9月中提出的那些。进行的具体选择对于本领域技术人员来说是显而易见的并且取决于要进行的具体比较，例如DNA-与-DNA，蛋白质-与-蛋白质，蛋白质-与-DNA;另夕卜，比较是否在给定序列对之间(其中一般优选GAP或BestFit)或者在一个序列和一个序列的大数据库之间(其中FASTA或BLASTA是优选的)。如这里使用的，按常规使用20种常见氨基酸和它们的縮写。参见Immunology-ASynthesis(第二片反，E.S.Golub禾口D.R.Gren，Eds.，SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991))，这里为了所有的目的引作参考。氨基酸可以具有L或D立体化学(除了Gly之外，其即不是L也不是D)，并且本发明的多肽和成分可以包括立体化学的混合物。但是，L立体化性是优选的。本发明还提供了反向分子，其中氨基酸的氨基末端至羧基末端序列是反向的。例如，具有正常序列xrx2-x3的分子的反向应该是XfX厂^.。本发明还提供了逆-反向分子，其中，如上所述，氨基酸的氨基末端至羧基末端序列是反向的，并且一般的〃L〃对映异构体的残基被改变为〃D〃立体异构型。二十种常见氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，例如[a]-，[a]_二取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其他非常见氨基酸也是本发明的多肽的合适的成分。非常见氨基酸的例子包括但不限于氨基脂肪酸，P-丙氨酸，P-氨基丙酸，氨基丁酸，哌啶酸，氨基癸酸，氨基庚酸，氨基异丁酸，氨基庚二酸，二氨基丁酸，锁链素，二氨基庚二酸，二氨基丙酸，N-乙基甘氨酸，N-乙基天冬酰胺，羟基赖氨酸，异_羟基赖氨酸，羟基脯氨酸，异锁链素，异-异亮氨酸，N-甲基甘氨酸，肌氨酸，N-甲基异亮氨酸，N-甲基缬氨酸，新缬氨酸，正亮氨酸，鸟氨酸，4-羟基脯氨酸，[Y]-羧基谷氨酸，[e]-N，N，N-三甲基赖氨酸，[e]-N-乙酰基赖氨酸，0-磷酸丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸，N-甲酰基甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，[o]-N-甲基精氨酸，和其他相似氨基酸和氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。类似地，除非具体说明，单链多核苷酸序列的左手端是5'端；双链多核苷酸序列的左手方向指为5'方向。初始RNA转录本的5'至3'加入方向称作转录方向；和RNA具有相同序列并且是RNA转录本的5'至5'端的DNA链上的序列区称作〃上游序列〃；和RNA35具有相同序列并且是RNA转录本的3'至3'端的DNA链上的序列区称作〃下游序列〃。明白氨基酸残基可以根据它们共同的侧链性质分为几类1.中性疏水丙氨酸(Ala;A)，缬氨酸(Val;V)，亮氨酸(Leu;L)，异亮氨酸(lie;I)，脯氨酸(Pro;P)，色氨酸(Trp;W)，苯丙氨酸(Phe;F)，和蛋氨酸(Met,M)。2.中性极性甘氨酸(Gly;G);丝氨酸(Ser;S)，苏氨酸(Thr;T)，酪氨酸(Tyr;Y)，半胱氨酸(Cys;C)，谷氨酰胺(Glu;Q)，天冬酰胺(Asn;N)，和正亮氨酸。3.酸性天冬氨酸(Asp;D)，谷氨酸(Glu;E);4)碱性赖氨酸(Lys;K)，精氨酸(Arg;R)，组氨酸(His;H)。参见Lewin，B.，GenesV，OxfordUniversityPress(1994)，p.11。保守性氨基酸取代可以包括非常见氨基酸残基，它一般是通过化学肽合成而不是通过生物系统合成而插入的。这些包括但不限于，肽模拟物和其他氨基酸部分的逆反或颠倒形式。非保守性取代可以包括将这些类中的一个变化为另一类中的一个。根据一些实施方案，进行这样的变化时，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathicindex)。以氨基酸的疏水性和电荷特征为基础对各种氨基酸指派亲水指数。它们是异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);蛋氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸6);组氨酸(_3.2);谷氨酸(_3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(_3.9);和精氨酸(_4.5)。本领域知晓氨基酸亲水指数在对蛋白质带来相互影响的生物学功能中的重要性。Kyte等，J.Mol.Biol.，157:105-131(1982)。已知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或分数的另外的氨基酸取代而仍然保留相似的生物活性。在根据亲水指数进行变化中，在一些实施方案中，包括亲水指数在士2之内的氨基酸取代。在一些实施方案中，包括亲水指数在士l之内的那些，在一些实施方案中，包括亲水指数在士0.5之内的那些。本领域还知晓，以亲水性为基础能有效地进行类似氨基酸的取代，特别是在由此产生的生物功能肽抗体或肽是为了在免疫实施方案中应用的情况下，本发明情况就是如此。在一些实施方案中，蛋白质最大局部平均亲水性，这由其相邻氨基酸的亲水性支配，与它的免疫原性和抗原性相关，即，与蛋白质的生物学性质相关。对这些氨基酸残基指定下面的亲水性值精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬氨酸(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);蛋氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸8);异亮氨酸8);酪氨酸(_2.3);苯丙氨酸(_2.5)和色氨酸(-3.4)在根据相似亲水性值进行改变中，在一些实施方案中，包括其亲水性值在士2之内的氨基酸取代。在一些实施方案中，包括亲水性值在士l之内的那些，在一些实施方案中，包括亲水性值在±0.5之内的那些。人们以亲水性为基础还可以鉴定主要氨基酸序列中的表位。这些区也称作〃表位核心区〃。下面表2中给出例示的氨基酸取代作用。趋M某酸取代作用36<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>实施方案中，本领域技术人员通过定位据信对于活性不是重要的区而可以鉴定可以改变而不破坏活性的分子的合适的区。在一些实施方案中，人们能鉴定在相似肽或多肽中保守的分子的残基和部分。在一些实施方案中，即使对生物活性或者对结构是重要的区也可以进行保守性氨基酸取代而不破坏生物学活性或者不会不利地影响多肽结构。另外，本领域技术人员能进行对相似多肽鉴定对于活性或结构重要的残基的结构-功能研究。考虑这样的比较，人们能预测蛋白质中相应于相似蛋白质中对于活性或结构重要的氨基酸残基的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择对于这样预测的重要的氨基酸残基的化学类似氨基酸取代作用。本领域技术人员还能分析与相似多肽中的结构相关的三维结构和氨基酸序列。考虑这样的信息，本领域技术人员可以对抗体预测有关其三维结构的氨基酸残基比对。在一些实施方案中，既然这样的残基可能在与其他分子的重要的相互作用中涉及，本领域技术人员可以选择不对预测在蛋白质表面上的氨基酸残基产生根本变化。此外，本领域技术人员可以获得在各个期望的氨基酸残基处包含单一氨基酸取代的试验变体。然后利用本领域技术人员公知的活性测定能对变体进行筛选。这样的变体可以被用来收集有关合适的变体的信息。例如，如果有人发现对特定氨基酸残基的改变导致活性破坏，不期望的降低，或者不适活性，可以避免有这样改变的变体。换句话说，根据从这样的常规实验收集的信息，本领域技术人员能容易地确定应该单独地或与其他突变组合地避免进一步的取代作用的氨基酸。很多科学出版物致力于二级结构的判断。参见，MoultJ.，Curr.Op.Biotech.，7(4):422-427(1996)，Chou等，Biochemistry,13(2):222-245(1974);Chou等，Biochemistry,113(2):211-222(1974);Chou等，Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.，47:45-148(1978);Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47:251-276和Chou等，Biophys.J.，26:367-384(1979)。此外，目前可获得辅助判断二级结构的计算机程序。一种二级结构判断方法是以同源性模型为基础的。例如，具有大于30%序列同一性的，或者大于40%相似性的两个多肽或蛋白质常常具有相似的结构拓扑学。近来蛋白质结构数据的增长(PDB)为二级结构提供了提高的可预测性，包括多肽或蛋白质结构中可能的折叠数目。参见Holm等，Nucl.Acid.Res.，27(1):244-247(1999)。有人提出(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3):369-376(1997))—种给定多肽或蛋白质有有限数目的折叠，而且一旦明了关键的结构数目，结构预测将变得大大地更加精确。确定二级结构的另外的方法包括〃threading〃(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3):377-87(1997);Si卯l等，Structure,4(1):15-19(1996))，〃曲线分析〃(Bowie等，Science,253:164-170(1991);Gribskov等，Meth.Enzym.，183:146-159(1990);Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13):4355-4358(1987))，和〃改良键合〃(参见Holm，上文(1999)，和Brenner，上文(1997))。在一些实施方案中，肽抗体变体包括糖基化变体，其中肽抗体中加入了一个或多个糖基化位点，例如N-连接的糖基化位点。一种N-连接的糖基化位点特征在于序列Asn-X-Ser或Asn-X-，其中指定为X的氨基酸残基可以是除了脯氨酸之外的任何氨基酸残基。对构成该序列的氨基酸残基的取代或加入提供加入N-连接的糖链的可能的新的位点。或者，可以去除该序列的取代作用会去除已有的N-连接的糖链。还提供了N-连接的糖链的重排，其中一个或多个N-连接的糖基化位点(一般是天然存在的那些)被去除并且产生一个或多个新的N-连接的位点。本发明还提供了〃衍生物〃，包括带有除了氨基酸残基的加入，插入，缺失，或取代之外的修饰的肽抗体。优选地，修饰作用本质是共价的，并且包括例如，与聚合物，脂质，其他有机和无机部分的化学键合。可以制备提高肽抗体的循环半寿期的本发明的衍生物，或者可以设计提高肽抗体对期望的细胞，组织，或器官的定向能力的本发明的衍生物。举例的衍生物包括其中进行了下面修饰作用中的一个或多个的部分-—个或多个肽基[-C(0)NR-]键合(键)被非肽键置换，所述非肽键例如-CH厂氨基甲酸酯[_CH2-0C(0)NR-];磷酸酯键；-CH厂磺酰胺[-CH2-S(0)2NR_]键；脲[-NHC(O)NH-]键；_CH2-仲胺键；或烷基化肽基键[-C(0)NR6-，其中R6是低级烷基];-其中N-末端被衍生化为下面的基团的肽-NRR1;-NRC(0)R基团；-NRC(O)OR基团；-NRS(0)2R基团；-NHC(0)NHR基团，其中R和^是氢或低级烷基，前提是R和W两者不同时是氢；琥珀酰亚胺基团；苄氧羰基-NH-(CBZ-NH-)基团；或者苯环上带有选自低级烷基，低级烷氧基，氯，和溴的1-3个取代基的苄氧羰基-NH-基团；禾口-其中游离的C-末端被衍生化为下面基团的肽-C(O)R2，其中R2选自低级烷基和-NR3^，其中R3和RM虫立地选自氢和低级烷基。所谓〃烷基〃意思是具有l-6个碳原子的基团。另外，通过使肽的目标氨基酸残基与能与选择的侧链或末端残基反应的有机衍生化试剂反应，可以向本发明的多肽或成分引入各个氨基酸的修饰作用。下面是例子赖氨酰和氨基末端残基可以与琥珀酸酐或其他羧酸酸酐反应。与这些试剂的衍生化作用具有改变赖氨酰残基电荷的作用。用于将含有a-氨基残基衍生化的其他合适的试剂包括亚氨酸酯，例如吡啶亚氨酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；0-甲基异脲；2，4-戊二酮；和与乙醛酸酯的转氨酶催化的反应。精氨酰残基可以通过与一种或几种常规试剂的反应而被修饰，所述常规试剂其中包括苯甲酰甲醛，2，3-丁二酮，l，2-环己二酮，和水和茚三酮。精氨酸残基的衍生化作用要求在碱性条件下进行反应，因为胍官能团的高pKa。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸胍基反应。酪氨酰残基本身的特定修饰已经被充分研究，通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应对酪氨酰残基引入光谱标记特别令人感兴趣。最常见地，可以使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别生成0-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳化二亚胺(R'-N-C=N-R')的反应而被选择性修饰，例如1-环己基_3-(2-吗啉基-(4_乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，通过与铵离子反应可以将天冬氨酰和谷氨酰残基转化为天冬氨酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。常常将天冬氨酰胺酰和谷氨酰胺酰残基去酰氨基得到相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，可以在温和的酸性条件下将这些残基去酰氨基。这两种残基形式都在本发明的范围内。使用双功能化试剂的衍生化作用使肽或者它们的功能衍生物与水不溶性载体基体或者与其他大分子载体交联。通常使用的交联剂包括，例如，l，l-双(二偶氮乙酰39基)-2-苯乙烷，戊二醛，^羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮基水杨酸的酯，均双功能亚氨酯，包括二琥珀酰亚胺酯，例如3，3'-二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺，例如双-N-马来酰亚胺-l，8-辛烷。衍生化试剂例如甲基-3-[(p-叠氮基苯基)二硫]丙酰亚氨酯得到在光照下能形成交联的光活性中间体。或者，对于蛋白质固定化作用可以使用反应性水不溶性基体，例如溴化氰_活化的碳水化合物和美国专利Nos.3，969，287;3，691，016;4，195，128;4，247，642;4，229，537;和4，330，440中描述的反应底物。其他可能的修饰作用包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化作用，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化作用，Cys中硫原子的氧化作用，赖氨酸，精氨酸，和组氨酸侧链的a-氨基的甲基化作用(Creighton，T.E.，Proteins-StructureandMoleculeProperties,W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco,pp.79-86(1983))，N_末端胺的乙酰化作用，和，在某些情况下，C-末端羧基的酰胺化作用。这样的被衍生化的部分优选改善了一项或几项特征，包括化合物的抗-血管发生活性，溶解性，吸收性，生物学半寿期等。或者，被衍生化的部分可以产生与没有衍生化的化合物相同或基本上相同的特征和/或性质。或者所述部分可以消除或减轻化合物的不期望的副作用等。而且，本发明的化合物可以在DNA上加以改变。可以将本发明的任何部分的DNA序列变化为与选择的宿主细胞更加适合。关于大肠杆菌，它是优选的宿主细胞，优化密码子是本领域公知的。密码子可以被取代，去除限制位点或者使包括沉默限制位点，这有助于DNA在优选的宿主细胞中表达。可以对载体，连接体和肽DNA序列进行修饰，使包括上述任何序列变化。这样，这里讨论的所有的修饰，取代，衍生化作用等同样适用于本发明的所有方面，包括但不限于肽，肽二聚体和多聚体，连接体和载体。另外，本领域技术人员能分析鉴定对于活性或结构重要的相似肽中残基的结构-功能研究。考虑这样的比较，人们能预知相应于相似肽中对活性或结构重要的氨基酸残基的肽中氨基酸残基的重要性。本领域技术人员对于肽的这样的预知重要的氨基酸残基可以选择化学相似氨基酸取代。本领域技术人员还能分析与相似多肽中的结构相关的三维结构和氨基酸序列。考虑这样的信息，本领域技术人员可以对肽预测有关其三维结构的氨基酸残基比对。既然这样的残基可能在与其他分子的重要的相互作用中涉及，本领域技术人员可以选择不对预测在蛋白质表面上的氨基酸残基产生根本变化。此外，本领域技术人员可以获得在各个期望的氨基酸残基处包含单一氨基酸取代的试验变体。然后利用本领域技术人员公知的活性测定能对变体进行筛选。这样的数据可以被用来收集有关合适的变体的信息。例如，如果有人发现对特定氨基酸残基的改变导致活性破坏，不期望的降低，或者不适活性，可以避免有这样改变的变体。换句话说，根据从这样的常规实验收集的信息，本领域技术人员能容易地确定应该单独地或与其他突变组合地避免进一步的取代作用的氨基酸。很多科学出版物致力于二级结构的判断。参见，MoultJ.，Curr.Op.Biotech.，7(4):422-427(1996)，Chou等，Biochemistry,13(2):222-245(1974);Chou等，Biochemistry,113(2):211-222(1974);Chou等，Adv.Enzymol.Relat.AreasMol.Biol.，47:45-148(1978);Chou等，Ann.Rev.Biochem.，47:251-276和Chou等，Biophys.J.，26:367-384(1979)。此外，目前可获得辅助判断二级结构的计算机程序。一种二级结构判断方法是以同源性模型为基础的。例如，具有大于30%序列同一性的，或者大于40%相似性的两个多肽或蛋白质常常具有相似的结构拓扑学。近来蛋白质结构数据的增长(PDB)为二级结构提供了提高的可预测性，包括多肽或蛋白质结构中可能的折叠数目。参见Holm等，Nucl.Acid.Res.，27(1):244-247(1999)。有人提出(Brenner等，Curr.Op.Struct.Biol.，7(3):369-376(1997))—种给定多肽或蛋白质有有限数目的折叠，而且一旦明了关键的结构数目，结构预测将变得大大地更加精确。确定二级结构的另外的方法包括〃threading〃(Jones，D.，Curr.Opin.Struct.Biol.，7(3):377-87(1997);Si卯l等，Structure,4(1):15-19(1996))，〃曲线分析〃(Bowie等，Science,253:164-170(1991);Gribskov等，Meth.Enzym.，183:146-159(1990);Gribskov等，Proc.Nat.Acad.Sci.，84(13):4355-4358(1987))，和〃改良键合〃(参见Holm，上文(1999)，和Brenner，上文(1997))。本发明进一步包括衍生的特异性结合剂，例如肽抗体，被共价修饰包括一个或多个水溶性聚合物连接，例如聚乙二醇，聚氧乙二醇，或聚丙二醇，描述于美国专利Nos.:4，640，835;4，496，689;4，301，144;4，670，417;4，791，192;和4，179，337。本领域公知的其他有用的聚合物包括一甲氧基-聚乙二醇，葡聚糖，纤维素或者其他以碳水化合物为基础的聚合物，聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)_聚乙二醇，丙二醇均聚物，a聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇，以及这些聚合物的混合物。特别优选的是用聚乙二醇(PEG)亚基共价修饰的肽抗体。水溶性聚合物可以在特定位置例如在肽抗体的氨基末端键合，或者与多肽的一个或多个侧链随机连接。2000年10月17日公布的Gonzales等人的美国专利No.6，133，426描述了用于提高对特异性结合剂例如肽抗体，和对于人源化抗体的治疗能力的PEG的使用。本发明还包括将化合物的肽和/或载体部分衍生化。这样的衍生物可以提高化合物的溶解性，吸收性，生物学半寿期等。或者，被衍生化的部分可以消除或减小化合物的任何不期望的副作用等。举例的衍生物包括化合物，其中1.化合物或者不其某些部分是环状的。例如，可以对肽部分进行修饰使得包含两个或多个Cys残基(例如，连接体)，其可以通过形成二硫键而环化。2.化合物被交联或者使得能在分子之间交联。例如，可以对肽部分修饰使包含一个Cys残基，从而与相似分子能形成分子间二硫键。化合物还可以通过其C-末端被交联。3.—个或多个一个或多个肽基[-C(0)NR-]键合(键)被非肽键置换。举例的非肽键是-CH厂氨基甲酸酯[-CH厂OC(O)NR-];磷酸酯键；-CH厂磺酰胺[_CH2_S(0)2NR_]键；脲[-NHC(0)NH-]键；-CH2-仲胺键；和烷基化肽[-C(0)NRe-，其中R6是低级烷基];4.N-末端被衍生化。典型地，N-末端可以被酰基化或者被修饰成取代的胺。举例的N-末端衍生化基团包括-NR^(不包括_NH2);-NRC(0)&厂NRC(0);-NRS(0)具；-NHC(O)NHRp琥珀酰亚胺，或节氧羰基-NH-(CBZ-NH-)，其中R和R!各自独立地是氢或低级烷基，并且其中苯环可以被选自crc4烷基，c「c;烷氧基，氯，和溴的l-3个取代基取代。5.游离的C-末端被衍生化。典型地，C-末端被酯化或酰胺化。例如，人们可以应用现有技术描述的方法对本发明的化合物在C-末端加上(NH-CH2-CH2-NH2)2。同样，人们可以应用现有技术描述的方法对本发明的化合物在C-末端加上_朋2，举例的C-末端衍生基团包括，例如，-C(0)R2，其中R2是低级烷基或_NR3R4，其中R3和R4独立地是氢或CrC8烷基(优选C「Q烷基)。6.二硫键被另一个，优选更稳定的，交联部分(例如亚烷基)置换。参见，例如，Bhatnagar(上文)；Alberts等，ThirteenthAm.P印.S卿.，357-9(1993)。7.—个或多个各氨基酸残基被修饰。已知不同的衍生化试剂与选择的侧链或末端残基特异反应，如下面详细描述的。赖氨酰和氨基末端残基可以与琥珀酸酐或其他羧酸酸酐反应，它改变赖氨酰残基的电荷。用于将含有a-氨基残基衍生化的其他合适的试剂包括亚氨酸酯，例如吡啶亚氨酸甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；0_甲基异脲；2，4_戊二酮；和与乙醛酸酯的转氨酶催化的反应。精氨酰残基可以通过与一种或几种常规试剂的反应而被修饰，所述常规试剂其中包括苯甲酰甲醛，2，3-丁二酮，l，2-环己二酮，和水和茚三酮。精氨酸残基的衍生化作用要求在碱性条件下进行反应，因为胍官能团的高pKa。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸胍基反应。酪氨酰残基的特定修饰已经被充分研究，通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应对酪氨酰残基引入光谱标记特别令人感兴趣。最常见地，可以使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别生成0-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳化二亚胺(R'-N-C=N-R')的反应而被选择性修饰，例如1-环己基_3-(2-吗啉基-(4_乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳化二亚胺。此外，通过与铵离子反应可以将天冬氨酰和谷氨酰残基转化为天冬氨酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。将天冬氨酰胺酰和谷氨酰胺酰残基去酰氨基得到相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。或者，可以在温和的酸性条件下将这些残基去酰氨基。这两种残基形式都在本发明的范围内。半胱氨酰残基能被氨基酸残基或者其他部分置换，以消除二硫键或者，相反地，稳定交联。参见，例如，Bhatnagar，(上文)。使用双功能化试剂的衍生化作用使肽或者它们的功能衍生物与水不溶性载体基体或者与其他大分子载体交联。通常使用的交联剂包括，例如，l，l-双(二偶氮乙酰基)_2-苯乙烷，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，与4-叠氮基水杨酸的酯，均双功能亚氨酯，包括二琥珀酰亚胺酯，例如3，3'-二硫双(琥珀酰亚胺丙酸酯)，和双功能马来酰亚胺，例如双-N-马来酰亚胺-l，8-辛烷。衍生化试剂例如甲基-3-[(p-叠氮基苯基)二硫]丙酰亚氨酯得到在光照下能形成交联的光活性中间体。或者，对于蛋白质固定化作用可以使用反应性水不溶性基体，例如溴化氰_活化的碳水化合物和美国专利Nos.3，969，287;3，691，016;4，195，128;4，247，642;4，229，537;和4，330，440中描述的反应底物。碳水化合物(寡糖)基团可以方便地与已知的蛋白质中的糖基化位点连接。一般情况下，当它们是序列Asn-X-Ser/Thr的一部分，其中X可以是除了脯氨酸的任何氨基酸时，0-连接寡糖连接丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基，而N-连接寡糖连接天冬酰胺(Asn)残基。X优选是除了脯氨酸之外的19中天然存在的氨基酸中的一种。各种类型中发现的N-连接和O-连接寡糖和糖残基的结构是不同的。在这两者中都发现的一种类型的糖是N-乙酰基神经氨酸(称作唾液酸)。唾液酸常常是N-连接和0-连接寡糖的末端残基，而且由于其负电荷，可以给糖基化化合物带来酸性性质。可以在本发明的化合物的连接体中插入这样的位点，并且优选在多肽化合物的重组产生过程中由细胞糖基化(例如，在哺乳动物细胞中，例如CHO，BHK，C0S)。但是，这样的位点可以被本领域公知的合成或半合成过程进一步糖基化。其他可能的修饰作用包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化，Cys中硫原子的氧化，赖氨酸，精氨酸，和组氨酸侧链的a-氨基的甲基化[Creighton，Proteins:StructureandMoleculeProperties(W.H.Freeman&Co.，SanFrancisco)，pp.79—86(1983)]。本发明的化合物可以在DNA水平上加以改变。可以将化合物的任何部分的DNA序列变化为与选择的宿主细胞更加适合。关于大肠杆菌，它是优选的宿主细胞，优化密码子是本领域公知的。密码子可以被取代，去除限制位点或者使包括沉默限制位点，这有助于DNA在优选的宿主细胞中表达。可以对载体，连接体和肽DNA序列进行修饰，使包括上述任何序列变化。亲和力成熟本发明的一个实施方案包括〃亲和力成熟〃肽和肽抗体。该方法包括利用噬菌体展示或者其他筛选技术提高本发明的肽和肽抗体的亲和力或生物活性。以共有序列为基础(为了收集相关的肽而产生)，能产生定向二级噬菌体展示文库，其中〃核心〃氨基酸(从共有序列确定)保持不变或者出现频率有偏好。或者，能使用各个肽序列产生有偏好的，定向噬菌体展示文库。对这样的文库筛选能得到获得增强的与Ang-2的结合或者具有提高的生物活性的肽(其可以转化为肽抗体)。剕嫂垂/，固草涵此外，也包括提供稳定结构或减小生物降解性的肽的非肽类似物。在选择的抑制肽的基础上通过非肽部分置换一个或多个残基能制备肽模拟物类似物。优选地，非肽部分允许肽保留它的天然构象，或者稳定一种优选的，例如，生物活性构象，它保留识别和结合Ang-2的能力。一方面，得到的类似物/模拟物显示对Ang-2的提高的结合亲和力。Nachman等，Regul.P印t.57:359-370(1995)中描述了从肽制备非肽模拟物类似物的方法的一个例子。如果期望，例如通过本发明肽的糖基化作用，酰胺化作用，羧酸化作用，或磷酸化作用，或者通过产生酸加成盐，酰胺，酯，特别是C-末端酯，和N-酰基衍生物，能修饰本发明的肽。通过与其他部分形成共价或非共价复合物，也可以对肽抗体加以修饰，产生肽衍生物。通过在N-或C-末端使化学部分与包括肽抗体的氨基酸的侧链上的官能团连接能制备共价结合的复合物。特别地，预见所述肽能与报道基团结合，包括但不限于放射性标记，荧光标记，酶(例如，催化测热反应或荧光反应)，底物，固体基体，载体(例如，生物素或抗生物素蛋白)。因此，本发明提供一种包括肽抗体的分子，其中所述分子优选进一步包括选自放射性标记，荧光标记，酶，底物，固体基体，载体的报道基团。这样的标记是本领域技术人员公知的，例如，特别包括生物素标记。这样的标记的应用是本领域技术人员公知的，并且描述于，例如，美国专利Nos.3，817，837;3，850，752;3，996，345;和4，277，437。有用的其他标记包括但不限于放射性标记，荧光标记和化学发光标记。涉及使用这样的标记物的美国专利包括，例43如美国专利Nos.3，817，837;3，850，752;3，939，350;和3，996，345。本发明的任何肽抗体可以包括任何这些标记的一个，两个，或多个。先l隨白勺诚应用各种各样的本领域公知的技术能制备本发明的肽。例如，根据常规技术可以在溶液中或者在固相载体上合成这样的肽。各种各样的自动合成仪是商业上可获得的并且可以根据公知的方法使用。参见，例如，Stewart和Young(上文)；Tam等，J.Am.Chem.Soc.，105:6442，(1983);Merrifield，Science232:341-347(1986);Barany和Merrifield，ThePeptides,GrossandMeienhofer，编著，AcademicPress，NewYork,1-284;Barany等，Int.J.P印.ProteinRes.，30:705-739(1987);和美国专利No.5，424，398，各篇文献在此引作参考。固相肽合成方法使用共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)，含有O.l-1.0mM胺/克聚合物。这些肽合成方法使用丁基氧羰基(t-B0C)或9-芴基甲氧羰基(FM0C)保护ci-氨基。两种方法都涉及分步合成，从肽的C-末端开始每一步加上一个氨基酸(参见，Coligan等，Curr.Prot.Immunol.，WileyInterscience,1991，第9单元)。完成化学合成时，可以将合成肽去保护，去除t-BOC或FMOC氨基保护基团并且降低的温度下用酸处理从聚合物上裂解下来(例如，液体HF-10X茴香醚在0t:下处理大约0.25至大约1小时)。蒸发溶剂之后，用1%乙酸溶液从聚合物萃取出肽，然后冻干，得到粗产物。一般通过象在S印hadexG-15上使用5%乙酸作为溶剂进行凝胶过滤这样的技术进行纯化。将过柱的合适的级分冻干得到同质肽或肽衍生物，然后用标准技术进行表征，象氨基酸分析，薄层色谱法，高效液相色谱法，紫外吸收光谱法，摩尔旋光，溶解性，并且通过固相埃德曼降解定量测定。其他方法，列从噬菌体展示文库选择肽，也是可行的。可以从这里描述的数组氨基酸制备文库。噬菌体展示在鉴定根据本发明有用的肽中是特别有效的。简要地说，制备一个噬菌体文库(使用例如ml13，fd，或A噬菌体)，展示4至大约80个氨基酸残基的插入片段。插入片段可以代表，例如完全简并的或偏好排列。然后人们能选择与期望的抗原结合的噬菌体带有的插入片段。该方法通过与期望的抗原结合的噬菌体的几轮反复筛选能重复进行。重复几轮导致带有特定序列的噬菌体的富集。能进行DNA序列分子来鉴定表达肽的序列。能测定与期望的抗原结合的序列的最小线性部分。人们使用包含包含最小线性部分的部分或全部加一个或多个另外的其上游或下游简并残基的插入片段的偏好文库(biasedlibrary)能重复该方法。这些技术可以鉴定具有比其中已经鉴定的试剂大的结合亲和力的本发明的肽。不管制备肽的方法，应用标准重组DNA方法能制备编码各种肽和肽抗体的核酸分子。适当操作这样的DNA分子的核苷酸序列，不改变它们编码的氨基酸序列，解释核酸密码子的简并性并且解释特定宿主细胞中密码子偏好。重组DNA技术是制备本发明的全长肽抗体和其他蛋白质特异性结合剂或者其片段的常规方法。可以将编码肽抗体或片段的DNA分子插入表达载体，其接着可以被插入宿主细胞产生抗体或片段。—般情况下，应用这里实施例中描述的方法能获得编码肽或肽抗体的DNA分子。探针禾口典型的杂交条件是Ausubel等(CurrentProtocolsinMolecularBiology,CurrentProtocolsPress[1994])中提出的那些。杂交之后，根据象探针大小，克隆的探针的期望的同源性，筛选的文库的类型，和筛选的克隆的数目这样的因素，在合适的严谨度下洗涤探针印迹。高严谨度筛选的例子是在50-65t:之间的温度下，O.1XSSC，和0.1%SDS。也可以应用酵母二次杂交筛选来鉴定与Ang-2结合的本发明的肽。因此，可以使用抗原或者其片段来筛选肽文库，包括噬菌体展示文库，来鉴定和筛选Ang-2结合剂，例如本发明的肽抗体。或者，可以使用各种各样的表达载体/宿主系统使包含和表达本发明的肽。这些系统包括但不限于微生物，例如重组噬菌体，质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；酵母表达载体转化的酵母；病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒，TMV)转染的或者细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞体系；或者动物细胞体系。重组蛋白质生产中有用的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞，HeLa细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，COS细胞(例如C0S-7)，W138，BHK，H印G2，3T3，RIN，MDCK，A549，PC12，K562和293细胞。下文描述重组表达肽的例示方法。术语〃表达载体〃指用于DNA(RNA)序列表达多肽的质粒，噬菌体，病毒或载体。一个表达载体包括转录单元，包括下面结构的组装(1)遗传元件或者在基因表达中具有调节作用的元件，例如启动子或增强子，(2)被转录到mRNA中并且翻译成蛋白质的编码结合剂的结构或序列，和(3)合适的转录起始和终止序列。要在酵母或真核表达系统中使用的结构单元优选包括使宿主细胞胞外分泌翻译的蛋白质的前导序列。或者，没有前导序列或转运序列表达重组蛋白质的情况下，可以包括氨基末端甲硫氨酰残基。这种残基可以或可以不接着从表达的重组蛋白裂解，提供肽终产物。例如，使用商售表达系统，例如Pichia表达系统(Invitrogen，SanDiego，Calif.)，根据生产商的说明，可以在酵母中重组表达肽。这种系统还依赖指导分泌的前-原-a序列，但是甲醇诱导时醇氧化酶(A0X1)启动子驱动插入片段的转录。通过，例如，用来从细菌和哺乳动物细胞上清液纯化肽的方法，从酵母培养基纯化分泌的肽。或者，可以将编码肽的cDNA克隆到杆状病毒表达载体pVL1393(PharMingen，SanDiego，Calif.)中。可以根据生产商说明(PharMingen)使用这种载体在没有sF9蛋白质的培养基中感染Spodopterafrugiperda细胞，产生重组蛋白。使用肝素_琼脂糖凝胶柱(Pharmacia)纯化并浓縮重组蛋白。或者，在昆虫系统中表达肽。用于蛋白质表达的昆虫系统是本领域技术人员公知的。在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾核型内多角体病毒(AcNPV)能被用作在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因的载体。可以将肽编码序列克隆到病毒的不重要的区，例如多角体蛋白基因，并且置于多角体蛋白启动子的控制下。成功插入肽会使得多角体蛋白基因失活，并且产生没有外被蛋白外壳的重组蛋白。可以使用重组病毒感染草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，表达肽。Smith等，J.Virol.46:584(1983);Engelhard等，Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)91:3224-7(1994)。在另一个实施例中，通过PCR能扩增编码肽的DNA序列，并且克隆到合适的载体中，例如，pGEX-3X(Pharmacia)。设计pGEX载体产生包括谷胱甘肽_S_转移酶(GST)的载体编码的融合蛋白，和通过插入到载体克隆位点中的DNA片段编码的蛋白质。能制备包括例如一个合适的酶切位点的PCR引物。仅使用有利于表达的融合部分或者另外不期望与感兴趣的肽连接，然后从融合蛋白的GST部分切割下来重组融合蛋白。pGEX-3X/特异结合剂肽构建体被转化到大肠杆菌XL-lBlue细胞(Stratagene，LaJollaCalif.)中，并且分离各个转化体并且培养。纯化各个转化体的质粒DNA，并且使用自动测序仪部分测序，证实以合适的反向编码核酸插入片段的期望的特异性结合剂的存在。本发明的一些肽成分是其中肽抗体与任何抗肿瘤肽例如肿瘤坏死因子(TNF)偶合的那些。在特别优选的方法中，TNF-特异性结合剂肽嵌合体被制备成在读框内编码肽的序列与TNF(Novagen，Madison，Wis.)编码序列融合的重组融合体。肽-TNFcDNA可以被克隆到pET-llb在(Novagen)中，并且根据pETllb生产商的说明能诱导TNF-肽在BL21大肠杆菌中表达。通过硫酸铵沉淀法，在Phenyl-S印harose6FastFlow上进行的疏水性相互作用色谱法，在DEAE-S印haroseFastFlow上进行的离子交换色谱法，和在S印hacryl-S-300HR上进行的凝胶过滤色谱法，能从细菌溶胞产物纯化可溶性TNF-肽。可以如下纯化融合蛋白，所述融合蛋白被制备成细菌中的不溶性胞函物。离心破坏宿主细胞；在0.15MNaCl，10mMTris，pH8，ImMEDTA中洗涤；并且在室温下用0.1毫克/毫升溶菌酶(Sigma,St.Louis，Mo.)处理15分钟。超声处理澄清溶胞产物，并且通过以12，000Xg离心IO分钟沉积细胞碎屑。将含有融合蛋白的沉淀重新悬浮于50mMTris，pH8，和10mMEDTA，用50%甘油分层，并且以6，OOOXg离心30分钟。将沉淀重新悬浮于没有Mg++和Ca++的标准盐酸缓冲盐溶液(PBS)中。通过将重新悬浮的沉淀在变性SDS-PAGE(Sambrook等，上文)中分级分离而进一步纯化。凝胶在0.4MKC1中浸透，显现蛋白质，将其切下并且在没有SDS的凝胶展开缓冲液中电洗脱。如果在细菌中产生的GST/融合蛋白是可溶蛋白，可以利用GSTPurificationModule(Pharmacia)将其纯化。可以对融合蛋白进行消化，从本发明的肽切割GST。0.5mlPBS中的消化反应(20-40mg融合蛋白，20-30单位的人凝血酶(4000U/mg，Sigma)可以在室温下温育16-48小时并且加载到变性SDS-PAGE凝胶上，有利于将反应产物分级分离。凝胶在0.4MKC1中浸透，显现蛋白质泳带。通过使用自动测序仪(A卯liedBiosystemsModel473A，FosterCity，Calif.)通过氨基酸序列分析能证实相应于期望的肽分子量的蛋白质泳带的特性。或者，通过对肽进行HPLC和/或质谱能证实蛋白质泳带的特性。或者，将编码肽的DNA序列克隆到含有期望的启动子和，任选地，前导序列的质粒中[Better等，Science240:1041-43(1988)]。通过自动测序能证实这种构建体的序列。然后利用对细菌的CaC12温育和热剌激应用标准方法将质粒转化到大肠杆菌菌株MC1061中(Sambrook等，上文)。在补充有羧苄青霉素的LB培养基中培养转化的细菌，通过用合适的培养基培养能诱导产生表达的蛋白质。如果存在，前导序列能影响肽的分泌并且在分泌过程中被切割。通过下面描述的方法能从细菌培养基中纯化分泌的重组蛋白。用于重组蛋白表达的哺乳动物宿主系统是本领域技术人员公知的。对于加工表达蛋白或者产生某些翻译后修饰的特定能力选择宿主细胞菌株，所述修饰在提供蛋白质活性中有用。这样的蛋白质修饰作用包括但不限于乙酰化作用，羧化作用，糖基化作用，磷酸化作用，脂质化作用和酰化作用。与象CHO这样的宿主细胞不同，HeLa，MDCK，293，W138等具有这样的翻译后活性的特定细胞机构和特征机理，并且可以选择来确保引入的外来蛋白质46的正确修饰和加工。优选使用时间长，蛋白质生产产率高的转化细胞，因为期望这样稳定的表达。包含可选择标记以及期望的表达盒的载体一旦将这样的细胞转化，可以让细胞在富集的培养基中培养1-2天，然后换成选择性培养基。设计可选择标记给选择带来抗性，并且其存在使得成功表达引入的序列的细胞生长和回收。利用对细胞合适的组织培养技术增殖稳定转化细胞的抗性簇。可以利用很多种筛选系统来回收已经被转化重组产生蛋白质的细胞。这样的选择系统包括但不限于HSV胸腺嘧啶核苷激酶，次黄嘌呤_鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因，分别在tk-，hgprt-或即rt-细胞中。还有，抗_代谢物抗性被用作下面筛选的基础DHFR，它带来甲氨喋呤抗性；gpt，它带来霉酚酸抗性；neo，它带来氨基苷G418抗性并带来绿黄隆抗性；和hygro，它带来潮霉素抗性。可以使用的其他可选择基因包括trpB，它使得细胞利用吲哚代替色氨酸，或hisD，它使得细胞利用histinol代替组氨酸。给出用于鉴定转化体的可视指征的标记包括花色素苷，P_葡萄糖醛酸酶及其底物，GUS，和荧光素酶及其底物，荧光素。[画]蹄'性齢誦舰禾口飾#在某些情况下，本发明的特异性结合剂为了有生物活性可能需要〃重折叠〃并且被氧化为合适的三级结构并且产生二硫键。应用本领域公知的很多种方法能实现重折叠。这样的方法包括，例如，在离液剂的存在下将可溶性多肽试剂暴露给通常高于7的pH。离液剂的选择类似于胞函体增溶作用使用的选择，但是一般使用低浓度的离液剂。举例的离液剂是胍。在大多数情况下，重折叠/氧化溶液还含有还原剂加特定比例的其氧化形式，产生特定的氧化还原潜能，使得可能存在形成半胱氨酸桥的二硫化合物。一些常用的氧化还原对包括半胱氨酸/胱胺，谷胱甘肽/二硫双GSH，二氯化铜，二硫苏糖醇DTT/二噻烷DTT，和2-巯基乙醇(bME)/二硫-bME。在很多情况下，可以使用辅助溶剂提高重折叠效率。通常使用的辅助溶剂包括甘油，各种分子量的聚乙二醇，和胍。期望纯化本发明的肽和肽抗体。蛋白质纯化技术是本领域公知的。这些技术在一个水平上包括蛋白质和非蛋白质级分的分级分离。将所述肽和/或肽抗体与其他蛋白质分离之后，应用实现部分或完全纯化(或者纯化至均匀)的色谱法和电泳技术能进一步纯化感兴趣的肽或多肽。特别适合制备本发明的肽抗体和肽的分析方法是离子交换色谱法，排阻层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。纯化肽的特别有效的方法是快速蛋白质液相色谱法或HPLC。本发明的一些方面涉及纯化，在特定实施方案中，涉及本发明的肽抗体或肽的大量纯化。这里使用的术语〃纯化的肽抗体或肽〃，是意指与其他成分可分离的成分，其中将肽抗体或肽纯化至相对其天然可获得状态的任何程度。因此纯化的肽或肽抗体也称作从其天然存在的环境脱离的肽抗体或肽。—般，〃纯化的〃指经分级分离去除各种其他成分的肽或肽抗体成分，所述成分基本上保持其表达的生物活性。使用术语〃基本上纯化〃时，该概念指肽或肽抗体组合物，其中肽抗体或肽形成组合物的主要成分，例如组合物中蛋白质构成大约50%，大约60%，大约70%，大约80%，大约90%，大约95%或更多。从现有公开物来说，本领域技术人员公知很多用于定量肽或肽抗体的纯化的方法。这些包括，例如，测定活性级分特异结合活性，或者通过SDS/PAGE分析测定级分中肽或肽抗体的量。评定肽或肽抗体级分的纯度的优选的方法是计算级分的结合活性，将它与开始的提取物的结合活性比较，这样计算出纯化度，这里通过〃-折叠纯度叔"评价。用来表示结合活性的量的实际单位当然取决于选择进行纯化的特定分析技术和肽抗体或肽是否显示可检测结合活性。适合在纯化中使用的各种技术对于本领域技术人员是公知的。这些包括，例如，用硫酸铵沉淀，PEG，抗体(免疫沉淀)等或者通过热变性，接着离心；色谱步骤例如亲和色谱(例如，Protein-A-S印harose)，离子交换，凝胶过滤，反相，羟基磷灰石和亲和色谱；等电聚焦，凝胶电泳，以及这些和其他技术的组合。正如本领域公知的，相信进行各种纯化步骤的顺序是可以改变的，或者可以省略一些步骤，仍然得到制备基本上纯的特异性结合剂的合适的得到。—般不要求本发明的肽或肽抗体总是以其最纯化的状态提供。事实上，想到在一些实施方案中比基本上纯稍差的特异结合剂产物具有用途。通过组合中较少的纯化步骤，或者通过使用不同形式的相同的一般纯化方案，可以实现部分纯化。例如，知道使用HPLC设备进行的阳离子交换柱色谱一般会导致比利用低压色谱系统的相同技术更大"倍数"的纯化作用。显示低度相对纯化的方法在肽或肽抗体的总回收中，或者在肽或肽抗体的结合活性的保持中有益。已知肽或肽抗体的迁移随着SDS/PAGE的不同条件可以改变，有时改变显著[C即aldi等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，76:425(1977)]。因此明白在不同的电泳条件下，纯化或部分纯化的特异性结合剂表达产物的表观分子量可以变化。结合分析免疫结合分析一般使用与分析物耙抗原特异性结合并且经常固定分析物耙抗原的捕获剂。捕获剂是与分析物特异性结合的部分。在本发明的一个实施方案中，捕获剂是特异性结合Ang-2的肽或肽抗体或者其片段。这些免疫结合分析是本领域公知的[Asai，编著MethodsinCellBiology,Vol.37，AntibodiesinCellBiology,AcademicPress，Inc.，NewYork(1993)]。免疫结合分析常常使用标记试剂，它是捕获剂或抗原形成的结合的复合物存在的信号。标记试剂可以是包括结合的复合物的分子之一；即它可以是标记的特异性结合剂或者标记的抗特异性结合剂抗体。或者，标记试剂可以是第三分子，通常是另一种抗体，它结合结合的复合物。标记试剂可以是，例如，带有标记的抗特异性结合剂抗体。二抗，对结合的复合物是特异性的，可以没有标记，但是能被第四分子结合，第四分子对于二抗是其中一员的抗体物质是特异性的。例如，二抗可以被可检测部分修饰，例如生物素，它之后被第四分子结合，所述第四分子例如酶标记的链霉抗生物素蛋白。能特异性结合免疫球蛋白的恒定区的其他蛋白质，例如蛋白质A或蛋白质G也可以被用作标记试剂。这些结合蛋白质是链球菌细胞壁正常成分并且具有与各种物种的免疫球蛋白恒定区的强的非免疫原反应性。Akerstrom，J.Immunol.，135:2589-2542(1985);Chaubert，Mod.Pathol.，10:585-591(1997)。在分析中，每一次混合试剂之后可能要求温育和/或洗涤步骤。温育步骤可以是大约5秒至几小时，优选大约5分钟至大约24小时。但是，温育时间取决于分析形式，分析48物，溶液体积，浓度等。通常，在环境温度下进行分析，但是在一定温度范围内可以进行。A.縣争性齢！雑免疫结合鉴定法可以是非竞争性类型。这些分析有一定量的直接测量的捕获分析物。例如，在优选的〃夹心〃鉴定法中，捕获试剂(抗体或肽抗体)可以直接结合固体底物，在那里被固定。这些固定化捕获试剂然后捕获(结合)分析样品中存在的抗原。这样被固定的蛋白质然后结合标记试剂，例如带有标记的二抗。在另一个优选的〃夹心〃鉴定法中，二抗没有标记，但是可以被对二抗从中衍生的物质的抗体特异性的标记抗体结合。二抗还可以被可检测部分例如生物素修饰，第三标记分子例如链霉抗生物生蛋白能特异性结合生物素。参见Harlow禾口Lane，Antibodies,ALaboratoryManual，Ch14，ColdSpringHarborLaboratory，NY(1988)，这里引作参考。B.竞争件结合鉴定法免疫结合鉴定法可以是竞争性类型。通过测定样品中存在的分析物置换的或者从捕获试剂(抗体或肽抗体)完全去除的加入的分析物的量，间接测定样品中存在的分析物的量。在一个优选的竞争性结合鉴定法中，向样品加入通常被标记的已知量的分析物，样品然后接触捕获试剂。与抗体结合的标记分析物的量与样品中存在的分析物的浓度成反比(参见，Harlow禾口Lane，Antibodies,ALaboratoryManual，Ch14，pp.579-583，上文)。在另一个优选的竞争性结合鉴定法中，捕获试剂固定在固体底物上。通过测定蛋白质/抗体复合体中存在的蛋白质的量，或者通过测定保留的没有复合的蛋白质的量，可以测定与捕获试剂结合的蛋白质的量。通过提供标记蛋白质可以测定蛋白质的量。Harlow禾口Lane(上文)。在另一个优选的竞争性结合鉴定法中，利用半抗原抑制作用。这里，已知的分析物固定在固体底物上。向样品加入已知量的抗体，并且样品接触固定的分析物。与固定的分析物结合的抗体的量与样品中存在的分析物的量成反比。通过测定抗体的固定级分或者溶液中保留的级分可以测定固定化抗体的量。测定可以是直接的，其中抗体被标记，或者通过接着加入标记部分而间接测定，所述标记部分如上所述特异性结合抗体。C.竞争性结合鉴定法的应用竞争性结合鉴定法可以用于交叉反应测定，允许技术人员测定本发明的肽抗体识别的蛋白质或酶复合体是不是期望的蛋白质而不是交叉反应分子，或者测定融合蛋白是不是对抗原是特异性的而不结合不相关的抗原。在这种类型的鉴定法中，抗原可以固定到固体载体上并且向测试中加入未知蛋白质混合物，它会与肽抗体与固定化蛋白质的结合相竞争。该竞争分子还结合与所述抗原不相关的一种或几种抗原能。将蛋白质与肽抗体和固定化抗原结合相竞争的能力与和固体载体固定化的相同蛋白质的结合相比较，测定蛋白质混合物的交叉反应。D.其他结合鉴定法本发明还提供Western印迹法，测定或定量分析样品中Ang_2的存在。所述技术一般包括以分子量为基础通过凝胶电泳分离样品蛋白质并且将蛋白质转移到合适的固体载体，例如硝基纤维素过滤器，尼龙过滤器，或衍生化尼龙过滤器。样品和特异性结合Ang-2的肽抗体或者其片段温育并且检测得到的复合体。这些肽抗体可以直接被标记或者接着被检测，使用特异性结合肽抗体的标记抗体。49诊断分析本发明的衍生结合剂，例如肽和肽抗体或者其片段用于特征在于表达Ang-2或亚基的症状或疾病的诊断，或者用于对用Ang-2的诱导物，其片段，Ang-2活性的激动剂或抑制剂治疗的患者监测的检定中。对于Ang-2的诊断鉴定包括使用肽抗体和标记检测人体液或者细胞或组织提取物中的Ang-2的方法。本发明的肽抗体可以在有或没有修饰作用下使用。在优选的诊断鉴定法中，通过连接，例如标记或报道分子，将肽抗体标记。很多种标记和报道分子是公知的，其中的一些已经在这里描述。特别地，本发明用于人疾病的诊断。本领域公知很多种使用对各种蛋白质特异性的肽抗体测定Ang-2蛋白质的方法。例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分类(FACS)。使用与Ang-2上两个不干扰表位反应的单克隆抗体的两个位点单克隆为基础的免疫测定是优选的。这些测定方法描述于，例如，Maddox等，J.Exp.Med.，158:1211(1983)。为了提供诊断基础，通常确定人Ang-2表达的正常或标准值。在本领域公知的适合复合体形成的条件下，通过将来自正常受试者优选人的体液或细胞提取物与抗Ang-2的肽抗体混合，来实现测定。使用对照和疾病样品，通过比较肽抗体与已知量的Ang-2蛋白质的结合能定量测定标准复合体形成的量。然后，将从正常样品获得的标准值与从可能受疾病影响的受试者的样品获得的值相比较。标准值和实验值之间的偏差表明对于疾病状态中的Ang-2的作用。对于诊断应用，在一些实施方案中，本发明的肽抗体或肽一般用可检测部分标记。可检测部分可以是任何能直接或间接产生可检测信号的那些。例如，可检测部分可以是放射性同位素，例如H，C，P，S，或I，荧光或化学发光化合物，例如荧光素异硫代氰酸酯，诺丹明，或荧光素；或者酶，例如碱性磷酸酶，[P]-半乳糖苷酶，或辣根过氧化物酶。Bayer等，Meth.Enz.，184:138-163，(1990)。本发明提供用于治疗人疾病和病理状态的结合Ang-2的结合剂，例如肽，肽抗体，或者其片段，变体或衍生物。可以与其他治疗药物结合使用调节Ang-2结合活性或者其他细胞活性的试剂，以增强它们的治疗效果或者降低可能的副作用。—方面，本发明提供用于治疗特征在于细胞中不期望的或异常水平的Ang-2活性的疾病和症状的药物和方法。这些疾病包括癌症，和其他超增殖症状，例如增生，牛皮癣，接触性皮炎，免疫失调，和不孕症。本发明还提供了治疗动物包括人的癌症的方法，包括对动物施用有效量的特异性结合剂，例如抑制或降低Ang-2活性的肽抗体。本发明进一步涉及抑制癌细胞生长的方法，包括生物系统中细胞增殖，侵入，和转移过程。所述方法包括使用本发明的化合物作为癌细胞生长抑制剂。优选地，应用所述方法对活体动物例如哺乳动物抑制或减小癌细胞生长，侵入，转移，或肿瘤发生。本发明的方法还容易适合在测试系统中使用，例如，分析癌细胞生长及其性质，以及鉴定影响癌细胞生长的化合物。本发明的方法可治疗的癌症优选在哺乳动物中发生。哺乳动物包括，例如，人和其他灵长目，以及宠物或陪伴动物例如狗和猫，试验用动物例如大鼠，小鼠和兔，和农场动物例如马，猪，羊，和牛。瘤或肿瘤包括其中细胞增殖失控且进行性的组织细胞的生长。一些这样的生长是50良性的，但是其他称作恶性并且可能导致生物死亡。恶性肿瘤或癌与良性生长的区别在于，除了表现出进行性细胞增殖之外，它们可以侵犯周围的组织并且转移。此外，恶性肿瘤特征在于它们表现出较大分化损失(较大去分化)，以及相对另一种和它们周围组织的它们的组织的较大损失。这种性质也称作〃退行发育〃。本发明可治疗的肿瘤还包括实体瘤，即，癌和肉瘤。癌包括渗透(侵入)周围组织并且发生转移的得自上皮细胞的那些恶性肿瘤。腺癌是得自腺组织的癌，或者它形成可识别腺组织。另一个宽的分类或癌包括肉瘤，它们是包埋在纤丝或同质物质象胚胎缔结组织中的细胞。本发明还能治疗骨髓或淋巴系统癌症，包括白血病，淋巴瘤和一般不以肿瘤质存在而是分布在血管或淋巴网状系统中的其他癌症。能接受本发明治疗的癌或肿瘤的类型包括，例如，ACTH-产生肿瘤，急性淋巴细胞白血病，急性非淋巴细胞白血病，肾上腺内皮癌，膀胱癌，脑癌，乳腺癌，子宫颈癌，慢性淋巴细胞白血病，慢性髓细胞白血病，结肠癌，皮肤T-细胞淋巴瘤，子宫内膜癌，食管癌，Ewing's肉瘤，胆囊癌，毛状细胞白血病，头颈癌，霍奇金淋巴瘤，Kaposi's肉瘤，肾癌，肝癌，肺癌(小细胞和非小细胞)，恶性腹膜积液，恶性胸膜积液，黑素瘤，间皮瘤，多样骨髓瘤，神经胚细胞瘤，神经胶质瘤，非霍奇金淋巴瘤，骨肉瘤，卵巢癌，卵巢(胚细胞)癌，胰腺癌，阴茎癌，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，皮肤癌，软组织肉瘤，鳞状细胞癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，滋养层肿瘤，子宫癌，阴道癌，阴户癌，和Wilms'肿瘤。关于一些类型的实验确定的癌症的治疗，本发明在这里特别详细地描述。在这些详述的治疗中，使用现有技术标准体外和体内模型。这些方法能被用来鉴定预期在体内治疗方案中有效的药物。但是，明白本发明的方法不局限于这些肿瘤类型的治疗，而是延伸到源自任何器官系统的实体瘤。其侵入或转移与Ang-2表达或活性有关的癌症特别易于用本发明抑制或者甚至被诱导退化。本发明还通过包括使用下面的本发明的化合物而实施，例如与另一种抗癌化疗药物例如任何常用化疗药物结合的肽抗体。特异性结合剂与这样的其他药物结合能使化疗方案有增强的作用。熟练医师会想到很多种化疗法能结合本发明的方法。可以使用任何化疗药物，包括烷基化试剂，抗代谢物，激素和拮抗剂，放射性同位素，以及天然产物。例如，本发明的化合物能和抗生素一起给药，所述抗生素例如阿霉素和其他蒽环霉素类似物，氮芥例如环磷酰胺，嘧啶类似物例如5-氟尿嘧啶，顺铂，羟基脲，紫杉醇及其天然和合成衍生物，等。在另一个实施例中，在混合肿瘤情况下，例如乳腺癌，其中肿瘤包括促性激素依赖性和非促性激素依赖性细胞，该化合物可以和抑那通或果丝瑞宁(LH-RH的合成肽类似物)联合给药。其他抗肿瘤方案包括使用四环素化合物和另一种治疗用药程式，例如，手术，放射等，这里也称作〃辅助抗肿瘤用药程式〃。因此，本发明的方法可以使用这样的常规方案进行，好处是减小副作用并且增强药效。本发明因此提供用于治疗多种癌症，包括实体瘤和白血病，的组合物和方法。可以治疗的癌症类型包括但不限于乳腺癌，前列腺癌，和结肠癌；所有形式的肺支气管原癌；骨髓癌；黑素瘤；肝脏肿瘤；成神经细胞瘤；乳头状瘤；胺前体摄取与脱羧细胞瘤；迷芽瘤；腮原瘤；恶性癌综合症；癌心脏病；癌(例如，Walker癌，基细胞癌，basosquamous癌，Brown-Pearce癌，导管癌，Ehrlich肿瘤，Krebs2癌，梅克尔细胞，粘蛋白，非小细胞肺癌，燕麦细胞，乳头状瘤，硬癌，细支气管癌，支气管原癌，鳞状细胞癌，和移行细胞癌)；组织细胞性病；白血病；恶性组织细胞增多；Hodgkin'S病；免疫增殖小细胞肺癌；非霍金森淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮组织增殖；黑素瘤；成软骨瘤；软骨瘤；软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞肿瘤；组织细胞瘤；脂瘤；脂肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间叶瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；tophoblastic肿瘤。此外，也可以治疗下面类型的癌症腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；cyclindroma;囊腺癌；囊腺瘤；粒层细胞瘤；两性胚细胞瘤；肝细胞瘤；汗腺腺瘤；小岛细胞肿瘤；间质细胞肿瘤；乳头状瘤；塞尔托利氏细胞肿瘤；鞘细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；原粒细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节瘤；神经胶质瘤；成神经管细胞瘤；脑膜瘤；神经鞘瘤；成神经细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；副神经节瘤；副神经节瘤nonchromaffin;血管角质瘤；嗜曙红细胞增多类淋巴管增生；血管瘤硬化；多发性血管瘤；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊性肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；淋巴瘤性白血病；脂肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；赘生物；nerofibromatosis;和子宫颈发育异常。本发明的另一方面是使用本发明的材料和方法来防止和/或治疗任何皮肤超增殖症状，包括牛皮癣和接触性皮炎或者其他超增殖疾病。已经证明牛皮癣和接触性皮炎患者其身体病灶有升高的Ang-2活性[Ogoshi等，J.Inv.Dermatol.，110:818-23(1998)]。优选地，与治疗表现这些临床症状人的其他药物联合使用对Ang-2特异性的特异性结合剂。利用各种各样的载体通过这里描述的给药途径和本领域技术人员公知的其他途径能送递特异性结合剂。本发明的另一方面包括治疗各种其中涉及血管发生的视网膜病(包括糖尿病视网膜病和与年龄相关的黄斑变性)，以及女性生殖道失调/疾病，例如子宫内膜异位，子宫纤维瘤，和与功能障碍血管增生相关的女性生殖周期期间其他这样的症状(包括子宫内膜微血管生长)。本发明的另一方面涉及治疗异常血管生长，包括脑动静脉畸形(AVMs)胃肠粘膜损伤和修复，有消化系统溃疡病使患者胃十二指肠粘膜溃疡，包括中风导致的局部缺血，各种肝病中肺维管失调和非肝门高血压患者的肝门高血压。本发明的另一方面是使用本发明提供的组合物和方法预防癌症。这样的试药包括特异性结合剂例如抗Ang-2肽抗体。药物组合物Ang-2特异性结合剂例如肽抗体的药物组合物在本发明的范围内。含有抗体的药物组合物详细描述于，例如，2001年1月9日公布的Lam等人的美国专利No.6，171，586。这样的组合物含有治疗或预防有效量的特异性结合剂，例如与药学可接受试剂混合的这里描述的抗体，或者其片段，变体，衍生物或融合体。在优选的实施方案中，药物组合物含有与药学可接受试剂混合的部分或完全调节Ang-2的至少一种生物活性的拮抗剂特异性结合剂。典型地，所述特异性结合剂足够纯化，用于对动物施用。药物组合物可以含有制剂材料，用于调整，保持或维持，例如，组合物的pH，克分子渗透压浓度，粘度，澄清度，颜色，等张性，气味，无菌，稳定性，溶解或释放速度，吸附或渗透。合适的制剂材料包括，但不限于，氨基酸(例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸，亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐，碳酸氢盐，Tris-HCl，柠檬酸盐，磷酸盐，其他有机酸)；膨胀剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)，螯合剂[例如乙二胺四乙酸(EDTA)];络合剂(例如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，e-环糊精或羟丙基-e-环糊精)；填料；单糖；二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖，或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白)；着色剂；矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡粒子(例如钠)；防腐剂(例如氯化苄烷铵，苯甲酸，水杨酸，硫贡撒，苯乙醇，羟苯甲酯，羟苯丙酯，洗必太，山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油，丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(例如普流罗尼，PEG，脱水山梨糖醇酯，聚山梨酯类例如聚山梨酯20，聚山梨酯80，三硝基甲苯，氨丁三醇，卵磷脂，胆固醇，四丁酚醛)；稳定增强剂(蔗糖或山梨醇)潔张性增强剂(例如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾，甘露糖醇，山梨糖醇)；运送载体；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂(Remington'sPharmaceuticalSciences，第18板，A.R.Ge皿aro，编著，MackPublishingCompany,1990)。根据例如想用的给药途径，送递方式，和期望的剂量，本领域技术人员会确定最佳药物组合物。参见，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,上文。这样的组合物可以影响特异性结合剂的物理状态，稳定性，和体内释放速度，和体内清除速度。药物组合物中的主要赋形剂和载体性质可以是含水的或非水的。例如，合适的赋形剂或载体可以是注射用水，生理盐水或人工脑脊髓液，可能补充有肠胃外给药组合物中常用的其他材料。中性缓冲盐水或者与血清白蛋白混合的盐水是另外的举例的赋形剂。其他例示的药物组合物含有大约pH7.0-8.5的Tris缓冲液，或者大约pH4.0-5.5的乙酸缓冲液，其可以进一步包括山梨糖醇或者合适的替代物。在本发明的一个实施方案中，可以通过将具有期望程度纯度的选择的组合物和任意的配药制剂(Remington'sPharmaceuticalSciences,上文)混合成冻干块状物或水溶液而制备结合剂组合物储存。此外，利用合适的赋形剂例如蔗糖可以将结合剂产物配制成冻干剂。可以选择用于肠胃外给药的药物组合物。或者，可以选择组合物用于吸入法或肠给药例如口服，耳给药，眼给药，直肠，或阴道给药。这样的药学可接受组合物的制备在本领域技术人员能力之内。给药部位可接受的浓縮物中存在制剂成分。例如，使用缓冲液保持组合物为生理pH或者稍低的pH，一般在大约5至大约8的pH范围内。当涉及肠胃外给药时，本发明中使用的治疗性组合物可以是无热源的药学可接受赋形剂中含有期望的特异性结合剂的肠胃外可接受水溶液。用于肠胃外注射的特别合适的赋形剂是无菌水，其中结合剂被配制成无菌的，等张的溶液，使当地防腐。而另一个制备涉及用一种提供产物缓蚀或持续性释放然后通过贮存注射送递的物质，例如可注射微球体，生物可降解颗粒，聚合物化合物(聚乳酸，聚乙醇酸)，小球，或脂质体，将期望的分子制成制剂。也可以使用透明质酸，它在循环中有推广延长时间的作用。引入期望的分子的其他合适的方法包括可植入药物送递装置。另一方面，可以在水溶液，优选生理可容缓冲液例如Hanks'溶液，ringer's溶液，或者生理缓冲盐水中配制适合肠胃外给药的药物制剂。含水注射悬浮液可以含有提高悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇，或葡聚糖。另外，可以将活性化合物悬浮液制备成合适的油注射悬浮液。合适的亲油性溶剂或赋形剂包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯，三甘油脂，或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚合物可以用于送药。任选地，悬浮液还可以含有合适的稳定剂或者提高化合物溶解度的试剂，制备出高浓縮溶液。在另一个实施方案中，药物组合物可以配制成吸入法用药。例如，可以将结合剂配制成吸入用干粉末剂。也可以用用于气雾剂送药的抛射剂配制多肽或核酸分子吸入用溶液。在另一个实施方案中，可以喷洒溶液。PCT申请No.PCT/US94/001875中进一步描述了肺给药，它描述了肺给药化学修饰的蛋白质。还涉及可以口服施用一些制剂。在本发明的一个实施方案中，使用或不使用象片剂和胶囊这样的固体剂型是常规使用的那些载体，能配制以这种方式给药的结合剂分子。例如，设计胶囊，当生物利用率最大并且系统之前降解最小时，在胃肠道的一点释放制剂的活性部分。可以含有附加试剂以有利于结合剂分子的吸收。也可以使用稀释剂，矫味剂，低熔点蜡，植物油，润滑剂，悬浮剂，片剂崩解剂，和粘合剂。使用本领域技术人员公知的药学可接受载体也能将用于口服给药的药物组合物配制成适合口服给药的剂型。这样的载体使药物组合物被配制成患者摄食的片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体，凝胶，糖浆，浆液，悬浮液，等。通过将活性化合物与固体赋形剂混合并且将得到的颗粒混合加工处理(任选地，在研磨之后)，获得片剂或糖衣丸核心，能获得口服使用的药物制剂。如果期望，可以加入合适的辅助剂。合适的辅助剂包括碳水化合物或蛋白质，例如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇，和山梨糖醇；来自玉米，小麦，稻，马铃薯，或其他植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄芪胶；和蛋白质，例如明胶和胶原。如果期望，可以加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮琼脂，和海藻酸或者其盐，例如藻酸盐。糖衣丸心核可以与合适的包衣联合使用，所述合适的包衣是例如浓糖溶液，它还可以含有阿拉伯胶，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，carbopolgel，聚乙二醇，和/或二氧化钛，漆溶液，和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖丸剂包衣加入染料或颜料，用于产物识别或者表征活性化合物的量，即，剂量。可以口服使用的药物制剂还可以包括明胶制成的适合推动的胶囊，以及明胶和包衣例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。适合推动的胶囊可以含有与填料或粘合剂例如乳糖或淀粉，润滑剂，例如滑石或硬脂酸镁，和任选地，稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性化合物可以溶解于或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油，液体，液体聚乙二醇，有或没有稳定剂。另一种药物组合物可以含有与适合制备片剂的无毒赋形剂的混合物中有效量的结合剂。通过将片剂溶解于无菌水，或者其他合适的赋形剂中，可以制备单位剂量形式的溶液。合适的赋形剂包括但相比于，惰性稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠或碳酸氢钠，乳糖，或磷酸钙；或粘合试剂，例如淀粉，明胶，或阿拉伯胶；或润滑剂例如硬脂酸镁，硬脂酸，或滑石。另外的药物组合物对于本领域技术人员是显然的，包括持续性释放或缓释送药制剂中含有结合剂分子的制剂。配制各种各样的其他持续性或缓释送药方式的技术，例如脂质体载体，生物可降解微粒或者大孔小球和贮存注射液，对于本领域技术人员也是公知的。参见，例如，PCT/US93/00829，它描述了用于送递药物组合物的大孔聚合物微粒的缓释。持续性释放制剂的另外的例子包括有形物品形式的半渗透聚合物基体，例如膜，或微胶囊。持续性释放基体可以包括聚酯类，水凝胶，聚较酯(美国专利No.3，773，919，EP58，481)，L-谷氨酸和YL-谷氨酸乙酯的共聚物[Sidman等，Biopolymers，22:547-556(1983)]，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)[Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15:167—277，(1981)]和[Langer等，Chem.Tech.，12:98-105(1982)]，乙酸亚乙基乙烯酯(Langer等，上文)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP133，98S)。持续性释放组合物还包括脂质体，通过本领域公知的几种方法制备。参见，例如，Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，82:3688-3692(1985);EP36，676;EP88，046;EP143,949。用于体内施用的药物组合物一般一定要灭菌。通过灭菌过滤膜灭菌过滤能实现这样。将组合物冻干，在冻干和重新配制之前或之后可以实施利用这种方法的灭菌。用于肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或在溶液中储存。另外，一般将肠胃外组合物置于具有灭菌入口的容器内，例如，带有皮下注射针头可穿透的塞子的静脉溶液袋或小瓶。—旦配制了药物组合物，可以在灭菌小瓶中贮溶液，悬浮液，凝胶，乳状液，固体，或脱水或冻干粉末剂。可以以待用形式或者在给药之前需要重新配置的形式(例如冻干的)贮存这样的制剂。在具体的实施方案中，本发明涉及用于制备单剂量给药单位的试剂盒。试剂盒可以各自含有盛有干燥的蛋白质的第一容器和盛有含水制剂的第二容器两者。本发明范围内还包括包含单个或多个小室预装注射器(例如液体注射器和冻干剂注射器)的试剂盒。治疗上使用的药物组合物的有效量取决于，例如，治疗背景和主体。本领域技术人员明白用于治疗的适当的剂量水平是不同的，部分取决于送递的分子，使用的结合剂分子的适应征，给药途径，和患者的大小(体重，体表面或器官大小)和状况(年龄和一般的健康情况)。因此，临床医师可以确定剂量并且改变给药途径，以获得最佳治疗效果。根据上面提到的因素，典型的剂量范围是大约O.lmg/kg至最多大约100mg/kg或者更多。在其他实施方案中，剂量范围可以是O.lmg/kg最多至100mg/kg;或者lmg/kg至最多大约lOOmg/kg;或者5mg/kg至最多大约100mg/kg。对于任何化合物，开始时在细胞培养物或者动物模型例如小鼠，大鼠，兔，狗，猪，或猴中能估计治疗有效剂量。还可以使用动物模型来确定合适的浓度范围和给药途径。然后利用这样的信息来确定对人给药的有用的剂量和途径。考虑与需要治疗的受试者相关的因素确定精确剂量。调节剂量和施用，提供足够水平的活性化合物或者保持期望的作用。可以考虑的因素包括病态的严重性，受者的一般健康，受者的年龄，体重和性别，该药的时间和次数，药物联合，反应灵敏性，对治疗的反应。根据特定制剂的半寿期和清除率，可以每3-4天，每周，或者每两周施用长效药物组合物。给药次数取决于使用的制剂中结合剂分子的药物动力学参数。一般地，施用组合物，直到用量达到期望的作用。因此，可以用单剂量，或随时间多次给药(以相同或不同浓度/剂量)，或者连续输液，可以施用组合物。合适剂量的进一步精确给药方案是常规制定的。通过使用适当的剂量_反应数据，可以确定合适的剂量。药物组合物的给药途径与已知方法相一致，例如口服，通过静脉内，腹膜内，大脑内(薄壁组织内)，脑室内，肌内，眼内，动脉内，肝门内，病灶内途径注射，骨髓内，鞘内，室55内，经皮，皮下，腹膜内，鼻内，肠内，局部，舌下，尿道，阴道，或者直肠方式，通过持续性释放系统或者通过埋入装置。期望时，通过大丸剂注射，或者通过输液或者通过埋入装置连续施用组合物。或者，另外，通过埋入其上已经吸收或者包在其中有期望的分子的膜，海绵状物质，或者其他合适的材料，可以局部施用组合物。当使用埋入装置时，可以将装置埋入任何合适的组织或器官，期望的分子的送递可以通过扩散，随时间释放的大丸剂，或者连续给药。在某些情况下，期望以来自体内的方式使用药物组合物。在这样的情况下，使来自患者的细胞，组织，或器官接触药物组合物，其后接着将这些细胞，组织，和/或器官植回给患者o在另外的情况下，本发明的结合剂例如肽抗体能通过埋入利用这里描述的方法经基因工程处理表达和分泌多肽的细胞送递。这样的细胞可以是动物或人细胞，并且可以是自身的，异种的，或异基因的。任选地，细胞可以是无限增殖的。为了减小免疫应答机会，可以将细胞包在荚膜内，以避免周围组织渗透。密封材料是生物相容的半渗透聚合物外壳或膜，它允许蛋白质产物释放但是防止患者免疫系统或者周围组织的其他有害因子对细胞的破坏。联合治疗在对与Ang-2表达相关的疾病的治疗中，本发明的特异性结合剂例如肽抗体可以与其他治疗法联合应用。这些其他疗法包括，例如放射疗法，化疗，和靶向疗法，例如Herc印tinTM，RituxanTM，GleevecTM，等。没有在这里具体列出的其他联合疗法也在本发明的范围内。化疗治疗可以使用抗肿瘤药物，包括，例如，烷基化试剂，包括氮芥，例如双氯乙基甲胺，环磷酰胺，异磷酰胺，左旋溶肉瘤素和苯丁酸氮芥；亚硝基脲类，例如卡氮芥(BCNU)，洛氮芥(CCNU)，和司莫司汀(甲基-CCNU);氮丙啶/甲基三聚氰胺例如三亚乙基三聚氰胺(TEM)，三胺硫磷，硫替哌(噻替哌)，六甲基三聚氰胺(HMM，六甲蜜胺)；磺酸烷基酯，例如白消安；三嗪类，例如达卡巴嗪(DTIC);抗代谢物，包括叶酸类似物，例如甲氨喋呤和曲美沙特，嘧啶类似物，例如5-氟尿嘧啶，氟去氧尿苷，吉西他滨，胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC，阿糖孢苷)，5-氮杂胞苷，2，2'_二氟脱氧胞苷，嘌呤类似物，例如6-巯基嘌呤，6-硫代鸟嘌呤，硫唑嘌呤，2'-脱氧助间型霉素(喷司他丁)，赤型羟基壬基腺嘌呤(EHNA)，磷酸氟达拉滨，和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨，2-CdA);天然产物，包括抗有丝分裂药物，例如紫杉醇，长春花生物碱，包括长春碱(VLB)，长春新碱，和长春烯碱，脱乙酰基紫杉醇，雌莫司汀，和盐酸雌莫司汀；卯ipodophylotoxins例如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素例如actimomycinD，柔毛霉素(柔红霉素)，阿霉素，二羟蒽二酮，去甲柔毛霉素，博莱霉素，光辉霉素(普卡霉素)，丝裂霉素C，和放线菌素；酶例如L-天冬酰胺酶；生物学反应改性剂例如干扰素_a，IL-2，G-CSF和GM-CSF;各种药物例如铂复合物例如顺铂和卡铂，蒽二酮类例如二羟蒽二酮，取代的脲例如羟基脲，甲基肼衍生物包括N-甲基肼(MIH)和甲苄肼，肾上腺皮质抑制剂例如米托坦(o，p'-DDD)和安鲁米特；激素和拮抗剂包括肾上腺皮质激素甾族化合物拮抗剂例如强的松和等价物，地塞米松和安鲁米特；孕激素例如长效黄体酮，甲羟孕酮乙酸盐和甲地孕酮乙酸盐；雌激素例如己烯雌酚和乙炔基雌二醇等价物；抗雌激素例如他莫西芬；雄激素包括丙酸睾丸和氟甲睾酮/等价物；抗雄激素例如氟他胺，促性腺素释放激素类似物和抑那通；和非甾族抗雄激素例如氟他胺。和生长因子的联合治疗包括细胞因子，淋巴因子，生长因子，或者其他造血因子，例如M-CSF，GM-CSF，TNF，IL_1，IL_2，IL_3，IL_4，IL_5，IL_6，IL_7，IL_8，IL_9，IL-IO，IL-ll，IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18,IFN，TNF0，TNF1，TNF2，G-CSF，Meg-CSF，GM-CSF，血小板生成素，干细胞因子，和红细胞生成素。其他成分包括已知的血小板生成素，例如Ang-1，-2，-4，-Y，和/或人Ang-样多肽，和/或血管内皮生长因子(VEGF)。生长因子包括血管生成素，骨形态发生蛋白-l，骨形态发生蛋白_2，骨形态发生蛋白_3，骨形态发生蛋白_4，骨形态发生蛋白_5，骨形态发生蛋白-e，骨形态发生蛋白_7，骨形态发生蛋白-S，骨形态发生蛋白_9，骨形态发生蛋白-IO，骨形态发生蛋白-ll，骨形态发生蛋白-12，骨形态发生蛋白_13，骨形态发生蛋白_14，骨形态发生蛋白_15，骨形态发生蛋白受体IA，骨形态发生蛋白受体IB，脑起源神经营养因子，睫状营养佳良因子，睫状神经营养因子受体，细胞因子-诱导的嗜中性白细胞趋化因子l，细胞因子-诱导的嗜中性白细胞趋化因子2，内皮细胞生长因子，内皮素l，表皮生长因子，来自上皮的嗜中性白细胞诱引剂，成纤维细胞生长因子4，成纤维细胞生长因子5，成纤维细胞生长因子6，成纤维细胞生长因子7，成纤维细胞生长因子8，成纤维细胞生长因子8b，成纤维细胞生长因子8c，成纤维细胞生长因子9，成纤维细胞生长因子IO，酸性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，得自神经胶质细胞系的嗜中性细胞因子受体-1，得自神经胶质细胞系的嗜中性细胞因子受体_2，生长相关蛋白质，生长相关蛋白质-1，生长相关蛋白质_2，生长相关蛋白质-3，肝素结合表皮生长因子，肝细胞生长因子，肝细胞生长因子受体，胰岛素_样生长因子I，胰岛素-样生长因子受体，胰岛素-样生长因子II，胰岛素-样生长因子结合蛋白，角质形成细胞生长因子，白血病抑制因子，白血病抑制因子受体-l，神经生长因子，神经生长因子受体，神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4，胎盘生长因子，胎盘生长因子2，得自血小板的内皮细胞生长因子，得自血小板的生长因子，得自血小板的生长因子A链，得自血小板的生长因子AA，得自血小板的生长因子AB，得自血小板的生长因子B链，得自血小板的生长因子BB，得自血小板的生长因子受体-l，得自血小板的生长因子受体_2，pre-B细胞生长剌激因子，干细胞因子，干细胞因子受体，转化生长因子-l，转化生长因子-2，转化生长因子-1.2，转化生长因子_3，转化生长因子_5，潜伏型转化生长因子-1，转化生长因子-1结合蛋白I，转化生长因子-1结合蛋白II，转化生长因子-l结合蛋白III，肿瘤坏死因子受体I型，肿瘤坏死因子受体II，尿激酶型纤溶酶原激活剂受体，血管内皮生长因子，及其嵌合蛋白和生物学或免疫学活性片段。免疫治疗免疫治疗一般依赖定向并破坏癌细胞的免疫效应子细胞和分子的使用。免疫效应子可以是，例如，识别靶细胞表面上的一些标记的本发明的肽抗体。单独的肽抗体可以用作治疗的效应子或者它可以补充其他细胞来实际实施细胞杀伤。肽抗体也可以偶联药物或毒素(化疗药物，放射性核素，蓖麻毒A链，霍乱毒素，百日咳毒素，等)，因此可以只作为靶向试齐U。根据本发明，本发明的免疫疗法肽抗体或肽抗体偶合物可以靶向Ang-2的突变体形式。特别涉及本发明的肽抗体组合物可以与结合Ang-2靶向治疗的治疗方法联合应用。已经证明被动免疫疗法对于抗多种癌症特别有效。参见，例如，W098/39027。下面的实施例只是为了详细说明的目的，而不应该认为在任何方面限制本发明的范围。实施例1病理组织和iH常组织中Ang-2表汰利用原位杂交检查正常和病理组织中Ang-2表达。通过逆转录酶_PCR从人或鼠胎儿肺cDNA扩增人(GenbankAccessionNumber:AF004327，核苷酸1274-1726)和鼠(GenbankAccessionNumber:AF004326，核苷酸1135-1588)Ang-2序列的片段，克隆到质粒pGEM-T中，并且通过测序证实。使用33P_UTP和RNA聚合酶从线性化质粒模板转录33P_标记反义RNA探针。甲醛固定化的石蜡包埋的组织块切成5微米，并且收集在带电载玻片上。原位杂交之前，组织用0.2MHCL，接着用蛋白酶K消化，并且用三乙醇胺和乙酸酐进行乙酰化作用。55t:下切片与放射性标记探针杂交过夜，然后进行RNA酶消化，并且在大约0.1XSSC在55t:下高严谨性洗涤，将载玻片浸入SlidesweredippedinKodakNTB2乳剂中，4"下暴露2-3周，显影，并且复染色。在黑暗区和标准照明下检查切片，同时评价形态学和杂交信号。结果表明正常产后人，Ang-2表达限于包含血管发生脉管系统的少数组织，例如卵巢，胎盘，和子宫。在正常成年人心脏，脑，肾，肝，肺，胰腺，脾，肌肉，扁桃体，胸腺，阑尾，淋巴结，胆囊，前列腺或睾丸和子宫中没有可检测的Ang-2表达。在五周大小的小鼠(而不是成年猴子或人)，肾显示直小管中显著的Ang-2表达。为了确定这种表达是不是胚胎发育遗留的，使用鼠Ang-2探针和上述条件对最大一年龄大小的小鼠源的肾反复进行这项实验。在新生儿发育期发现Ang-2表达降低，但是一年龄小鼠的肾中仍然明显。事实上对试验的所有肿瘤类型检查了Ang-2表达，包括，原发性人肿瘤，例如结肠癌(5例)，乳房癌(10例)，肺癌(8例)，恶性胶质瘤(1例)，转移性人肿瘤，例如乳房癌(2例)，肺癌(2例)，和卵巢癌(2例)，已经转移到脑，和啮齿动物肿瘤模型例如C6(大鼠神经胶质瘤)，HT29(人结肠癌)，Colo-205(人结肠癌)，HCT116(人结肠癌)，A431(人表皮样瘤)，AS73(人横纹肌肉瘤)，HT10S0(人纤维肉瘤)，PC-3(人前列腺癌)，B1SF10(鼠黑素瘤)，MethA(鼠肉瘤)，和Lewis肺癌。另外，对反应VEGF的生长到Matrigel栓中的新血管和早产视网膜病小鼠低氧症模型检查Ang-2表达。实施例2评价Ang-2肽抗体的分子测定进行分子测定(亲和力ELISA，中和作用ELISA，和BIAcore)评价结合Ang-2和相关家族成员的直接肽抗体，以及肽抗体对Ang-2:Tie-2相互作用的作用。下面详细描述这些体外试验。亲和力ELISA为了最初筛选侯选抗-Ang-2肽抗体，使用纯化的人Ang_2(R&DSystems，Inc;目录号623-AN;Ang-2以2个截短型的混合物被提供)或鼠Ang-2多肽(如上所述制备)。为了证实结合测试，从用全长人Ang-2DNA转染的人293T细胞的条件培养基获得人Ang-2并且在含有大约50微克/毫升牛血清白蛋白(BSA)的无血清Dulbecco's修饰的Eagle培养基(DMEM)中培养。使用微量滴定板，向每个孔加入大约100微升/孔Ang-2，并且将板温育大约2小时，然后用含有大约0.1%Tween-20的磷酸缓冲盐水(PBS)将板冲洗四次。然后对于每孔用250微升的大约5%BSA的PBS溶液封闭各孔，板在室温下温育大约2小时。温育之后，弃除过量的封闭溶液，向孔中加入大约100微升的各种侯选抗-Ang-2肽抗体，稀释系列开始浓度是大约40毫微摩尔，然后在含有大约1%BSA的PBS中系列稀释4倍。培养板然后在室温下温育过夜。温育之后，用含有大约0.1%Tween-20的PBS冲洗平板。将冲洗又重复四次，然后向每孔加入在含有1%BSA的PBS中1:5000预先稀释的山羊抗-人IgG(Fc)-HRP(PierceChemicalCo.，catalog#31416)大约100微升。培养板在室温下温育大约1小时。然后在含有大约O.1%Tween-20的PBS冲洗平板五次，然后每孔加入大约100微升的TMB(3，3'，5，5'_四甲基联苯胺液体底物体系；SigmaChemicalCompany,St丄ouis，Mo.，目录号T8665)底物，并且将培养板温育大约5_15分钟直到显示蓝色。然后在分光光度计上在大约370nm读取吸光度。中和作ELISA根据对于亲和力ELISA所描述的制备结合了Ang_2多肽的微量滴定板。在含有大约1%BSA和大约InMTie-2(以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie_2部分只含有该分子的可溶性胞外部分；R&DSystems,目录号313-TI)的PBS溶液中以4倍稀释度从lOOOnM至0.2pM滴定侯选抗-Ang-2肽抗体。向各孔加入大约100微升的抗体/Tie_2溶液之后，培养板在室温下温育过夜，然后用含有大约0.1%Tween-20的PBS清洗五次。冲洗之后，每孔加入大约100微升的抗-Tie-2抗体(PharmingenInc.，catalog#557039)，最终浓度达到大约1微克/毫升，培养板在室温下温育大约1小时。接着，以含有大约1%BSA的PBS中以1:10，000的稀释度每孔加入大约100微升山羊抗-小鼠-IgG-HRP(PierceChemicalCO.，catalogft31432)。培养板在室温下温育大约1小时，然后用含有大约0.1%Tween-20的PBS清洗五次。然后每孔加入大约100微升的TMB底物(如上所述)，使得显色。然后在分光光度计上在大约370nm读取吸光度。亲禾口力BIAcore使用PBS和O.005XP20表面活性剂(Biacore，Inc.)作为洗脱缓冲液在BIAcore2000(Biacore，Inc.，Piscataway，N.J.)上进行各种侯选Ang_2肽抗体的亲和力分析。使用AmineCouplingKit(Biacore，Inc.)根据供应商建议的方法通过伯胺基团将重组蛋白质G(R印ligen，Needham，Mass.)固定到研究级CM5传感器芯片(Biacore，Inc.)上。通过首先将大约lOORu的各种侯选抗-Ang-2肽抗体捕获到固定的蛋白质G，然后以50微升/分钟的流速向结合的抗体表面注射各种浓度的(0-100nM)的huAng-2或mAng-2三分钟，进行结合分析。应用BIA求值3.1计算机程序(Biacore，Inc.)测定肽抗体结合动力学参数，包括ka(缔合作用速度常数)，kd(离解作用速度常数)和Kd(寓解平衡常数)。离解平衡常数越低，表明肽抗体对Ang-2的亲和力越大。实施例3Ang-2结合肽的鉴定1.Ang-2-包被磁珠制备A.Ang-2在磁珠上的固定化对于非特异性洗脱，对于全部三轮筛选，以每100微升从生产商处得到的小珠原液大约4微克生物素化Ang-2蛋白质的浓度，将生物素化Ang-2蛋白质(BiotinylatedRecombinantHumanAngiopoietin-2，R&DSystems,Inc.;目录号BT623)固定在Str印tavidinDynabeads(Dynal，LakeSuccess,N.Y.)上。对于第二轮筛选，对于抗原(Ang-2)和受体(Tie-2)洗脱，2微克生物素化Ang-2蛋白质固定在50微升的Str印tavidinDynabeads上。对于第三轮筛选，将包被浓度减小到每50微升小珠原液大约1微克生物素化Ang-2蛋白质。通过使用磁子将小珠拉到试管的一边并且汲出液体，用磷酸缓冲盐水(PBS)将小珠清洗五次并且再次悬浮于PBS。以上述浓度对清洗过的小球加生物素化Ang-2蛋白质，并且室温下转动温育1小时，接着转动下fC下温育几小时至过夜。然后通过加入BSA至大约1%终浓度并且转动下41:下温育过夜，封闭Ang-2-包被小珠。然后用PBS将得到的Ang-2包被小珠清洗五次，然后进行筛选程序。B.阴性筛选小珠制备另外制备小珠用于阴性筛选。对于各种筛选条件，使用500微升从生产商处得到的小珠原液进行上述程序(lA部分)，除了省略用生物素化Ang-2温育步骤。在最后清洗步骤中，将小珠分为五个100微升等份。2.Ang-2结合噬菌体的筛选A.总的策略使用三个丝状噬菌体文库，称作〃TN8-IX〃(5X109独立转化体)，"TN12-I"(1.4X1()9独立转化体)，和〃Linear"(2.3X109独立转化体)(都从DyaxCorp.获得)，来筛选Ang_2结合噬菌体。然后用各个文库进行非特异性洗脱，Ang-2洗脱，和受体洗脱(Tie-2)。对于Ang-2使用九种不同的筛选条件(利用非特异性洗脱方法的TN8-IX，利用Ang-2洗脱方法的TN8-IX，利用Tie_2洗脱方法的TN8-IX，利用非特异性洗脱方法的TN12-I，用Ang-2洗脱方法的TN12-I，和利用Tie_2洗脱方法的TN12-I，利用非特异性洗脱方法的Linear,用Ang-2洗脱方法的Linear,和利用Tie_2洗脱方法的Linear)。对于所有这三种文库，在非特异性方法中，从第一轮筛选中只洗脱出用于再几轮筛选的噬菌体。在第二和第三轮筛选中使用Ang-2和Tie-2洗脱。对于Linear文库，仅第二轮对Ang-2和Tie-2洗脱进行筛选。B.阴性筛选关于筛选条件，从文库中原种分出对于TN8-IX和TN12-I文库大约100个(对于TN8-IX大约5X10"pfu，对于TN12-I大约1.4X10"pfu)，对于线性文库大约10个(大约1X10"pfu)随机库等价物等份，并且用PBST(含有0.05%Tween-20的PBS)大约400微升稀释。最后洗涤之后，从第一个制备用于阴性筛选(1B章节)的小珠100微升等份汲出液体，向小珠加大约400微升稀释的文库原种。旋转下，得到的混合物在室温下温育大约10分钟。用磁子汲出噬菌体上清液，并且加给第二个IOO微升等份用于另一个阴性筛选步骤。用这种方法，进行五次阴性筛选步骤。C.使用Ang-2蛋白质包被珠进行筛选将最后阴性筛选步骤之后的噬菌体上清液(1B章节)加给Ang-2包被珠(1A章节)。该混合物在旋转下室温下温育l-2小时，使噬菌体与靶蛋白质结合。弃除上清液之后，用PBST将珠清洗大约10次，接着用PBS清洗两次。D.非特异性洗脱排除最后的清洗液之后(2C部分)，将大约1毫升的MinA盐溶液(60mMK2HP04，33mMKH2P04，7.6mM(NH4)S04，和1.7mM柠檬酸钠)加给小珠。将这种小珠混合物直接加给浓縮细菌样品用于感染(参见下面的3A和3B章节)。E.被结合噬菌体的抗原(Ang-2)洗脱对于第二轮2，最后清洗步骤之后(2C章节)，通过加入100微升的lpM，O.lnM，禾口10nM重组Ang-2蛋白质(RecombinantHumanAngiopoietin-2，R&DSystems,Inc.，Minne即olis，Minn.)，对于每一个条件继续温育30分钟，从磁珠洗脱被结合噬菌体。非特异性洗脱保留的噬菌体(2D章节)。合并10nM和非特异性洗脱洗脱出的噬菌体，让它们进行第三轮筛选(参见下面的第4章节)。对于第3轮，最后清洗步骤之后(2C章节)，通过加入大约lnM重组Ang-2蛋白质，和10nM重组Ang-2蛋白质，对于每一个条件继续温育30分钟，从磁珠洗脱被结合噬菌体。另外，在旋转装置上用1毫升的100mM三乙胺溶液(Sigma，St.Louis，Mo.)洗脱噬菌体大约10分钟。用0.5毫升的1MTris-HCl(pH7.5)中和含有噬菌体的三乙胺溶液的pH。最后用lOOmM三乙胺溶液洗脱之后，通过对细菌加小珠而洗脱留下的噬菌体(2D章节)。F.被结合噬菌体的受体(Tie-2)洗脱对于第二轮2，最后清洗步骤之后(2C章节)，通过加入大约IOO微升的lpM，0.lnM，和10nM重组Tie-2蛋白质(重组人Tie-2-Fc嵌合体，R&DSystems,Inc.，Minne即olis，Minn.)，对于每一个条件继续温育30分钟，从磁珠洗脱被结合噬菌体。非特异性洗脱保留的噬菌体(2D章节)。合并10nM和非特异性洗脱洗脱出的噬菌体，让它们进行第三轮筛选(参见下面的第4章节)。对于第3轮，最后清洗步骤之后(2C章节)，通过加入大约lnM重组Ang-2蛋白质，和10nM重组Tie-2蛋白质，对于每一个条件继续温育30分钟，从磁珠洗脱被结合噬菌体。另外，在旋转装置上用1毫升的100mM三乙胺溶液(Sigma，St.Louis，Mo.)洗脱噬菌体大约10分钟。用0.5毫升的1MTris-HCl(pH7.5)中和含有噬菌体的三乙胺溶液的pH。最后用lOOmM三乙胺溶液洗脱之后，通过对细菌加小珠而洗脱留下的噬菌体(2D章节)。3.扩增A.平板细胞的制备新鲜大肠杆菌(XL-lBlueMRF')培养物在含有大约12.5微克/毫升四环素的LB培养基中生长至0D6。。为大约0.5。对于每一个筛选条件，在冰上冷却大约20毫升的这种培养物并且离心。将细菌颗粒重新悬浮于大约l毫升的MinA盐溶液。B.转导向浓縮细菌样品(3A章节)加入上述各种不同洗脱方法(2D，2E和2F章节)得到的各种混合物，并且在大约37t:下温育大约15分钟。向各混合物加入大约2毫升的NZC预培养基(2XNZC预，50微克/毫升氨苄青霉素)，并且在大约37t:下温育大约15分钟。得到的4毫升溶液在含有大约50微克/毫升氨苄青霉素的大NZCYM琼脂板上平板培养，并且在37t:下温育过夜。C.噬菌体收集各种细菌/噬菌体混合物在大NZC预琼脂板(3B章节)上培养过夜，然后将它们破碎移到大约35毫升的LB培养基中。琼脂板进一步用另外的35毫升的LB培养基漂净。将LB培养基中得到的细菌/噬菌体混合物离心使细菌成颗粒状物。然后将大约50毫升的噬菌体上清液移至一个新试管中，加入大约12.5毫升的PEG溶液(20%PEG8000，3.5M乙酸铵)并且在冰上温育2小时使噬菌体沉淀。将沉淀的噬菌体离心出并且重新悬浮于6毫升61的噬菌体再悬浮缓冲液(250mMNaCl，lOOmMTrispH8，ImMEDTA)中。通过离心进一步纯化这种噬菌体溶液去除残留的细菌，并且通过加入大约1.5毫升的PEG溶液第二次沉淀噬菌体。离心步骤之后，将噬菌体沉淀再次重新悬浮于大约400微升的PBS。让这种溶液最后离心以清除任何残留细菌碎屑的溶液。利用标准噬斑形成测试滴定得到的噬菌体制剂。4.附加筛选和扩增在第二轮中，将第一轮(3C章节)得到的扩增的噬菌体制剂(大约l(Tpfu)用作输入噬菌体进行筛选和扩增步骤(第2和3章节)。对于Ang-2和Tie-2洗脱，将来自lOnM个非特异性洗脱的噬菌体合并并且扩增，用于第三轮筛选。从第二轮得到的扩增的噬菌体制剂(大约109pfu)接着被用作输入噬菌体进行第三轮筛选和扩增(第2和3章节)。第三轮洗脱步骤之后(2D，2E，和2F章节)，对洗脱出的小级分制成平板进行噬斑形成分析(3C章节)。取各噬斑并且在每孔含有100微升TE缓冲剂的96孔微量滴定板上平板培养。将这些主板在4t:下温育过夜，使噬菌体洗脱到TE缓冲液中。5.克降分析通过噬菌体ELISA和DNA技术分析噬菌体克隆。以这两个测试合并的结果为基础排列序列。A.噬菌体ELISAXL-1BlueMRF'培养物生长至0D6。。达到大约0.5。大约30微升的这种培养物分成等份加给96孔微量滴定板的每个孔中。向各孔加入大约10微升洗脱的噬菌体(第4部分)并且让细菌在室温下传染大约15分钟。向各孔加入大约100微升的含有大约12.5微克/毫升四环素和大约50微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基。微量滴定板然后在摇动下在大约37t:下温育过夜。让重组Ang-2蛋白质(大约1微克/毫升PBS溶液)在大约4°C下与96孔Maxisorp板(NUNC)结合过夜。作为对照物，以大约大约2微克/毫升PBS溶液将纯链霉抗生物素蛋白包被到分开的Maxisorp板上。第二天，弃除蛋白质包被的Maxisorp板中的液体，大约4。C下用大约300微升的5%奶溶液将各个孔封闭过夜(或者，室温下封闭1小时)。然后弃除奶溶液，并且用PBST溶液将孔清洗三次。最后清洗步骤之后，向蛋白质包被的Maxisorp板中的各个孔加入大约50微升的PBST-4X奶液。向Ang-2包被的平板和对照物链霉抗生物素蛋白包被的平板的相应的孔移入从96孔微量滴定板的每个孔中汲出的大约50微升的过夜培养物。室温下将各类型板中100微升混合物温育大约1小时。弃除Maxisorp板中的液体，并且用PBST将孔清洗三次。将HRP-偶合的抗-M13抗体(AmershamPharmaciaBiotech)稀释至大约1:7，500，并且向Maxisorp板的各孔加入大约100微升稀释溶液，在室温下温育大约1小时。再次弃除液体，并且用PBST将孔清洗大约五次。向各孔加入大约100微升的TMB底物(Sigma)，并且用大约50微升的5N!12504溶液终止反应。在分光光度计(MolecularDevices)上读取0D45。。B.噬菌体克隆测序对于每一个噬菌体克隆，利用PCR制备测序模板。下面的寡核苷酸对被用来扩增大约500个核苷酸片段引物1:5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG—3'(SEQIDNO:54)引物2:5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3'(SEQIDNO:55)对于各个克隆制备下面的混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>对于PCR，使用热循环控制装置(GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBiosystems)进行下面的程序94。C，5分钟;(94°C30秒，55°C30秒，72°C45秒)x30个循环；72。C7分钟;冷却至4t:。使用QIAquickMultiwellPCR纯化试剂盒(Qiagen)，根据厂商说明，将各反应的PCR产物纯化。然后通过在1%琼脂糖凝胶上对含有大约1微升染料的(K^BBXS琼脂糖凝胶加载颜料)的各种PCR反应混合物大约10微升进行电泳来分析纯化的PCR产物。然后使用ABI377测序仪(PerkinElmer)根据厂商推荐的方法对保留的产物测序。6.序列排列和共有序列测定A.序列排列和分析可变核苷酸序列翻译的肽序列(5B章节)与ELISA数据有相关性。在Ang_2包被孔中表现高0D45。并且在链霉抗生物素蛋白包被孔中表现低0D45。的克隆具有较高优先排列。出现多次的序列也具有较高优先排列。根据这些标准选择候选序列用于进一步肽或肽抗体分析。B.共有序列测定如下从TN8-IX文库产生三类不同的共有基序KRPCEEXWGGCXYX(SEQIDNO:56)KRPCEEXFGGCXYX(SEQIDNO:57)XXXCXDXYWYCXXX(SEQIDNO:61)XXXCXDXYTYCXXX(SEQIDNO:62)XXXCXDXFWYCXXX(SEQIDNO:63)XXXCXDXFTYCXXX(SEQIDNO:64)XXXCXWDPWTCEXM(SEQIDNO:58)从TN12-I文库产生一个共有基序XCAWFXQXXXXXCEJiX(SEQIDNO:59)对于所有的共有基序序列，通过测定各个位置上最经常出现的氨基酸而获得各个共有序列的下划线〃核心氨基酸序列"。〃X"指任何天然存在的氨基酸。两个与核心序列邻接的半胱氨酸是TN8-IX和TN12-I文库中固定的氨基酸。下面的表3中给出经鉴定与Ang-2结合的肽。表3Ang-2结合肽63<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>实施例4编码肽抗体的DNA的构建使用选择为对Ang-2:Tie_2结合(参见表3)有潜在抑制性的修饰的肽来构建融合蛋白，其中各个肽单体或者各个肽的串联二聚体(单体单元之间有连接体)读框内与编码连接体的DNA融合，后面接人IgGl的Fc区。通过寡核苷酸("寡聚物")对淬火产生编码肽和连接体的多核苷酸双螺旋来构建各个修饰的肽，所述连接体，根据所述肽，由或者五个甘氨酸残基，或者八个甘氨酸残基或一个赖氨酸残基组成；这些构建体被制备成Ndel至Xhol片段。这些双螺旋多核苷酸分子连接包含人Fc基因在载体(pAMG21-FcN-末端，下文进一步描述)，其预先用Ndel和Xhol消化。利用标准方法通过电穿孔将得到的连接混合物转化到大肠杆菌菌株2596细胞(GM221，下文进一步描述)中。对克隆筛选产生重组蛋白质产物并且具有正确的核苷酸序列的融合基因的能力。对于每一种修饰的肽选择单一的这样的克隆(即，Fc-肽融合产物)。MMG21-FcN-末端载体MMG21的构建處G21表达质粒pAMG21(ATCCNo.98113)得自表达载体pCFM1656(ATCCNo.69576)和美国专利No.4，710，473中描述的表达载体系统，根据公开的国际专利申请W000/24782中描述的方法(参见实施例2部分，第100-103页，以及附图17A和17B)。FcN-末端载体使用大肠杆菌菌株3788，pAMG21Tpo_Gly5_Fc单体，作为模板，构建FcN-末端载体。W000/24782中可以找到该菌株克隆的信息(参见实施例2和附图10)。设计5'PCR引物(下文进一步描述)去除pAMGTpoGly5中的Tpo肽序列并且用包含ApaLI和Xhol位点的聚连接体置换它。使用菌株3788作为模板，使用E邓andLong聚合酶进行PCR，使用SEQIDN0:8寡核苷酸，下面的，作为5'弓l物和通用3'引物，SEQIDN0:9，下面的。得到的PCR产物被凝胶纯化并且用限制酶NdeI和BsrGI消化。利用Qiagen(Chatsworth，Calif.)凝胶纯化旋转柱凝胶纯化质粒和编码带有其连接体的感兴趣的肽的多核苷酸。然后利用标准连接技术连接质粒和插入物，并且将得到的连接混合物转化到大肠杆菌细胞(菌株2596)中。选取单克隆并且进行DNA测序。鉴定正确的克隆并且这个被用作这里描述的修饰的肽的载体来源。5'引物;GGCGGTGGGGACA(SEQIDNO:8)3'引物:GGTCATTACTGGACCGGATC(SEQIDNO:9)除了将这些修饰的肽制成与Fc的N-末端融合体(N-末端肽抗体)之外，也将它们中的一些制成c-末端融合产物(c-末端肽抗体)。下面描述用于制备c-末端融合体的载体。FcC-末端载体的构建使用大肠杆菌菌株3728，pAMG21Fc_Gly5_Tp0单体，作为模板，构建FcC_末端载体。WO00/24782中可以找到该菌株克隆的信息(参见其实施例2和附图7)。设计3'PCR引物(SEQIDNO:10)去除Tpo肽序列并且用包含ApaLI和Xhol位点的聚连接体置换它。使用菌株3728作为模板，使用E邓andLong聚合酶进行PCR，使用通用5'引物(SEQIDNO:11)和上述3'引物。得到的PCR产物被凝胶纯化并且用限制酶BsrGI和BamHI消化。利用Qiagen凝胶纯化旋转柱凝胶纯化质粒和编码带有其连接体的感兴趣的各个肽的多核苷酸。然后利用标准连接技术连接质粒和插入物，并且将得到的连接混合物转化到大肠杆菌细胞(菌株2596)中。选取单克隆并且进行DNA测序。鉴定正确的克隆并且这个被用作这里描述的修饰的肽的载体来源。5'引物:CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG(SEQIDNO:10)3'引物:TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCTTTCTGTGCACCACCACCTCCACCTTTAC(SEQIDNO:11)GM221(#2596).宿主菌株#2596，用于表达Fc_肽融合蛋白，是经修饰包含lux启动子，和早期ebg区中温度灵敏A阻抑物cI857s7和晚期ebg区中lacIQ阻抑物两者的大肠杆菌K-12菌株。这两个阻抑物基因的存在允许这种宿主使用带有各种表达系统。这种菌株的ATCC登记号是202174。实施例5隨翻燃在大肠杆菌中表汰.37"下大肠杆菌GM221中各个pAMG21_Fc融合构建体的培养物在TerrificBroth培养基(参见Tartof禾口Hobbs，〃Improvedmediaforgrowingplasmidandcosmidclones"，BethesdaResearchLabsFocus，第9巻，12页，1987，上文提到的Sambrook等参考文献中引述)中培养。向培养基中加入合成的自身诱导剂，N_(3_氧己酰基)-DL-高丝氨酸内酯，达到每毫升20纳克(ng/ml)的最终浓度之后，实现从1uxPR启动子的基因产物表达的诱导。将培养物在37t:下温育另外的6小时。然后通过显微镜检查对细菌培养物检查包函体的存在并且离心收集。在诱导的培养物中发现可折射包函体，表明Fc-融合体最可能在大肠杆菌中的不溶级分中产生。通过在含有10%P-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液中再次悬浮而直接溶解细胞颗粒状物，然后通过SDS-PAGE加以分析。在大多数情况下，在SDS-PAGE凝胶上发现合适分子量的强考马斯兰染色泳带。皿利用高压匀化作用(两个道是14，000PSI)在水(1/10)中将细胞破碎，并且离心收集包函体(4000RPM，J-6B离心机，1小时)。以1/10的比例将包函体溶解于6M胍，50mMTris，10mMDTT，pH8.5，l小时。对于与Fc融合的线性肽，用2M脲，50mMTris，160mM精氨酸，2mM半胱氨酸，pH8.5将溶解的混合物稀释25倍。4。C下将氧化作用进行2天，让形成二硫键键合的化合物(即，Fc-肽同二聚体)。对于与Fc融合的环肽，加上下面三个折叠条件实施相同的方法(1)2M脲，50mMTris，160mM精氨酸，4mM半胱氨酸，lmM胱胺，pH8.5;(2)4M脲，20X甘油，50mMTris，160mM精氨酸，2mM半胱氨酸，pH8.5;和(3)4M脲，20X甘油，50mMTris，160mM精氨酸，4mM半胱氨酸，lmM胱胺，pH8.5。用1.5M脲，50mMNaCl，50mMTris，pH9.0透析再折叠的蛋白质。用乙酸将该混合物的pH降低至pH5。离心去除沉淀，根据各个融合产物的等电点，将上清液调节至pH为5至6.5。过滤蛋白质并且4t:下加载到SP-S印haroseHP柱子上，柱子用20mMNaAc，50mMNaCl，对各个构建物测定的pH中平衡过。用50mMNaCl至500mMNaCl范围相同的缓冲液，用20-柱体积线性梯度洗脱蛋白质。合并个峰流出液并且过滤。下面的表4中给出了利用上述方法产生的肽抗体。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>在表4中，〃Fc"指人FcIgGl序列。第二栏给出肽抗体的氨基酸序列。其Fc部分标记为〃Fc"，并且是下面SEQIDN0:60中给出。要明白使用标记的情况下，例如，〃Con4〃或〃Con-4〃，这指Con-4肽，其中其上使用的后缀〃C〃，〃(C)"，，或〃-N"表示该分子是这里描述的肽抗体。肽抗体名称中-N"表示Ang-2-结合肽(或结合肽复数)是Fc结构域的或〃-C"表示Ang-2-结合肽(或结合肽复数)是Fc结构域的C-末端。此外，2xCon4(C)lK，如SEQIDNO:25中定义的，也可以指其中没有〃IK"后缀°各个肽抗体的Fc部分的氨基酸序列如下(从氨基末端至羧基末端)DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF丽YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL或"-C";或"N"，"(N)'的后缀〃N〃，〃(N)〃，或N-末端，后缀〃C〃，〃(C)HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:60)下面给出表4中分别相应于肽抗体SEQIDNOs:12-32的肽抗体的编码DNA序列(SEQIDNos:33-53):SEQIDNO:33ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAATGGATCCSEQIDNO:34ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG67CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAASEQIDNO:35ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAASEQIDNO:36ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCCACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAASEQIDNO:37ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCCACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAASEQIDNO:38ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAAATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAASEQIDNO:40ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA70SEQIDNO:41ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAGCTGGAAGAGACTCTGTACGAACAGTTTACTTTTCAACAGCTCGAGTAASEQIDNO:42ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGTAASEQIDNO:43ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCCACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGTAASEQIDNO:44ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAASEQIDNO:45ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA72GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAASEQIDNO:46ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGCGCGACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAASEQIDNO:47ATGGGTGCACAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGgGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAASEQIDNO:48ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGCGGTGGTCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAASEQIDNO:49ATGGGTGCACAGTTCGACTACTGCGAAGGTGTTGAAGACCCGTTCACTTTCGGTTGCGACAACCACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA[扁]实施例6fl雄本條应用中和作用ELISA分析十四种肽抗体，应用亲和力ELISA分析三种肽抗体。表5给出结果。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>[1075]下面是阴性对照肽抗体4883的氨基酸序列(Fc部分是下划线，连接体是〃GGGGG〃，肽部分是粗体)LSPGK-GGGGG-CTAGYHWNSDCECCRRN(SEQIDNO:243)要明白这里使用术语〃没有抑制〃不是指化合物没有抑制能力。实际上，这里使用的〃没有抑制〃指当应用中和作用ELISA分析在这里描述的条件下测试时表现出大于lOOOnM的ICs。值的那些化合物，这是筛选的这些化合物的额最高浓度。当对于标记的分子没有发现显著抑制能力时当作表现出〃没有抑制作用〃，明白在不同的测试条件下，或者在不同的测试中，那些化合物事实上可以证实抑制能力。在优选的实施方案中，明白本发明涉及应用这里描述的分析具有抑制能力的肽抗体。应用亲和力BIAcore分析(如实施例2所述)分析两种肽抗体。下面的表6给出结果。组[誦]肽抗体(Pb)对于hAng-2和mAng-2的亲和力[1081]<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>实施例7全身施用Ang-2肽抗体的治疗功效研究肿瘤攻击之后72小时以每天一次的治疗方案对携带A431肿瘤的小鼠皮下施用Ang-2肽抗体，TN8-Con4-C。使用的肽抗体的剂量是1000，200，40和8微克/小鼠/天。对所有的动物公共给药20剂。每周三次记录肿瘤体积和体重。研究结束时，杀死动物，收集它们的血清并且通过ELISA测定肽抗体水平。从所有的组收集肿瘤和正常组织。[1085]图1给出结果。可以看出，Ang-2肽抗体治疗组和赋形剂对照组之间观察到肿瘤生长的显著差异。与赋形剂对照组相比，所有四剂Ang-2肽抗体抑制肿瘤生长(p〈0.0001对赋形剂对照组，利用反复测定ANOVA)。相反，对照组中肿瘤继续以快得多的速度生长。用这种融合体治疗对用上述剂量治疗的动物的最后体重，器官重量或血液学参数没有显著影响。[腿]实施例81.Ang-2第二肽文库的构建[誦]A.电感受态大肠杆菌细胞EpicurianColiXL1-BlueMRF'电穿孔感受态细胞(Stratagene#200158)从Stratagene(StratageneCloningSystems,LaJolla，Calif.)购得。[1090]B.pCESl载体的修饰应用ExtendLongTemplatePCRSystems(RocheDiagnosticsCorp.，Indianapolis,Ind.)，使用1微克的pCESl载体(TargetQuestlnc.)作为模板进行PCR。PCR混合物体积是100微升，它含有lxPCR缓冲液，200nM的两种引物的每一种5'-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3'(SEQIDNO:244)禾口[1092]5'-GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGAMGTTGTTTAGCA-3'(SEQIDNO:245)，200nMdNTP，和3单位(U)的TagDNA聚合酶。TRIO-Thermoblock(Biometra)PCR系统如下运行94°C5分钟；94。C30秒，50°C30秒，72°C45秒30次循环;禾口72°C10分钟；冷却至4°C。[1093]然后将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，并且用QIAGEN旋转柱(QIAGENInc.，Valencia,Calif.)根据厂商提供的方案纯化。在如上所述相同的PCR条件下，使用5微升的PCR产物和200nM的两种弓|物的每一种5'-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3'(SEQIDNO:246)和5'-AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACT—3'(SEQIDNO:247)进行第二PCR反应。然后在37。C下在含有lxNEB2缓冲液，60U的ApaLI(NewEnglandBiolabs，Beverly,Mass.)，60U的BamHI(NewEnglandBiolabs)的100微升反应液中分别消化PCR产物和原始pCES1载体1小时。然后利用QIAGENSpinColumn纯化消化过的DNA，并且在室温下在含有lx连接缓冲液和40U的T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs)的40微升反应中连接过夜。将载体转染到大肠杆菌中并且在37t:下温育过夜。选择分离的单一菌落并且用QIAGENSpinColumn将质粒纯化。通过DNA测序证实正确的插入片段。[腦]C.载体DNA的制备使用GenePulserII(BIO-RAD，Hercules,Calif.)，设置2500V,25iiF，和200ohms，将1微克修饰的pCESl载体DNA(从上述IB获得)转化到40微升电感受态XLl-blue大肠杆菌(从上述1A获得)中。然后将转化的细菌样品立刻转移到含有960微升S0C(2X胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，10mMNaCl，2.5mMKC1，20mM葡萄糖，10mMMgS04，10mMMgCl2)的试管中，并且摇动下在37。C下让培养物生长1小时。然后将细胞分布在2xYTAGT(2xYT，含有100微克/毫升氨苄青霉素，12.5微克/毫升四环素和2%葡萄糖)琼脂板上并且在37t:下温育过夜。测序证实单一菌落，并且用来在37t:下摇动下接种2升2xYTAGT培养基过夜。用QIAGENPlasmidMaxi试剂盒根据生产商提供的说明纯化质粒载体DNA。[翻]D.载体DNA的消化在37。C下在含有lxNEB缓冲液，2，300U的ApaLI，和300U的Xhol的5000微升反应中将总共大约2000微克的载体DNA(从上面1C获得)消化过夜。限制性消化反应在37°C下温育过夜并且在预先制备的0.8%琼脂糖凝胶(EmbiTec，SanDiego，Calif.)上分析。然后从凝胶上切除线性载体DNA，并且用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGENInc.)根据厂商说明提取。E.文库寡核苷酸的制备在从上述结果产生的序列的基础上设计六个文库寡核苷酸(l个固定，5个掺入)。一个固定的文库寡核苷酸是KNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3'(文库号20)(SEQIDNO:248);[1104]两个70%掺入的文库寡核苷酸是5'-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKaaKcgKccKNNKgaKgaKatKttKggKggKNNKacKtaKcaKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3'(文库号27);(SEQIDNO:249);[1106]5'-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKgaKacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3'(文库号99);(SEQIDNO:250);[1107]小写字母表示指定碱基的70%和另三个核苷酸各自的10%的混合物。另三个91%掺入的文库寡核苷酸如下5'-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKcaKgaKgaKTGCgaKtgKgaKccKtgKacKTGCgaKcaKatKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3'(文库号94);(SEQIDNO:251);5'-CACAGTGCACAGGGTNNKttKgaKta顯KgaKggKgtKgaKgaKccKttKacKttKgg顯KgaKaaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3'(文库号25);(SEQIDNO:252);禾口5'-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKgaKacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3'(文库号26);(SEQIDNO:253);对于上述寡聚物，本领域技术人员明白〃N〃表示在寡核苷酸合成中同等代表四种核苷酸中的每一个(A，T，C，和G)，〃K〃表示在寡核苷酸合成中同等代表核苷酸G和T。小写字母代表指定碱基的91%和另三个核苷酸各自的3%的混合物。这些寡核苷酸各自被用作PCR中的模板。对于PCR反应使用ExpandHighFidelityPCRSystem试剂盒(RocheDiagnosticsCorp.)。在96个孔中在含有lnM的文库寡核苷酸，IxPCR缓冲液，300nM的各种引物5'-CACAGTGCACAGGGT-3'(SEQIDNO:254);和5'-TGATCTCGAGAGAATG—3'，(SEQIDNO:255)，200iiMdNTP，1.5mMMgCl2，禾口350U的Expand聚合酶的50微升PCR反应中扩增各种文库寡聚物。使用热循环控制装置(GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBiosystems)进行下面的程序94°C，5分钟；(94°C30秒，52.5°C60秒，72°C30秒)x25次循环；72°C10分钟；冷却至4"。使用QIAquickPCR纯化试剂盒(QIAGENInc.Cat#28104)，根据厂商说明，去除三个核苷酸。F.文库寡核苷酸的消化对于每个文库，在37。C下在含有lxNEB缓冲液，2，750U的ApaLI，和750U的Xhol的1200微升反应中将PCR产物(1E章节)消化过夜。在预先制备的3%琼脂糖凝胶上(EmbiTec)分离消化的DNA。从凝胶上切下各个反应中令人感兴趣的DNA泳带并且用COSTARSpin-X离心管过滤器，O.22微米乙酸纤维素(CorningInc.，Cat#8160)提取。[1116]G.载体与文库寡核苷酸的连接450微升连接反应含有1:5摩尔比的线性载体(1D章节)和各种消化的文库PCR产物(IF章节)，lxNEB连接缓冲液，和20，000U的T4DNA连接酶，在16。C下反应过夜。经连接的产物在65。C下温育20分钟，以灭活T4DNA连接酶，并且进一步与100U的Notl在37t:下温育2小时，将载体自身连接最小化。然后通过标准苯酚/氯仿萃取法(MolecularCloning:ALaboratoryManual,Maniatis等，第三版，冷泉干实验出版社，2000)纯化经连接的产物全部重新悬浮于120微升的H20。[川8]H.电穿孔转化对于每个文库，进行12个电穿孔反应。对于每一次转化，在0.2-cm小杯(BI0-RAD)中混合10微升的连接载体DNA(1G章节)和300微升的XL1-BLUEMRF'细胞(1A章节)。得到的混合物用设置在2500V，25iiF，和200ohms的GenePulserII脉冲处理。然后将来自12个电穿孔反应的转化细胞合并并且转移到含有26毫升S0C的烧瓶中，在37t:下温育1小时。将细胞加给450ml2xYTAG，并且搅拌下在37。C下摇动培养5小时。在4t:下以4000rpm将细胞离心15分钟。然后将细胞颗粒状物重新悬浮于12毫升的15%甘油/2xYT并且在-S(TC下贮存。这是文库的第一原液。滴度表示5.0x10(文库数目20)，3.3x10(文库数目94)，4.7x10(文库数目25)，5.0x10(文库数目26)，3.0x10(文库数目27)，和4.2x10(文库数目99)独立的转化体的文库大小。["20]2.文库的扩增["21]A.燃t制條二,从第一文库细胞原液(从上文1H章节获得)，使用覆盖IOX过量各个文库大小的足量的细胞接种2xYTAGT(2YT，含有100微克/毫升氨苄青霉素，12.5微克/毫升四环素和2%葡萄糖)培养基使得起始OD,是O.1。让培养物在37t:下摇动下生长几小时直到0De。。=0.5。从各个文库取出十分之一等分并且在分开的烧瓶中在37t:下又培养2小时。然后使用BeckmanJA-14转床在4。C下将这些传代培养物以4000rpm离心，并且将细菌颗粒状物重新悬浮于7.Oml(对于各个文库)分15%甘油/2xYT，在-8(TC下贮存。[1123]B.噬菌体诱导向保留的0D600=0.5(从上文2A章节得到)的细菌培养物加入M13K07辅助噬菌体等份(AmershamPharmaciaBiotech)达到3xl0pfu/毫升最终浓度。让辅助噬菌体在37t:下在不摇动下感染细菌30分钟，在慢速摇动下感染细菌30分钟。在4t:下将感染的细胞以5000rpm离心15分钟。将细胞颗粒状物重新悬浮于相同体积的(见上文2A章节)2xYTAK培养基(2YT，含有100微克/毫升氨苄青霉素和40微克/毫升卡那霉素)。让噬菌粒产生在摇动下在3(TC下反应过夜。[1125]C.噬菌体收集在4"下将上文2B章节获得的细菌培养物以5000rpm离心15分钟。然后将上清液转移到新瓶中，加入0.2体积的20%PEG/2.5MNaCl并且在冰上温育1小时沉淀噬菌粒。在4t:下将沉淀出的噬菌粒以10，OOOrpm离心30分钟并且小心地悬浮于100ml的冷PBS中。通过在4t:下以4000rpm离心10分钟去除残留的细胞进一步纯化噬菌粒溶液，并且通过加入0.2体积的20%PEG/2.5MNaCl沉淀出噬菌粒。4"下以10，OOOrpm将噬菌粒离心30分钟，并且将噬菌粒颗粒状物重新悬浮于18ml的冷PBS。向噬菌粒溶液加入6毫升60^甘油溶液，在-8(TC下贮存。通过标准方法测定噬菌粒滴度(MolecularCloning,Maniatis等，第三版)。[1127]3.Ang-2结合噬菌体的筛选["28]A.Ang-2在磁珠上的固定化以对于生产商提供的100微升珠原料2000ngAng-2蛋白质的浓度在DynabeadM-280Str印tavidin(DYNAL，LakeSuccess,N.Y.)上固定生物素化Ang-2(来自上文3A章节)。使用磁子将小珠拉到试管的一边并且吸移出液体之后，用磷酸缓冲盐水(PBS)将小珠洗涤两次。以上述浓度向洗过的小珠加入生物素化Ang-2蛋白质，并且在室温下旋转温育1小时。然后通过加入BSA至2%终浓度并且fC下旋转温育过夜将Ang-2包被小珠封闭。然后用PBST(含有0.05%Tween-20的PBS)将得到的Ang-2包被小珠清洗两次，然后进行筛选程序。[酬B.使用Ang-2包被珠的筛选[1131]用1毫升含有2%BSA的PBS将大约1000-倍文库等价噬菌粒(来自上面的2C章节)封闭l小时。通过将其加给空白珠(和3A章节所述相同的珠，但是没有Ang-2蛋白质包被)让被封闭的噬菌粒样品进行三个阴性筛选步骤，并且转动下将这种混合物在室温下温育15分钟。使用磁体将含有噬菌粒的上清液排出并且转移到含有空白珠(和3A章节所述相同的珠，但是其上没有Ang-2蛋白质包被)的第二试管，将这种混合物在室温下旋转下温育15分钟。重复该程序。使用磁体将含有噬菌粒的上清液排出并且转移到含有Ang-2蛋白质包被珠(来自3A章节)的新试管中，将这种混合物在室温下旋转下温育1小时。弃除上清液之后，噬菌粒_结合_珠用2%奶-PBS洗涤10次；用2%BSA-PBS洗涤10次；用PBST洗涤10次和用PBS洗涤两次。然后在旋转装置上让噬菌粒在1毫升的100mM三乙胺溶液(Sigma，St.Louis，Mo.)中洗脱10分钟。通过加入0.5ml的lMTris-HCl(pH7.5)将含有噬菌粒的溶液的pH中和。使用得到的噬菌粒在37t:下不摇动感染10ml新鲜培养的XL1-BlueMRF'细菌(0D6。。大约0.5)30分钟并且慢速摇动下感染30分钟。然后将所有的感染的XL1-BLUEMRF'细胞在15x5cm2xYTAG板上平板培养，在30。C下培养过夜。["33]C.噬菌体的诱导和收获将10ml等份的2xYTAGT培养基加给培养板(来自3B章节)以悬浮XL1-BLUEMRF'细胞。所有的XL1-BLUEMRF'细胞收集在试管中，并且将250微升等份的这些细胞加给25ml的2xYTAGT并且在37。C下生长至0D6。。=0.5。M13K07辅助噬菌体加至3xl0cfu/ml的终浓度并且在37t:下不摇动温育30分钟并且慢速摇动下温育30分钟。在4"C下将细胞5000rpm离心10分钟并且用25ml的2xYTAK再次悬浮。让这些细胞在3(TC下摇动下生长过夜。收获诱导的噬菌粒并且和2C章节一样加以纯化。[1135]D.第二轮筛选除了下面的操作外，根据上文3B至3C章节描述的要点进行第二轮筛选。从3C章节得到的大约100-倍文库等价噬菌粒用作输入噬菌粒。包被到DynabeadM-280Str印tavidin上的生物素化Ang-2蛋白质(3A章节)的量降至20ng。然后噬菌体-结合-珠用2%奶-PBS洗涤10次；用2%BSA-PBS洗涤10次；用PBST洗涤10次，其中最后洗涤包括在PBST中在室温下温育60分钟。小珠用PBS洗涤两次。洗脱条件和第一轮相同(3B章节)。E.第三轮筛选除了下面的操作外，根据上文3B至3C章节描述的要点进行第三轮筛选。从3D章节得到的大约10-倍文库等价噬菌粒用作输入噬菌粒。使用大约2ng的生物素化Ang-2蛋白质(3A章节)包被DynabeadM-280Str印tavidin。噬菌体-结合-珠用2%奶-PBS洗涤10次；用2%BSA-PBS洗涤10次；用PBST洗涤10次，其中最后洗涤包括在PBST中在室温下温育60分钟。小珠用PBS洗涤两次。洗脱条件和第一轮相同(3B章节)。[1139]F.第四轮筛选除了下面的操作外，根据上文3B至3C章节描述的要点进行第四轮筛选。从3E章节得到的文库等价噬菌粒用作输入噬菌粒。对于文库25，26，和27，包被到DynabeadM-280Str印tavidin上的生物素化Ang-2蛋白质(3A章节)的量降至0.4ng。对于文库20和94，包被量和第三轮一样保持在2ng。文库99没有进行第四轮筛选步骤。洗脱条件和第一轮相同(3B章节)。["41]4.克降分析[1142]A.丰板的制备从第二轮筛选取单一菌落并且接种每孔含有120微升的2xYTAGT的96孔板。96孔板在摇动下在3(TC下温育过夜。每孔加入40微升的60%甘油，在-S(TC下贮存。[1144]B.噬菌粒ELISA用来自主板的大约2微升等份的细胞(来自上文4A章节)接种新鲜Costar⑧96孑L禾反(Corningincorporated,Corning,N.Y.，cat.#9794)，它每孑L含有100微升的2xYTAGT，这个新的细胞培养板在37t:下培养直到大约0D6。。=0.5。向每个孔加入40微升的含有M13K07辅助噬菌体(1.5xl013cfu/ml)的2xYTAGT，96孔板在37t:下不摇动温育30分钟并且在摇动下又温育30分钟。培养板在4t:下以2000rpm(BeckmanCS-6R桌面离心机)离心10分钟。从孔中去除上清液，并且将每种细胞颗粒状沉淀重新悬浮于150微升的2xYTAK/孔。培养板在3(TC下温育过夜用于噬菌粒的表达。[1147]在4。C下以lxPBS中l微克/毫升用人Ang-2蛋白质包被96孔Maxisorp板(NUNC)过夜。作为对照，2%BSA(Sigma)包被分开的Maxisorp板。第二天，在4。C下以2000rpm将过夜细胞培养物离心10分钟。将来自各个孔的10微升上清液转移给含有BSA/PBS溶液以1:10稀释上清液的新的96孔板。得到的混合物在室温下摇动下温育l来封闭噬菌粒。同时，每孔用400微升的2%BSA/PBS溶液将Ang-2蛋白质包被的培养板在室温下封闭1小时。弃除BSA溶液，各个孔用PBS溶液清洗三次。最后洗涤步骤之后，向Ang-2蛋白质包被的培养板和对照板的每个孔加入IOO微升的封闭的噬菌粒溶液，并且在室温下摇动下温育1小时。弃除液体，用PBST溶液将各个孔清洗三次。向Ang-2蛋白质包被的培养板和对照板的每个孔加入100微升的15，000稀释的HRP-偶合抗-M13mAb(AmershamPharmaciaBiotech)，这些板在室温下摇动下温育1小时。再次弃除液体，各个孔用PBST溶液清洗三次。向孔中加入100微升的LumiGL0化学发光底物(Kirkegaard&PerryLaboratories，Gaithersburg，Md.)，并且用L咖inoskanAscentDLRearlymachine(Labsystems，Franklin，MA)对各个孑L读数。[1148]C.噬菌体克隆的测序使用来自主板(4A章节)的1微升细菌作为模板进行PCR反应。各个PCR混合物的体积是50微升，其含有lxPCR缓冲液，300nM的两种引物的每一种[1150]5'-GTTAGCTCACTCATTAGGCAC-3'(SEQIDNO:256)禾口[1151]5'-GTACCGTAACACTGAGTTTCG-3'，(SEQIDNO:257);200iiMdNTP，2mMMgCl2，禾P2.5UtaqDNA聚合酶(RocheMolecularBiochemicals)。使用TheGeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)进行下面的程序。C:94。C5分钟;(94°C45秒，55°C45秒，72°C90秒)40个循环；72。C10分钟；冷却到4°C。使用QIAquick96PCR纯化试剂盒(QIAGENInc.)根据厂商说明纯化PCR产物。使用ABI3770测序仪(PerkinElmer)根据厂商说明，用引物5'-TTACACTTTATGCTTCCG-3'(SEQIDNO:258)对所有的纯化的PCR产物测序。["53]5.序列排列从核苷酸序列(从上文4C章节获得)翻译的肽序列与ELISA数据有相关性。认为显示在Ang-2包被孔中读取高OD并且在BSA包被孔中读取低0D值的更重要。出现多次83的序列也认为是重要的。从文库20选择24个肽序列，从文库94选择26个肽序列，从文库25选择7个肽序列，从文库25选择18个肽序列，从文库27选择6个肽序列，从文库99选择4个肽序列用于进一步分析和肽抗体制备。另外，从文库20和94推断11个共有序列，从文库26和99推断3个共有序列，从文库25推断2个共有序列，并且用来制备肽抗体。使用这里实施例10描述的中和作用ELISA方法评价表7中的肽抗体。结果在表7中给出。[1155]表7Con4衍生的亲和性-成熟PbshAng-2:Tie2IC5。(nM)肽抗体序列(SeqIdNo:)Con4-44(C)0.09M-Fc-GGGGGAQ-PIRQEECDWDPWTCE丽EV-LE(SEQIDNO259)Con4-40(C)0.10M-Fc-GGGGGAQ-TNIQEECEWDPWTCDHMPGK-LE(SEQIDNO260)Con4-4(C)0.12M-Fc-GGGGGAQ-WYEQDACEWDPWTCEHMAEV-LE(SEQIDNO261)Con4-31(C)0.16M-Fc-GGGGGAQ-NRLQEVCEWDPWTCEHMENV-LE(SEQIDNO262)Con4-C5(C)0.16M-Fc-GGGGGAQ-AATQEECEWDPWTCEHMPRS-LE(SEQIDNO263)Con4-42(C)0.17M-Fc-GGGGGAQ-LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW-LE[1157](SEQIDNO:264)Con4-35(C)0.18M-Fc-GGGGGAQ-VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG-LE(SEQIDNO265)Con4-43(C)0.18M-Fc-GGGGGAQ-SISHEECEWDPWTCEHMQVG-LE(SEQIDNO266)Con4-49(C)0.19M-Fc-GGGGGAQ-WMQEECEWDPWTCEHMGRM-LE(SEQIDNO267)Con4-27(C)0.22M-Fc-GGGGGAQ-TWPQDKCEWDPWTCEHMGST-LE(SEQIDNO268)Con4-48(C)0.26M-Fc-GGGGGAQ-GHSQEECGWDPWTCEHMGTS-LE(SEQIDNO269)Con4-46(C)0.26M-Fc-GGGGGAQ-QHWQEECEWDPWTCDHMPSK-LE(SEQIDNO270)Con4-41(C)0.26M-Fc-GGGGGAQ-NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR-LE(SEQIDNO271)Con4-36(C)0.28M-Fc-GGGGGAQ-KSGQVECNWDPWTCEHMPRN-LE(SEQIDNO272)Con4-34(C)0.28M-Fc-GGGGGAQ-VKTQEHCDWDPWTCEHMREW-LE(SEQIDNO:273)Con4-28(C)0.30M-Fc-GGGGGAQ-AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM-LE(SEQIDNO274)Con4-39(C)0.30M-Fc-GGGGGAQ-PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM-LE(SEQIDNO275)Con4-25(C)0.31M-Fc-GGGGGAQ-RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK-LE(SEQIDNO276)Con4-50(C)0.38M-Fc-GGGGGAQ-HGQNMECEWDPWTCEHMFRY-LE(SEQIDNO277)Con4-38(C)0.40M-Fc-GGGGGAQ-PRLQEECWDPWTCEHMPLR-LE(SEQIDNO278)Con4-29(C)0.41M-Fc-GGGGGAQ-RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ-LE(SEQIDNO279)Con4-47(C)0.44M-Fc-GGGGGAQ-QTSQEDCWDPWTCDHMVSS-LE(SEQIDNO280)Con4-20(C)0.48M-Fc-GGGGGAQ-QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL-LE(SEQIDNO281)Con4-45(C)0.48M-Fc-GGGGGAQ-WAQQEECAWDPWTCDHMVGL-LE(SEQIDNO282)Con4-37(C)0.49M-Fc-GGGGGAQ-LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS-LE(SEQIDNO283)Con4-33(C)0.52M-Fc-GGGGGAQ-PMNQVECDWDPWTCEHMPRS-LE(SEQIDNO284)AC2-Con4(C)0.52M-Fc-GGGGGAQ-FGWSHGCEWDPWTCEHMGST-LE(SEQIDNO285)Con4-32(C)0.75M-Fc-GGGGGAQ-KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP-LE(SEQIDNO286)Con4-17(C)0.96M-Fc-GGGGGAQ-GPRISTCQWDPWTCEHMDQL-LE(SEQIDNO287)Con4-8(C)1.20M-Fc-GGGGGAQ-STIGDMCEWDPWTCAHMQVD-LE(SEQIDNO288)AC4-Con4(C)1.54M-Fc-GGGGGAQ-VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW-LE(SEQIDNO289)Con4-1(C)2.47M-Fc-GGGGGAQ-VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG-LE(SEQIDNO290)Con4-CI(C)2.75M-Fc-GGGGGAQ-TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG-LE[1159]84<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>[1164]12-9衍生的亲和性-成熟PbshAng-2:Tie2IC5。(nM)肽抗体序列(SeqIdNo:)12-9-3(C)0.81M-Fc-GGGGGAQ-LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR-LE(SEQIDNO349)12-9-7(C)0.93M-Fc-GGGGGAQ-MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM-LE(SEQIDNO350)12-9-6(C)0.95M-Fc-GGGGGAQ-HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG-LE(SEQIDNO351)12-9-C2(C)1.41M-Fc-GGGGGAQ-LQDYCEGVEDPFTFGCENQR-LE(SEQIDNO352)12-9-5(C)1.56M-Fc-GGGGGAQ-LLDYCEGVQDPFTFGCENLD-LE(SEQIDNO:353)12-9-1(C)1.84M-Fc-GGGGGAQ-GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT-LE(SEQIDNO354)12-9-4(C)2.05M-Fc-GGGGGAQ-AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK-LE(SEQIDNO355)12-9-CI(C)2.68M-Fc-GGGGGAQ-LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR-LE(SEQIDNO356)12-9-2(C)8.42M-Fc-GGGGGAQ-KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS-LE(SEQIDNO357)Parent:12-9(C)15.00M-Fc-GGGGGAQ-FDYCEGVEDPFTFGCDNH-LE(SEQIDNO:358)[1165]实施例9在BIAcore上对六个抗-Ang肽抗体测定它们对huAng(R&DSystems,BN012103A)的结合活性。根据标准胺_偶联方法(BIAcorelnc.)将蛋白质G固定到CM5芯片上，然后在蛋白质G表面上注射肽抗体用于捕获(RL大约100Ru)。为了分析hAng2和捕获的肽抗体之间的结合，在捕获的肽抗体表面上注射0.3nM-40nM的huAng2，并且使用BIAevaluation3.0(BIAcoreInc.)分析结合sensorgrams。表8总结了该项实验的结果。[1167]表8[1168]<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>[酬实施例10[1170]中和作用ELISA如下用DMEM/50微克/毫升BSA稀释人，鼠，cyno，和大鼠Ang-2和在培养基中条件培养的人和鼠Ang-l:hAng-2-l:64稀释；mAng-2-l:64稀释；大鼠Ang-2-没有稀释；cynoAng-2-1:32稀释；hAng-l-l:4稀释；和mAng-1-1:4稀释。[1172]通过50%最大可实现结合(g卩，平台)下它们结合lnMhTie2_Fc(以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分只含有分子的可溶性胞外部分；R&DSystems,目录号313-TI)的能力测定稀释这些条件培养基的程度。用稀释的条件培养基100微升包被微量滴定板。对于Ang-2中和作用ELISAs，在含有大约1%BSA和大约lnMTie_2(以Tie_2-Fc分子提供，其中Tie-2部分只含有分子的可溶性胞外部分；R&DSystems,目录号313-TI)的PBS溶液中4-倍稀释中从62.5nM至0.015pM滴定候选抗-Ang-2肽抗体。对于Ang-l中和作用ELISAs，在含有大约1%BSA和大约InMTie-2(以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie_2部分只含有分子的可溶性胞外部分；R&DSystems,目录号313-TI)的PBS溶液中4_倍稀释中从lOOOnM至0.2pM滴定候选抗-Ang-2肽抗体。向各个孔加入大约100微升肽抗体/Tie-2溶液之后，培养板在室温下温育过夜，然后用含有大约0.1%Tween-20的PBS洗涤五次。洗涤之后，对每孔加入大约100微升的抗-Tie-2抗体(PharmingenInc.，catalog#557039)达到每毫升大约1微克的终浓度，培养板在室温下温育大约1小时。接着，以在含有大约1%BSA的PBS中1:10，000的稀释度每孔加入大约100微升山羊抗-小鼠-IgG-HRP(PierceChemicalCo.，catalog#31432)。[1174]培养板在室温下温育大约1小时，用含有大约0.1%Tween-20的PBS冲洗五次。然后每孔加入大约IOO微升的TMB底物(SIGMA，catalogftT8665)使显示蓝色。然后在分光光度计上在370nm读取吸光度。[1175]魁血管生成素Tie2相互作用的肽抗体介导的中和作用[1177]<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>实施例11[1179]PK研究[濯]研究设i十将雄性CD-I小鼠，体重20-30g，随机分为各个肽抗体处理组(2xCon4-C，L1_7_N，和Ll-21-N)。动物接受单一IV大丸剂(n=38/组)或者一次SC施用50微克肽抗体(n=34/组)。分别尾静脉肩皮肤IV和SC给药进行注射。[1182]血液取样和分析方法对于SC和IV组，给药之前和给药之后第1，2，4，8，16，24，48，72，96，120，144，168，216，264，312，和336小时对于每一次抗_Ang肽抗体浓度测定取血样。对于IV组给药之后5和30分钟采集另外的样品。每个时间点对两个动物取血，并且在取样之后杀死动物。用心脏穿剌术将血液(大约O.50mL)采取到聚丙烯microtainer⑧血清分离管中。样品在冰上保持大约20分钟直到发生凝结。通过在2-『C下离心大约10分钟从血样分离血清，并且在测试之前在大约-7(TC下保存。利用校验的时间分辨荧光测定法(TRF)使用100ng/mL较低限度的量化测定样品。用重组小鼠Ang-2蛋白质包被NUNCfluoroMaxisorp微量滴定板。然后用蛋白质封闭培养板以减少非特异性结合。在10%小鼠血清测定缓冲液中制备标准物，性质对照物和未知样品并且吸移到微量滴定板的孔中。肽抗体与固定的Ang-2特异性结合。将所有的没有结合的物质(Kirkegaard&PerryLaboratoriesInc.)洗涤之后，对孑L力口入生物素化山羊抗一人IgG(H+L)单克隆抗体(JacksonlmmunoResearchLaboratoriesInc.)。去除所有的没有结合的生物素化单克隆抗体的洗涤步骤之后，对孔加入铕标记的链霉抗生物素蛋白。将没有结合的链霉抗生物素蛋白铕洗掉之后，结合的铕从链霉抗生物素蛋白释放，酸性溶液吸移到各个孔中。产生荧光信号并且在Wallac's荧光读数仪上读数。小鼠血清抗-Ang-2肽抗体的分析的测试范围是0.078-5微克/毫升。[1184]药物动力学分析禾U用WinNonlinProfessional(Version3.3，PharsightCorp.，MountainView,Calif.)对每一组的成分平均浓度-时间数据进行非房室分析。对于PK分析使用标称取样时间，在标称时间的10%内收集样品。在PK分析之前将小于LLOQ的所有的浓度值设置为0。估计下面的PK参数根据<formula>formulaseeoriginaldocumentpage88</formula>计算极限半寿期(t1/2)，其中kel是通过极限对数_线性衰退期的线性回归估算的一级极限速度常数。血清浓度-时间曲线下的面积(AUC(。—iJS))用时间是0-最后的线性/对数梯形方法估算，所述时间是最后可以计量的浓度(Clast)。根据相应的AUC(。—最后)和预计的Clast/kel值之和估算0至无穷大时间(AUC(。—曲线下的面积[1189]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage88</formula>如下计算SC给药之后的绝对生物可利用率(F):「，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage88</formula>[1192]图2中给出结果。实施例12在研究的第0天用lxl07A431细胞对雌性裸鼠皮下注射。第三天，以200微克/小鼠/天的剂量皮下施用Ang-2肽抗体2xCon4-C。如图中所示以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。在旋转摇动器中观察Ang-2肽抗体-处理组对赋形剂对照和对照肽抗体之间的显著差异2小时。(p<0.0001对每个对照组，使用重复测定AN0VA，用Scheffe'sposthoc检验)。用这种肽抗体处理对体重没有显著影响。图3给出结果。实施例13A431体外牛长曲线以每孔2000个细胞对96孔组织培养板接种A431细胞，用补充有10%胎牛血清(FBS)的200微升DMEM。接种之后16小时吸出培养基。然后加回到孔中并且重复三份每孔100微升DMEM，10%FBS，1毫克/毫升阴性对照肽抗体4883或肽抗体TN8-Con4。在5个板上重复设置。处理之后24，48，72，96，和120小时从一个培养板吸出培养基。然后对每孔加入100微升的10%三氯乙酸(TCA)，然后在4t:存贮培养板。当最后的培养板在10%TCA中最少放置4小时之后收集所有的板。去除10XTCA，孔用自来水洗涤5次。然后在室温下用100微升0.4%sulforhodamineB(SigmaS-9012)的1%乙酸溶液(SigmaA-6283)将细胞染色10分钟，然后用1%乙酸溶液洗涤5次。然后空气风干培养板。在旋转摇动器上用300微升20mM没有缓冲的Tris(pH>10)溶解染料。然后在微量滴定板读数仪上在540nm读取光密度(OD)。图4给出结果。[謂]实施例14在研究的第O天用2xl06Colo-205细胞加Matrige1(2:1)对雌性裸鼠皮下注射。第三天，以14微克/小鼠的剂量皮下施用Ang-2肽抗体Ll-7-N，Ll-21-N，Con4-C，和2xCon4-C，一周两次。一周三次施用抗-Ang-2抗体Ab536，47微克/小鼠，作为阳性对照。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。观察每一个Ang-2肽抗体-处理组对赋形剂对照和对照肽抗体之间的显著差异(p<0.0001对每个对照组，使用重复测定ANOVA，用Scheffe'sposthoc检验)。用这些肽抗体处理对体重没有显著影响(没有给出结果)。图5给出结果。[1201]实施例15在研究的第0天用2xl06Colo-205细胞加Matrige1(2:1)对雌性裸鼠皮下注射。第三天，以14，2.8，和0.56微克/小鼠的剂量皮下施用Ang-2肽抗体2xCon4-C，一周两次。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。观察两个较高剂量的Ang-2肽抗体-处理组对赋形剂对照和对照肽抗体之间的显著差异(中间给药之后p=0.003，对于高剂量，p<0.0001，使用重复测定AN0VA，用Scheffe'sposthoc检验)。用这些肽抗体处理对体重没有显著影响。划线代表小组总n的减少，从10减小至9只小鼠，由于一只小鼠不明原因死亡。图6给出结果。[1203]实施例16抗-Ang-2肽抗体对Colo-205异种移植肿瘤在研究的第0天用2xl06Colo-205细胞加Matrige1(2:1)对雌性裸鼠皮下注射。第三天，以350微克/天的剂量皮下施用Ang-2肽抗体2xCon4-C或对照肽抗体。在第14天(大小匹配对照)或第18天(时间匹配对照)收集用对照肽抗体(如表5所述)治疗的组的肿瘤。然后在第18天收集来自2xCon4(C)治疗组的肿瘤。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积，如所给出的。观察时间匹配对照组和2xCon4-C处理组之间肿瘤生长的显著差异(p=0.0154，使用重复测定AN0VA，用Scheffe'sposthoc检验)。用这些肽抗体处理对体重没有显著影响。将为了成像分析而制备的肿瘤冠状对切，并且把一半迅速在0CT(SakuraFinetekUSAInc.，Torrance,Calif.)中冷冻。使用DAB作为发色体，2微克/毫升，用抗-小鼠CD31(目录#553370，BDPharMingen，SanDiego，Calif.)将冷冻切片免疫组织化学染色。以20倍实物放大率对肿瘤切片数字成像。对于每个肿瘤捕获四个〃覆盖-点〃区，每个处理组用10个月中瘤。禾U用MetaMorph(UniversalImagingCorporation，Downington，Pa.)图像分析系统限定图像中CD31染色血管的阈。CD31阳性染色面积表示为各个区内总的肿瘤组织比例。图7给出结果。[1207]实施例17在研究的第0天用2xl06Colo-205细胞Matrige1(2:1)对雌性裸鼠皮下注射。从研究的第3，10或15天开始，一周两次用350微克/小鼠的Ang-2肽抗体2xCon4-C，或等价对照肽抗体皮下给药。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。对A431和Colo-205异种移植模型观察所有Ang-2肽抗体-处理组对赋形剂对照之间的肿瘤生长显著差异(对于第15天组，p=0.089并且p=给药10周)。这里使用的CR指处理之后没有可测得的肿瘤的结果。图9给出结果。[1209]实施例19a)Colo-205肿瘤樽型中Pb与脱,乙酰紫杉醇的联合在研究的第0天用2xl06Colo-205细胞加Matrige1(2:1)对雌性裸鼠皮下注射。研究的第14天，用a)350微克/小鼠，每周两次皮下，Ang-2肽抗体2xCon4-C，b)20mg/kgqwx3i.p.—脱乙酰紫杉醇，或c)两者的联合，开始治疗。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。观察所有处理组对赋形剂对照之间肿瘤生长的显著差异(p<0.0001，使用重复测定ANOVA，用Scheffe'sposthoc检验)。另外，和单一治疗药物任一种相比，联合治疗组显著不同(P<0.0001对2xCon-4-C和p=0.0122对脱乙酰紫杉醇)。划线代表小组总n的减少，从10减小至9只小鼠，由于一只小鼠不明原因死亡。用这些肽抗体治疗对体重没有显著影响。图10a给出结果。[1212]b)Colo-205肿瘤模型中Pb与5-FU的联合在研究的第0天用2xl06Colo-205细胞Matrige1(2:1)对雌性裸鼠皮下注射。研究的第14天，用a)350微克/小鼠，每周两次皮下，Ang-2肽抗体2xCon4-C，b)50mg/kgqwx5i.p.5-FU，或c)两者的联合，开始治疗。以有规律的时间间隔记录肿瘤体积和体重。[1214]观察所有处理组对赋形剂对照之间肿瘤生长的显著差异(p<0.0001，使用重复测定AN0VA，用Scheffe'sposthoc检验)。另外，和单一治疗药物任一种相比，联合治疗组显著不同(P=0.0375对2xCon+C和p=0.0453对5-FU)。5-FU治疗组(18%，在研究的第20天)以及联合治疗组(16%，在研究的第20天)发现体重暂时减轻，随后完全恢复体重。图10b给出结果。[1215]实施例20[1216]辅助关节炎樽型在环境控制房间(温度23±2°〇，相对湿度50±20%)，12-小时光照/黑暗周期，在每只滤网盖子笼子中关养雄性Lewis大鼠(120-130g，CharlesRiver，WilmingtonMass.)。对动物喂以商售啮齿动物饲料(Formulation8640;TekLab，Madison,Wis.)并且自由饮用过滤器纯化的自来水。食物该和磷含量分别是1.2%和1.0%。[1218]通过在尾根真皮内一次注射悬浮于O.05mL石蜡油(CrescentChemicalCo.，Ha聊auge，N.Y.)中的0.5mg热杀死结核分枝杆菌H37Ra(DifcoLaboratories,Detroit,Mich.)诱导辅助关节炎。关节炎的临床发生在第9天，指征是后爪肿胀行走困难。除了在2xCon4(c)治疗组外(其在免疫之后第一天治疗)，免疫之后第9天开始每天皮下注射(关节炎发生之前)并且持续18天。[1219]辅助关节炎的临床监测l根据Feige等，CellularMolec.LifeSci.，57:1457-1470(2000)描述的方法用水体积描记法通过测定后爪体积的间歇式测量，临床评价炎症进程。应用根据下式的梯形规则以曲线(AUC)下的面积为基础计算爪炎症的抑制作用[l-K治疗的AdA)-正常)/(未治疗的AdA-正常l))]薩另外，在9天的治疗方案中每天测定总体重作为补充终点，因为体重减轻表明该90关节炎模型关节炎症的进行平行。第18天用(A杀死动物。对尸体检查骨矿物质密度(BMD)的减少(免疫后第18天)。在毛皮线处去除后爪(仅接近踝关节(后踝))，浸在70X乙醇中，然后使用通风机X-射线柱光密度计(ModelQDR-4500A;Hologic，Waltham，Mass.)在水平方向上扫描。参见Feige等，上文。扫描之后，将跟骨处居中的矩形盒(29x25mm)位于描绘出的位置用于分析，用专业算法Otologic软件)计算骨面积，骨矿物质含量，和骨矿物质密度。所有的结果表示为平均值±标准误差。使用p值是0.05描述各组之间的统计学差异。对临床数据进行Kruskal-WallisANOVA和Mann-WhitneyU.检验，使用商售统计学软件(Statsoftv3.0;Statsoft，Tulsa，Okla.)。图lla，llb，和llc中分别给出结果。实施例21爐血魏料飾C0N4(C)对大鼠VEGF-诱导的血管发牛的作用对大鼠血管发生角膜模型评价Ang-2肽抗体C0N4(C)。通过将VEGF-(或BSA对照物)浸透的尼龙片埋植到角膜基质中(n=8/组)诱导血管发生。以1.0或0.1毫克/大鼠/天皮下注射施用肽抗体TN8C0N4-C7天。用相同剂量的阴性对照肽抗体4883处理另外两组动物。用3.0或0.3毫克的单一载量预先处理所有的组，这个量是1.0或0.lmg维护剂量的三倍(参见附图)。处理7天之后，从大鼠角膜各个数字成像确定两个血管端点片和边缘之间的中点相交的血管数目，和血管面积。TN8C0N4-C处理以剂量依赖方式显著抑制VEGF-诱导的血管发生(p<0.04)，而用对照肽抗体处理对两个端点的任一个没有显著作用。根据受治疗动物的体重，没有明显毒性的证据。图12给出了结果。[1230]实施例22[1231]表位定位将全长(氨基酸1-495)，N-末端(氨基酸1-254)和C_末端(氨基酸255-495)人Ang-2(hAng-2)蛋白质克隆到带有C_末端6xHis标记的CMV-驱动哺乳动物表达载体中。将三个得到的构建体加载体对照物瞬时表达到293T细胞中。然后从感染的细胞收集条件培养基，并且通过6xHisELISA和蛋白质印迹估计培养基中Ang-2的表达水平。[1233]根据下面的方案通过ELISA，通过它们结合人hAng-2的三种版本的能力，测定抗-Ang-2抗体和肽抗体的结合表位每孔用100微升条件培养基包被高结合96-孔测定板，并且在37t:下温育1小时。吸出条件培养基，室温下每孔用200微升5%BSA的PBS溶液封闭平板1小时。然后吸出封闭溶液。以1微克/毫升1%BSA的PBS溶液每孔加入100微升抗体，肽抗体，或Tie2-Fc，并且室温下温育1小时。用200微升0.1%Tween的PBS溶液将孔洗涤四次。每孔加入100微升HRP-偶联的山羊抗_人IgG或山羊抗-小鼠IgG，并且室温下温育45分钟。然后用200微升0.1%Tween的PBS溶液将孔洗涤四次。然后每孔加入100微升TMB底物。在370nm下读取0.D.。[1234]图13a，图13b，和图13c给出结果。[1235]实施例23由于BiaCore测定中固有的一些灵敏性限制，利用S印idyneKinExA分析也评估结合亲和力。91[1237]在KinExA(S即idyne，Boise，Ind.)上试验2xC0N4-C(Pb5714)与huAng-2的结合。Reacti-Gel6x珠(Pierce,Rockford，111.)预先用huAng-2包被并且用BSA封闭。10pM和30pM的2xC0N4-C样品与各种浓度的(0.3pM-3nM)的huAng-2在室温下温育8小时，然后通过huAng-2-包被珠。通过荧光(Cy5)标记的山羊抗-人-Fc抗体(JacksonImmunoResearch,WestGrove，Pa.)定量测定小珠_结合的肽抗体的量。结合信号和平衡中自由肽抗体的浓度成比例。使用双曲线一点均匀结合模型(KinExTM软件)从竞争曲线的非线性回归获得离解平衡常数(KD)。然后对于与huAng-2结合的2xC0N4-C测定KD大约是2pM。如图14所示，使用KinExA分析，证明肽抗体2xCon4对于hAng-2具有2pM。实施例24PEG化肽利用残基14(met)与N_末端残基1(Cys)，从N_末端至C_末端编号，的标准偶联方法和双偶联，用431ABI合成仪合成Ll-7肽。Ll-7肽与甲氣某-聚(乙二醇)_马来酰亚胺的偶联MW:5KDa:称作〃mPEG5K-(Ll-7肽)〃用13.5mg甲氧基_聚(乙二醇)_马来酰亚胺(丽=5KDa;ShearwaterCorp.);0.27ml的50.0mg/mL缓冲液1的溶液，处理400微升缓冲液1(20mM磷酸盐，5mMEDTA，pH6.5)中0.8mg的Ll-7肽的溶液。反应混合物在4。C下温育过夜，然后用1.6mL的缓冲液A(20mMTrisHC1，pH7.2)稀释，并且在Slide-A-Lyzer盒(3500丽C0，Pierce)中用相同的缓冲液透析。在1.0mLHiTrapQS印haroseHP柱(AmershamBiosciencesCorp.)上通过离子交换色谱法纯化透析的反应混合物。通过40柱体积从100%缓冲液A至100%缓冲液B(缓冲液A+0.5MNaCl)梯度在两个1.OmL级分中洗脱出产物峰。使用Micros印IKCentrifugalDevice(PallLifeSciences)将合并的产物级分浓縮至250微升，含有0.23mg蛋白质/毫升。Ll-7肽与l，ll-双-马来酰亚胺四亚乙基二醇的偶联称作〃PE04(Ll-7肽)/[1246]用O.0375毫克的l，ll-双-马来酰亚胺四亚乙基二醇(Pierce)(0.375mL的缓冲液1中0.Img/mL溶液)处理500微升缓冲液1中1.Omg的L1-7肽溶液(20mM磷酸盐，5mMEDTA，pH6.5)。反应混合物在4。C下温育3.33小时，然后用Slide-A-Lyzer盒(3500丽C0，Pierce)中用缓冲液A(20mMTrisHC1，pH7.2)透析。在1.OmLHiTr即QS印haroseHP柱(AmershamBiosciencesCorp.)上通过离子交换色谱法纯化透析的反应混合物。通过40柱体积从100%缓冲液A至100%缓冲液B(缓冲液A+0.5MNaCl)梯度在三个1.OmL级分中洗脱出二聚体产物峰。使用Micros印IKCentrifugalDevice(PallLifeSciences)将合并的产物级分浓縮至550微升，含有0.12mg蛋白质/毫升。Ll-7肽与聚(乙二醇)-双-马来酰亚胺的偶联丽3.4KDa:称作"PEG3.4K(L1-7肽V'用1.125毫克的聚(乙二醇)_双_马来酰亚胺(丽=3.4KDa，ShearwaterCorp.);0.563mL的缓冲液1中2.Omg/mL溶液处理1.5毫升缓冲液1中3.Omg的Ll-7月太溶液(20mM磷酸盐，5mMEDTA，pH6.5)。反应混合物在4。C下温育过夜，然后用Slide-A-Lyzer盒(3500丽C0，Pierce)中用缓冲液A(20mMTrisHC1，pH7.2)透析。在5.OmLHiTr即QS印haroseHP柱(AmershamBiosciencesCorp.)上通过离子交换色谱法纯化透析的反应混合物。通过40柱体积从100%缓冲液A至100%缓冲液B(缓冲液A+0.5MNaCl)梯度在三个3.OmL级分中洗脱出产物峰。使用两个Micros印IKCentrifugalDevice(PallLifeSciences)将合并的产物级分浓縮至850微升，含有0.24mg蛋白质/毫升。[1249]MALDI-TOF质谱结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>[1251]明白对于PEG3.4K(Ll-7肽)和PE04(Ll-7肽)的角注〃2〃指每个聚合物链有两个肽，各位于聚合物的各端。ICs。测定如实施例2所述，通过中和作用ELISA测定自由Ll-7和PEG化肽的hAng:hTie2-Fc相互作用的抑制作用的IC5。。对于中和作用ELISA，如实施例2所述制备结合了人Ang-2多肽的微量滴定板用于亲和力ELISA。在含有大约1%BSA和大约lnMTie_2(Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分只含有该分子的可溶性胞外部分；R&DSystems,目录号313-TI)的PBS溶液中以4倍稀释度从1000nM至0.2pM滴定侯选抗-Ang-2L1_7PEG化和自由肽。向各孔加入大约100微升的抗体/Tie-2溶液之后，培养板在室温下温育过夜，然后用含有大约0.1%Tween-20的PBS清洗五次。冲洗之后，每孔加入大约100微升的抗_Tie_2抗体(PharmingenInc.，catalog#557039)，最终浓度达到大约1微克/毫升，培养板在室温下温育大约1小时。接着，以含有大约1%BSA的PBS中以1:10，000的稀释度每孔加入大约100微升山羊抗_小鼠-IgG-HRP(PierceChemicalCO.，catalog#31432)。培养板在室温下温育大约1小时，然后用含有大约0.1%Tween-20的PBS清洗五次。然后每孔加入大约100微升的TMB底物(如上所述)，使得显色。然后在分光光度计上在大约370nm读取吸光度。[1254]Ll-7肽(C-GGGGG-AQ-TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG-LE)(SEQIDNO:359)包括用于偶联PEG的N-末端半胱氨酸；和一个5Gly连接体。原始噬菌体克隆和肽抗体中都存在AQ和LE侧翼序列。下面给出hAng-2:Tie2抑制作用IC5。结果[1255]肽IC50(nM)Ll-7肽0.49mPEG5K-(Ll-7肽)11.7PE04(Ll-7肽)220.064PEG3.4K(Ll-7肽)20.058〈110>AMGENINC.[1257]〈120〉人血管生成素-2的特异结合剂[1258]〈130>A-801B[1259]〈140>N0TYETASSIGNED[1260]〈141>2002-10-11[1261]〈150>US60/414，15593[1262]〈151>2002-09-27〈150>US60/328,624〈151>2001-10-11〈160>359〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>14〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223>Ang_2结合肽〈400>1LysArgProCysGluGluMetTrpGlyGlyCysAsnTyrAsp1510〈210>2〈211>14〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223>Ang_2结合肽〈400>2HisGinlieCysLysTrpAspProTrpThrCysLysHisTrp1510〈210>3〈211>14〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223>Ang_2结合多肽〈400>3LysArgProCysGluGluliePheGlyGlyCysThrTyrGin1510〈210>4〈211>14〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223>Ang_2结合多肽〈400>494[1301]GinGluGluCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHisMet1510〈210>5〈211>18〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223>Ang_2结合多肽〈400>5PheAspTyrCysGluGlyValGluAspProPheThrPheGlyCysAsp151015AsnHis〈210>6〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223>Ang_2结合多肽〈400>6LysPheAsnProLeuAspGluLeuGluGluThrLeuTyrGluGinPhe151015ThrPheGinGin20〈210>7〈211>14〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223>Ang_2结合肽〈400>7GinTyrGlyCysAspGlyPheLeuTyrGlyCysMetlieAsn1510〈210>8<211>67〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223>寡核苷酸〈400>8[1340]3C￡l￡l￡lC￡l￡l￡lC￡lt￡ltgggtgC3C3g朋3gCggCCgC3朋朋朋CtCg3gggtgg3ggCggt60ggggaca67〈210〉9〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉寡核苷酸〈400〉9ggtcattectggaccggatc20〈210>10〈211>25〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>寡核苷酸〈400>10cgtacaggtttacgcaagaa肌tgg25〈210>11〈211>66<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>寡核苷酸<400>11tttgttggatccattectcgagtttttttgcggccgctttctgtgcaccaccacctccac60ctttac66〈210〉12〈211>32<212>PRT<213>人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的肽抗体〈220><221>misc_feature〈222>(32).(32)〈223〉Xaa=Fc〈400〉12MetGlyAlaGinLysPheAsnProLeuAspGluLeuGluGluThrLeu89/207页〈213〉人工序列1420]〈220〉:1421]〈223〉能结合Ang-2的肽抗体:1422]〈220〉:1423]〈221>misc—feature:1424]〈222>(60)..柳:1425]<223〉Xaa=Fc:1426]〈400>15:1427]MetGlyAlaGinLysPheAsnPr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1015ArgXaa〈210>60〈211>227[2237]〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人Fc:[gGl〈400>60AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGly151015GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet202530lieSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis354045GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal505560HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGinTyrAsnSerThrTyr65707580ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGly859095LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlie100105110GluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinVal115120125TyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGinValSer130135140LeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGlu145150155160TrpGluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro165170175ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrVal180185190AspLysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMet195200205HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSerLeuSerLeuSer210215220ProGlyLys225〈210>61〈211>14〈212>PRT〈213〉人工序列[2276]〈220〉〈223〉从TN8-IX文库产生的共有基序〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1-3，5，7，12，13和).(14)〈223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.〈400>61XaaXaaXaaCysXaaAspXaaTyrTrpTyrCysXaaXaaXaa1510〈210>62〈211>14〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉从TN8-IX文库产生的共有基序〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1-3，5，7，12，13和).(14)〈223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.〈400>62XaaXaaXaaCysXaaAspXaaTyrThrTyrCysXaaXaaXaa1510〈210>63〈211>14〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉从TN8-IX文库产生的共有基序〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1-3，5，7，12，13和)(14)〈223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.〈400>63XaaXaaXaaCysXaaAspXaaPheTrpTyrCysXaaXaaXaa1510〈210>64〈211>14〈212>PRT〈213>人工序列120[2315]〈220〉〈223〉从TN8-IX文库产生的共有基序〈220>〈221>misc_feature〈222>(1_3，5，7，12，13和)(14)〈223>Xaa指任何天然存在的氨基酸.〈400>64XaaXaaXaaCysXaaAspXaaPheThrTyrCysXaaXaaXaa1510〈210>65〈211>5〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>65TrpAspProTrpThr15〈210>66〈211>6〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>66TrpAspProTrpThrCys15〈210>67〈211>7〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(2).(2)〈223>Xaa是酸性或中性极性氨基酸残基〈400>67CysXaaTrpAspProTrpThr121[2354]15〈210>68<211>8〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈220〉〈22l〉misc—feature〈222〉(2).(2)〈223>Xaa是酸性或中性极性氨基酸残基〈400>68CysXaaTrpAspProTrpThrCys15〈210>69〈211>14〈212〉PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈220〉〈221>misc_feature〈222>(1，2和)..(3)〈223〉Xaa各自独立地是氨基酸残基〈220><221>misc_feature〈222〉(5).(5)〈223>Xaa是氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222>(12).(12)〈223〉Xaa不存在或者是氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222>(13).(13)〈223>Xaa不存在或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222>(14).(14)122[2393]〈223>Xaa是中性疏水或中性极性氨基酸残基〈400>69XaaXaaXaaCysXaaTrpAspProTrpThrCysXaaXaaXaa1510〈210>70〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(1和)(15)〈223>Xaa不存在或者是氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(2和)(16)〈223>Xaa不存在或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222>(3_6，18，19和).(20)〈223>Xaa各自独立地不存在或者是氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(8).(8)〈223>Xaa是氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222>(17).(17)〈223>Xaa不存在或者是中性疏水或中性极性氨基酸残基〈400>70XaaXaaXaaXaaXaaXaaCysXaaTrpAspProTrpThrCysXaaXaa151015XaaXaaXaaXaa[2427]20〈210>71〈211>10〈212>PRT〈213>人工序列123[2432]〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈220〉〈221>misc—feature〈222>(2)..(2)〈223〉Xaa是中性疏水氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(4)..(4)〈223〉Xaa是A，D，或E.〈220〉<221>misc—feature〈222〉(6)..(6)〈223>Xaa是酸性氨基酸残基〈220〉〈221>misc—feature〈222>(7)..(7)<223>Xaa是氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(8)..(8)〈223>Xaa是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基〈400>71ProXaaAspXaaLeuXaaXaaXaaLeuTyr1510〈210>72〈211>22〈212>PRT〈213〉人工序列<220>〈223〉能结合Ang_2的多肽〈220〉〈221>misc_feature〈222>(1，4和)..(20)〈223>Xaa不存在或者是氨基酸残基<220>〈221>misc—feature〈222>(2，15，16和).(21)〈223>Xaa不存在，或者是中性极性，酸性，或碱性氨基酸残基124[2471]〈220>〈221>misc—feature〈222>(3，17和).(18)〈223>Xaa不存在，或者是中性疏水，或中性极性氨基酸残基〈220〉〈221>misc—feature〈222>(6)..(6)〈223〉Xaa是中性疏水氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(8).(8)〈223〉Xaa是A，D，或E.〈220〉〈221>misc—feature〈222>(10).(10)〈223>Xaa是酸性氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222>(11)..(11)〈223>Xaa是氨基酸残基〈220〉〈221>misc—feature〈222>(12).(12)〈223>Xaa是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基〈220〉〈221>misc—feature<222>(19和)..(22)〈223>Xaa不存在，或者是中性疏水，中性极性，或碱性氨基酸残基〈400>72XaaXaaXaaXaaProXaaAspXaaLeuXaaXaaXaaLeuTyrXaaXaa151015XaaXaaXaaXaaXaaXaa20〈210>73〈211>8〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽[2510]〈220〉〈221>misc—feature〈222〉(3)(3)〈223>Xaa是中性极性氨基酸残基〈220〉〈22l>misc—feature〈222〉(4).(4)〈223>Xaa是酸性氨基酸残基.〈220>〈221>misc—feature〈222>(5)..(5)〈223>Xaa是中性极性或酸性氨基酸残基〈220〉<221>misc—feature〈222〉(6和)..(7)〈223>Xaa是中性疏水氨基酸残基〈400>73ArgProXaaXaaXaaXaaXaaGly15〈210>74〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈220〉〈221>misc_feature〈222>(1，2，4，13，14，19和)(20)〈223>Xaa是中性疏水或中性极性氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222>(3，9和).(17)〈223>Xaa是中性极性或酸性氨基酸残基<220>〈22l>misc—feature〈222>(7，15和)(16)〈223>Xaa是中性极性氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature[2549]〈222〉(8)(8)〈223>Xaa是酸性氨基酸残基〈220><221>misc—feature<222>(10和).(11)〈223〉Xaa是中性疏水性氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222>(18)..(18)<223>Xaa是中性疏水性或碱性氨基酸残基〈400〉74XaaXaaXaaXaaArgProXaaXaaXaaXaaXaaGlyXaaXaaXaaXaa151015XaaXaaXaaXaa20〈210>75〈211>13〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉<223>能结合Ang_2的多肽〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(2)(2)〈223>Xaa是酸性氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(4).(4)〈223>Xaa是中性疏水性或碱性氨基酸残基〈220>〈221>misc—feature<222>(5)..(5)〈223〉Xaa是E，D，或Q〈220〉〈221>misc_feature〈222>(10)..(10)〈223>Xaa是中性疏水性或中性极性氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature127[2588]〈222〉(13).(13)〈223>Xaa是酸性残基〈400>75CysXaaGlyXaaXaaAspProPheThrXaaGlyCysXaa1510〈210>76<211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>76ProlieArgGinGluGluCysAspT卬AspProTrpThrCysGluHis151015MetTrpGluVal20〈210>77〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>77ThrAsnlieGinGluGluCysGluTrpAspProTrpThrCysAspHis151015MetProGlyLys20〈210〉78〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈220>〈223〉能结合Ang-2的多肽<400>78TrpTyrGluGinAspAlaCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetAlaGluVal[2625]20〈210>79[2627]〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>79AsnArgLeuGinGluValCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetGluAsnVal20〈210>80〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>80AlaAlaThrGinGluGluCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetProArgSer20〈210>81〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>81LeuArgHisGinGluGlyCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetPheAspTrp20〈210>82〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>82[2666]ValProArgGinLysAspCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetTyrValGly20<210>83〈211〉20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉<223>能结合Ang_2的多肽〈400〉83SerlieSerHisGluGluCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetGinValGly20〈210>84〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉<223>能结合Ang_2的多肽〈400〉84TrpAlaAlaGinGluGluCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetGlyArgMet20〈210>85〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉<223>能结合Ang_2的多肽〈400〉85ThrTrpProGinAspLysCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetGlySerThr[2702]20〈210>86〈211>20〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>86GlyHisSerGinGluGluCysGlyTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetGlyThrSer20〈210>87〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220>〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>87GinHisTrpGinGluGluCysGluTrpAspProTrpThrCysAspHis151015MetProSerLys20〈210〉88〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽<400〉88AsnValArgGinGluLysCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetProValArg20〈210>89〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>89LysSerGlyGinValGluCysAsnTrpAspProTrpThrCysGluHis131[2744]151015MetProArgAsn20〈210〉90〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>90ValLysThrGinGluHisCysAspTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetArgGluTrp20<210>91〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>91AlaTrpGlyGinGluGlyCysAspTrpAspProT卬ThrCysGluHis151015MetLeuProMet20<210>92〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列<220><223>能结合Ang-2的多肽〈400〉92ProValAsnGinGluAspCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetProProMet20〈210〉93〈211〉20〈212>PRT132[2783]〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>93ArgAlaProGinGluAspCysGluTrpAspProTrpThrCysAlaHis151015MetAsplieLys20〈210>94〈211>20<212>PRT〈213〉人工序列<220>〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>94HisGlyGinAsnMetGluCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetPheArgTyr20〈210〉95〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400〉95ProArgLeuGinGluGluCysValTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetProLeuArg20〈210>96〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>96ArgThrThrGinGluLysCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015[2822]MetGluSerGin[2823]20〈210>97〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>97GinThrSerGinGluAspCysValTrpAspProTrpThrCysAspHis151015MetValSerSer20〈210>98〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>98GinVallieGlyArgProCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015LeuGluGlyLeu20〈210>99〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>99TrpAlaGinGinGluGluCysAlaTrpAspProTrpThrCysAspHis151015MetValGlyLeu[2856]20〈210>100〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列[2861]〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>100LeuProGlyGinGluAspCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetValArgSer20〈210>101〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列<220>〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>101ProMetAsnGinValGluCysAspTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetProArgSer20〈210>102〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉<223>能结合Ang-2的多肽〈400>102PheGlyTrpSerHisGlyCysGluTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetGlySerThr20<210>103〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽<400>103LysSerThrGinAspAspCysAspTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetValGlyPro[2900]20〈210>104〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>104GlyProArglieSerThrCysGinTrpAspProTrpThrCysGluHis151015MetAspGinLeu20〈210>105〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈220>〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>105SerThrlieGlyAspMetCysGluTrpAspProTrpThrCysAlaHis151015MetGinValAsp20〈210>106〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>106ValLeuGlyGlyGinGlyCysGluTrpAspProTrpThrCysArgLeu151015LeuGinGlyTrp20〈210>107〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉[2939]〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400〉107ValLeuGlyGlyGinGlyCysGinTrpAspProTrpThrCysSerHis151015LeuGluAspGly20<210>108〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列<220>〈223〉能结合Ang-2的多肽<400>108ThrThrlieGlySerMetCysGluTrpAspProTrpThrCysAlaHis151015MetGinGlyGly20〈210>109〈211>20〈212〉PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>109ThrLysGlyLysSerValCysGinTrpAspProTrpThrCysSerHis151015MetGinSerGly20〈210>110<211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400〉110ThrThrlieGlySerMetCysGinTrpAspProTrpThrCysAlaHis151015MetGinGlyGly[2977]20137[2978]〈210>111〈211>20〈212>PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>111TrpValAsnGluValValCysGluTrpAspProTrpThrCysAsnHis151015TrpAspThrPro20〈210>112〈211>20<212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>112ValValGinValGlyMetCysGinTrpAspProTrpThrCysLysHis151015MetArgLeuGin20〈210>113〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400>113AlaValGlySerGinThrCysGluTrpAspProTrpThrCysAlaHis151015Leu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PheGlyCys151015GluLysGinArg20〈210>152〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>152AlaGinAspTyrCysGluGlyMetGluAspProPheThrPheGlyCys151015GluMetGinLys20〈210>153〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽149[3446]〈400〉153LeuLeuAspTyrCysGluGlyValGinAspProPheThrPheGlyCys151015GluAsnLeuAsp20〈210〉154〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>154HisGinGluTyrCysGluGlyMetGluAspProPheThrPheGlyCys151015GluTyrGinGly20〈210>155〈211>20〈212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>155MetLeuAspTyrCysGluGlyMetAspAspProPheThrPheGlyCys151015AspLysGinMet20〈210>156〈211>20〈212>PRT<213>人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang_2的多肽〈400>156LeuGinAspTyrCysGluGlyValGluAspProPheThrPheGlyCys151015GluAsnGinArg[3483]20〈210>157150[3485]〈211〉20〈212〉PRT〈213>人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈400〉157LeuGinAspTyrCysGluGlyValGluAspProPheThrPheGlyCys151015GluLysGinArg20〈210〉158〈211〉20〈212〉PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉能结合Ang-2的多肽〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1)(1)〈223〉Xaa不存在或者是中性疏水性，中性极性，或碱性氨基酸残基〈220〉<221〉misc_feature〈222〉(2，4，14)..(19)〈223〉Xaa是中性疏水性或中性极性氨基酸残基〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(3，6)..(17)〈223〉Xaa是酸性氨基酸残基〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(8)(8)〈223>Xaa中性疏水性氨基酸残基〈220〉<221〉misc_feature〈222〉(9)..(9)〈223〉Xaa是E，D，或Q〈220〉〈221>misc_feature〈222〉(18).(18)[3524]〈223>Xaa是中性疏水性，中性极性，或碱性氨基酸残基〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(20).(20)〈223>Xaa不存在或者是氨基酸残基〈400>158XaaXaaXaaXaaCysXaaGlyXaaXaaAspProPheThrXaaGlyCys151015XaaXaaXaaX朋20〈210>159〈211>60〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>编码能结合Ang_2的肽的DNA〈400>159ccgatccgtcaggaagaatgcgactgggacccgtggacct.gcgaacacatgtgggaagtt60〈210>160〈211>60<212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223>编码能结合Ang_2的肽的DNA<400>1603cc朋c3tcc3gg朋gaatgcg朋tggg3cccgtggacctgcgacc3C3tgccgggtaaa60〈210>161〈211〉60〈212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400〉161tggtacgaacaggacgcttgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatggctg朋gtt60<210>162〈211>60〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉152[3563]〈223〉编码能结合Ang_2的肽的DNA〈400>162aaccgtctgcaggaagtttgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatggaaaacgtt60<210>163〈211>60〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400>163gctgctecccaggaagaatgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatgccgcgttcc60〈210>164<211>60〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>编码能结合Ang_2的肽的DNA〈400>164ctgcgtcaccaggaaggttgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatgttcgactgg60〈210>165〈211>60〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400>165gttccgcgtcagaaagactgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatgtecgttggt60〈210>166〈211>60<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang_2的肽的DNA〈400>166tgggctgctcaggaagaatgcgaatgggatccgtggacttgcgaacacatgggtcgtetg60〈210>167〈211>60〈212>DNA〈213>人工序列[3602]〈220〉〈223>编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400〉167acttggccgcaggacaaatgcgaatgggatccgtggacttgcgaacacatgggttctact〈210〉168〈211〉60〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400>168ggtcactcccaggaagaatgcggttgggacccgtggacctgcg朋cacatgggtecgtcc<210〉169〈211〉60〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA<400〉169cagcactggcaggaagaatgcgaatgggacccgtggacctgcgaccacatgccgtccaaa〈210>170<211〉60〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400〉170朋cgttcgtcagg朋a旭tgcg朋tgggacccgtggacctgcgaacacatgccggttcgt〈210>171〈211>60<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400〉171aaatccggtcaggttgaatgcaactgggacccgtggacctgcgaacacatgccgcgteac〈213>人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400〉172gttaaaacccaggaacactgcgactgggac〈210>173〈211>60〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400>173gcttggggtcaggaaggttgcgactgggac〈210〉174〈211>60<212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223>编码能结合Ang_2的肽的DNA〈400>174ccggtteaccaggaagactgcgaatgggac〈210>175〈211〉60〈212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400〉175cgtgctccgcaggaagactgcgaatgggac<210>176<211>60〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>编码能结合Ang_2的肽的DNA〈400>176cacggtcagaacatggaatgcg朋tgggac〈210〉177〈211>60ccgtggacctgcgaacacatgcgtgaatgg60ccgtggacctgcgaacacatgctgccgatg60ccgtggacctgcgaacacatgccgccgatg60ccgtggacctgcgctcacatggacatcaaa60ccgtggacctgcgaacacatgttccgttac60[3680]〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉<223>编码能结合Ang_2的肽的DNA〈400>177ccgcgtctgcaggaagaatgcgtttgggacccgtggacctgcgaacacatgccgctgcgt60〈210>178〈211>60〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223>编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400>178cgteccacccgigg朋朋Eitgcg￡i￡itggg￡icccgtggacctgcg朋c3catgg朋tcccag60〈210>179〈211>60<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400>179cagacctcccaggaagactgcgtttgggacccgtggacctgcgaccacatggtttcctcc60〈210>180〈211>60〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400>180caggttetcggtcgtccgtgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacctggaaggtctg60〈210>181〈211>60〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400>181tgggctcagcaggaagaatgcgcttgggacccgtggacctgcgaccacatggttggtctg60〈210>182[3719]〈211>60〈212>DNA〈213>人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400>182ctgccgggtcaggaagactgcgaatgggacccgtggacctgcgaacacatggttcgttcc60〈210>183〈211>60〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang-2的肽的DNA〈400>183ccgatgaaccaggttgaatgcgactgggacccgtggacctgcgaacacatgccgcgttcc60〈210>184〈211>60<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang_2的肽的DNA〈400>184ttcggttggtctcacggttgcgaatgggatccgtggacttgcgaacacatgggttctecc60<210>185〈211>60〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang_2的肽的DNA〈400〉185aaatccacccaggacgactgcgactgggacccgtggacctgcgaacacatggttggtccg60〈210>186〈211>60〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉编码能结合Ang_2的肽的DNA〈400>186ggtccgcgtatctccacctgccagtgggacccgtggacctgcgaacacatggaccagctg60157[3758]〈210>187〈211>60〈212〉DNA〈213〉人工序列<220>〈223>编码能结合Ang-2的肽的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括权利要求1，5，8或11的至少一种肽和载体的融合多肽及其生理可接受盐，其中所述融合多肽能结合Ang-2。13.权利要求12的融合多肽，其中所述载体是Fc结构域，聚乙二醇，脂质，胆固醇基团，糖类，和寡糖中的至少一种。14.权利要求1，5，8或11的多肽，其是环状的。15.权利要求1，5，8或11的多肽的二聚体或多聚体。16.能结合Ang-2的多肽及其生理可接受盐，所述多肽包括SEQIDNO:25的氨基酸序列.17.权利要求16的多肽，其中SEQIDNO:25的Fc为人IgGl的Fc。18.权利要求17的多肽，其中SEQIDNO:25的Fc的氨基酸序列为SEQIDNO:60。19.权利要求16的多肽及其生理可接受盐，其中所述多肽由SEQIDNO:25的氨基酸序列组成。20.权利要求19的多肽，其中SEQIDNO:25的Fc的氨基酸序列为SEQIDNO:60。21.—种编码权利要求16-20任一项的多肽的多核苷酸。22.权利要求21的多核苷酸，其为SEQIDNO:46.23.—种包含权利要求21或22的多核苷酸的表达载体。24.—种包含权利要求23的表达载体的宿主细胞。25.权利要求24的宿主细胞，其中所述细胞为原核细胞。26.权利要求25的宿主细胞，其中所述细胞为大肠杆菌细胞。27.权利要求24的宿主细胞，其中所述细胞为真核细胞。28.—种含有与其药学可接受载体混合的有效量的权利要求16-20任一项的多肽的药物组合物。29.—种抑制哺乳动物血管发生的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。30.—种治疗受试者血管发生的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。31.—种调节哺乳动物血管发生的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。32.—种抑制哺乳动物中以不需要的血管发生为特征的肿瘤生长的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。33.—种治疗哺乳动物癌症的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽和化疗药物。34.权利要求33的方法，其中所述化疗药物是5-FU，CPT-ll和脱乙酰基紫杉醇中的至少一种。35.—种调节哺乳动物血管渗透性或血浆渗漏中至少一种的方法，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。36.—种治疗哺乳动物中以下病症中的至少一种的方法眼新血管病，成血管瘤，血管瘤，炎性疾病，慢性炎性紊乱，子宫内膜异位，肿瘤性疾病，骨相关疾病，或者牛皮癣，包括施用治疗有效量的权利要求16-20任一项的多肽。37.权利要求36的方法，其中所述炎性疾病为关节炎。全文摘要本发明公开了结合Ang-2的肽。还公开了包括所述肽的肽抗体，制备这样的肽和肽抗体的方法，用这样的肽和肽抗体治疗的方法。文档编号C12N1/15GK101787072SQ20091015945公开日2010年7月28日申请日期2002年10月11日优先权日2001年10月11日发明者H·棉,J·D·奥利纳申请人:安姆根有限公司