用于病原体检测的转运系统和病原体检测方法

用于病原体检测的转运系统和病原体检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于病原体检测的转运系统，其包括多孔基板、子容器及运输容器；该多孔基板上有样品采集区及标签区且该样品采集区含有可裂解病原体的材料；当将含有病原体的样品涂在样品采集区后，病原体被裂解，无致病性，从而该转运系统可以较为快速、安全地将含有病原体的样品送至检测点。该子容器可容置该多孔基板，该运输容器可容置该子容器，该子容器及该运输容器上均设有用于直接目视查看该标签区以及多孔基板等运输容器及子容器内其他内容物的透明窗口。本发明还涉及一种用于病原体检测的方法，即通过上述转运系统将样品转运至检测点，再通过高通量并行测序和数据分析的方法判断出样品中核酸分子的来源，提供样品中可能存在的病原体信息。
【专利说明】用于病原体检测的转运系统和病原体检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及运输病原体的方法以及运输病原体等样品的容器，尤其是涉及一种针对能够使用已降解的样品但还保存有样品核酸分子的用于病原体检测的转运系统和病原体检测方法。
【背景技术】
[0002]全球化的不断发展使得跨国和跨洲交流更加频繁，由此而来的日益增加的人流与物流交换以及更加动态化的人际与社会关系，大大加速了病原体的扩散与传播。这直接导致了日益增多的食源性疾病的大暴发和严重影响社会生产与生活正常进行的流行病甚至大流行病的出现，例如艾滋病的出现与扩增、亚洲地区的非典疫情、众多恶性大肠杆菌、李氏杆菌和沙门氏菌引起的食物中毒事件、全球性的HlNl流感大暴发、津巴布韦和海地的霍乱疫情以及人为的炭疽杆菌生物恐怖袭击事件等。因此监控细菌性和病毒性的病原体对于公共卫生、医疗甚至社会与国家安全都有重要意义。
[0003]为了有效地预防与控制流行病与大流行病的出现，必须要有有效的传染病监视、检测和治疗的方法。传统的尽管人们对于很多传染病有比较有效的预防与治疗手段，但是在快速和方便地检测病原体等方面上有明显的欠缺。这些欠缺具体地体现在:例如当前病原体检测手段对于病原体活性的依赖性、运输活体病原体所带来的危险性、当前病原体检测所缺乏的全面性以及对于从业人员的技术熟练程度及其操作的可靠性或可重复性的依赖性等。
[0004]当前的病原体检测手段主要有两大类:基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。基于蛋白的检测方法利用对某一种病原体有特异识别性的抗体来识别该病原体。该类方法通常也被称为基于 免疫反应的方法。此类方法使用的抗体往往被特殊分子标记，例如被荧光染料分子基团标记等，从而使得在抗体与病原体抗原结合后该免疫反应能够产生可识别的信号。
[0005]基于核酸的检测方法大多是基于DNA的。此类方法通常利用针对某一种病原体特异的DNA或RNA序列来设计引物，通过PCR (聚合酶链式反应)来特异性地进行核酸分子片段扩增。此类方法也被称为基于PCR的检测方法。反应成功后扩增出的核酸分子片段可以通过电泳的方法来检测片段分子的大小或者可以通过直接测序的方法来更精确地鉴定扩增片段的核酸序列组成。
[0006]不管是使用上述两类方法的任何一种，都需要事先知道检测哪种病原体。因为只有确定了使用何种病原体才能够确定使用哪种特异性的抗体(基于蛋白的方法)或引物(基于核酸的方法)。这就要求检测者在对其样品进行化验之前就对样品内可能存在的病原体有一定的预测，也即上述方法以及使用这些方法的测试是预测依赖性的。以门诊医生化验病人的样品为例来说，医生可以通过观察和询问病人的症状，结合医生自己的医学知识，例如何种病原体会导致此类症状，来预测在病人的样品中可能有哪些病原体，然后将样品送交化验室来检测医生预测的可能存在在样品里的病原体，也即在实际操作中，在还没有对样品进行任何检验之前，就要凭经验或知识对样品内含有的病原体进行预测。但是这种预测在某些条件下是不现实甚至是不可能的，例如当医生缺乏相应的经验或专业知识时或当出现非典型性或并发性的症状时等。此外，如果在同一个样品内要检测多种病原体，使用现有的方法就需要进行多次测试，即针对预测存在的每一种病原体进行一次针对该病原体的测试。因此这些多次测试累加起来的复杂度和花费都是很大的。同时，如果使用现有方法进行广谱检测，即同时检测多种不同的病原体，将会消耗及大量的样品。而有时在实际操作过程中很难或者不可能获得足够量的样品，从而无法进行多项测试。基于免疫的方法和基于PCR的方法都有上述种种缺陷。因此，这类方法只适用于一次检测少数几种病原体，并且要求用户在检测前对可能存在于样品内的病原体进行预测。
[0007]因此，人们需要一种新型的、能够快速方便地进行广谱病原体检测的产品或方法。近期病原体检测科技的发展，特别是相关的纳米科技和微流体技术的发展，大大增加了病原体检测的速度和吞吐量，同时也降低了测试所需样品和试剂的量。例如微流体生物传感器技术能够在消耗仅仅一小部分试剂的条件下达到很高的检测灵敏度。核酸微阵列技术能够同时检测出多种病原体。
[0008]但是上述这类技术仍然有不足，所以至今尚未被大规模地广泛采用。所有基于蛋白的生物传感器在测试前都需要样品内病原体仍然有活性，或者其病原体蛋白完好未降解，也即需要在采样和样品运输过程中使用复杂昂贵的设备或材料，并且涉及复杂的操作手续，例如为了维持样品内病原体的活性或者防止病原体蛋白降解，运输过程中使用冰或干冰对样品进行冷却是最基本的要求。此外，因为在采样、运输和投递过程中，病原体仍然保存有传染性，操作或接触人员需要保持高度戒备并且严格遵守复杂的操作程序，只有这样才能够即防止样品内的病原体污染 外界环境，也防止外界环境内的微生物污染样品。另夕卜，尽管生物传感器对于其设计所针对的某一特定病原体能够提供直接的结果，但是使用生物传感器进行广谱病原体检测仍然需要多项测试，每一项针对某一病原体的测试都需要一种对该病原体特异的生物传感器。
[0009]核酸微阵列使用的是另外一种反应原理，即利用其覆着的探针与病原体体内的核酸分子进行杂交而进行反应。在杂交反应过程中分子片段并没有扩增步骤，因此为了产生可识别的信号，核酸微阵列的方法需要大量的核酸片段存在于反应体系中，而且现阶段通常还要求在采样、运输和投递过程中保持样品内病原体的活性。
[0010]为了降低运送活体病原体样品所带来的危险，一种解决方案是消除所有运送环节。为了能够消除运送这个环节，就需要在样品采集现场建立能够进行病原体检测的实验室者使用能移动实验室，即将实验所需的所有设备临时全部转移到采样地点。但这种做法不仅仅需要昂贵的特殊设备，还需要经过特殊训练的从业人员才能够在采样现场进行检测操作。
[0011]除此以外，上述依赖于病原体活性的检测方法不仅仅涉及繁杂昂贵的采样和运输过程来保证样品的活性以及避免污染，而且还有生物安全方面的隐患，例如生物恐怖袭击和生物破坏活动的危险。恐怖分子可以在投递给分析实验室的普通样品内搀入具有严重破坏性的病原体，而不在样品包装上做出任何标记。因为在当前为了保持样品内待测病原体的活性，样品往往被保存在密闭、低温等特殊条件下，这些条件同时也会保持恐怖分子搀入的破坏性病原体的活性。当实验室工作人员把这个恐怖分子的包裹作为普通样品打开后，特别是在生物安全防范措施不到位的情况下，恐怖分子搀入的病原体就可以感染实验室工作人员。而实验室工作人员会进一步把这些病原体传播给社会上的其它人员。此外，因为当前方法对样品活性的依赖性，人们会采取的种种保护措施在运输过程中保持样品中病原体活性，这使得不法分子有机会轻易地破坏扰乱正常的样品分析，例如通过在样品里人为地加入其它外源病原体，从而改变样品内的组成或者通过破获运输过程的维持活性的条件，从而使实验室无法正常分析出样品中的病原体。

【发明内容】

[0012]基于此，有必要提供一种能够快速、安全的可同时检测多种病原体的用于病原体检测的转运系统和病原体检测方法。
[0013]一种用于病原体检测的转运系统，包括多孔基板、子容器及运输容器；所述多孔基板上设有样品采集区及标签区且所述样品采集区含有可裂解病原体并保存所述病原体的核酸分子的材料；所述子容器可容置所述多孔基板，所述运输容器可容置所述子容器，所述子容器及所述运输容器上均设有用于直接目视查看所述标签区以及所述运输容器和所述子容器内的内容物的透明窗口。
[0014]在其中一个实施例中，所述多孔基板的材料为纤维素类材料、玻璃纤维、微纤维、纳米纤维及布料中的至少一种。
[0015]在其中一个实施例中，所述多孔基板为FTA卡。
[0016]在其中一个实施例中，所述子容器为信封、套或夹。
[0017]在其中一个实施 例中，所述转运系统还包括可容置在所述子容器的内包装容器，所述内包装容器为信封、套或夹。
[0018]在其中一个实施例中，所述子容器、所述运输容器及所述内包装容器可透气。
[0019]在其中一个实施例中，所述内包装容器、所述子容器及所述运输容器上设有开口，且所述内包装容器上的开口、所述子容器上的开口及所述运输容器上的开口错开设置。
[0020]在其中一个实施例中，所述转运系统还包括用于封装所述运输容器的安全封条。[0021 ] 在其中一个实施例中，所述转运系统还包括设在所述运输容器内的干燥剂。
[0022]一种病原体检测方法，该检测方法使用上述任一实施例所述的转运系统，所述检测方法包括如下步骤:
[0023]将含有样品的多孔基板放置入运输容器的子容器内，所述多孔基板在降解所述样品的同时保存有所述样品内的核酸分子；
[0024]将所述运输容器投递至检测点，从所述运输容器中取出所述多孔基板，并从所述多孔基板中提取出所述样品；
[0025]以提取的所述样品为基础扩增核酸分子；
[0026]分析扩增的所述核酸分子，得到所述样品含有的病原体的检测信息。
[0027]在其中一个实施例中，所述分析扩增的所述核酸分子包括如下步骤:
[0028]在检测点使用高通量并行测序的方法分析所扩增的核酸分子，所述高通量并行测序的方法同时测得样品内所有核酸分子的序列，该序列数据以数字信息的方式进行存储；
[0029]通过序列比对和使用参考数据库，识别出高通量并行测序所产生的序列，判断出样品中核酸分子的来源。[0030]在其中一个实施例中，所述检测方法还包括使用棉签或药签将所述样品涂抹至所述样品采集区表面的步骤。
[0031]在其中一个实施例中，所述检测方法还包括在所述样品采集区表面涂抹所述样品后向所述采集区表面添加乙醇或异丙醇以保存核酸的步骤。
[0032]在其中一个实施例中，所述样品来自于能够通过空气传播的病原体、唾液、痰液、尿液、血液、血溃、皮肤、粪便、水、食品、植物、工业原料、土壤、垃圾、物体表面样品、病毒、细菌或以上各项的组合。
[0033]在其中一个实施例中，所述核酸分子为DNA、tRNA、mRNA、rRNA、ncRNA、npcRNA、nmRNA、fRNA、sRNA、snoRNA、miRNA、siRNA、piRNA 及 long ncRNA 中的至少一种。
[0034]在其中一个实施例中，所述将所述运输容器投递至检测点是通过邮政或快递服务投递所述运输容器至所述检测点。
[0035]在其中一个实施例中，所述扩增过程使用的引物为16S核糖体RNA的引物、抗生素耐药性基因的引物、致病岛基因的引物及可定向扩增多种广谱病原体的引物中的至少一种。
[0036]在其中一个实施例中,所述扩增所述核酸分子的过程还包括使用Smith-Waterman算法进行序列比对、使用序列相似性搜索工具或使用K-mer索引寻找病原体保守区序列的步骤。
[0037]在其中一个实施例中，所述分析扩增的所述核酸分子是使用多重PCR测序仪及高通量并行测序仪中至少一种测序仪对扩增的核酸分子进行测序，并对测序得到的序列与参考数据库中的标准序列进 行比对。
[0038]在其中一个实施例中，还包括对测序得到的每一个核酸分子的化学分子序列转换为数字化序列，并将所述数字化序列转换成以字符为代表的核酸序列的步骤。
[0039]在其中一个实施例中，所述对测序得到的序列与参考数据库中的标准序列进行比对包括如下步骤:首先将所述数字序列与参考数据库中的已知核酸序列相比较，如果参考数据库中不存在任何已知序列与该数字序列相一致，则该数字序列为来自于未知来源；如果参考数据库中存在与该数字序列相一致的已知序列，则根据该已知序列在信息源中的剩余信息确定该数字序列来源的信息。
[0040]上述用于病原体检测的转运系统由于多孔基板的样品采集区含有可裂解病原体并保存其核酸分子的材料，当将含有病原体的样品涂在样品采集区后，病原体被裂解，无致病性，从而该转运系统可以较为快速、安全的将含有病原体的样品送至检测点。同时，通过上述检测方法，可以较为方便的同时检测出多种病原体，安全性及结果可靠性较高，且该方法不需要在检测前预测样品内是否含有病原体以及可能含有哪种病原体，可以广泛推广应用在病原体的检测领域。
【专利附图】

【附图说明】
[0041]图1为一实施方式的用于病原体检测的转运系统的分解示意图；
[0042]图2为图1中用于病原体检测的转运系统的组装示意图；
[0043]图3为图2组装后的透视图；
[0044]图4为一实施方式的病原体检测方法的流程示意图；[0045]图5为一实施方式的病原体检测方法中判断方法示意图；
[0046]图6为对比例I显示的生物分析仪的结果示例图，表示的是检测到的通过直接扩增发酵产物中的细菌16S核糖体RNA的V3区(338位至514位)而得到的DNA ；
[0047]图7为实施例1生物分析仪的结果示例图，表示的是检测到的通过扩增采集到FTA卡上的发酵产物中的细菌16S核糖体RNA的V3区(338位至514位)而得到的DNA ；
[0048]图8为对比例2显示的生物分析仪的结果示例图，表示的是检测到的通过直接扩增发酵产物中的细菌16S核糖体RNA的V6区(781位至1082位，也包括V5和V7区)而得到的DNA ；
[0049]图9是实施例2生物分析仪的结果示例图，表示的是检测到的通过扩增采集到FTA卡上的发酵产物中的细菌16S核糖体RNA的V6区(781位至1082位，也包括V5和V7区)而得到的DNA ；
[0050]图10为对比例3显示的生物分析仪的结果示例图，表示的是检测到的通过直接扩增人类唾液样品中的细菌16S核糖体RNA的V3区(338位至514位)而得到的DNA ；
[0051]图11为实施例3生 物分析仪的结果示例图，表示的是检测到的通过扩增采集到FTA卡上的人类唾液样品中的细菌16S核糖体RNA的V3区(338位至514位)而得到的DNA ；
[0052]图12为对比例4显示的生物分析仪的结果示例图，表示的是检测到的通过直接扩增人类唾液样品中的细菌16S核糖体RNA的V6区(781位至1082位，也包括V5和V7区)而得到的DNA ；
[0053]图13为实施例4生物分析仪的结果示例图，表示的是检测到的通过扩增采集到FTA卡上的人类唾液样品中的细菌16S核糖体RNA的V6区(781位至1082位，也包括V5和V7区)而得到的DNA。
【具体实施方式】
[0054]下面主要结合附图及具体实施例对用于病原体检测的转运系统和病原体的检测方法作进一步详细的说明。
[0055]请参图1-3，一实施方式的用于病原体检测的转运系统100包括多孔基板110、内包装容器120、子容器130及运输容器140。其中，多孔基板110可收容于内包装容器120中，内包装容器120可收容于子容器130中，子容器130可收容于运输容器140中。
[0056]本实施方式的多孔基板110包括样品采集区112及标签区114。样品采集区112呈圆形，标签区114置于样品采集区112的下方。其中样品采集区112上含有可裂解病原体的材料，用于裂解病原体。多孔基板110可以采用任何适合于采集样品的材质制作。在一个实施方式中，多孔基板110可以来自于如下几大类材料:纤维素材料:例如纸、卡纸或滤纸；纤维:例如微纤维或纳米纤维；玻璃纤维；布料或上述各项的组合。在另一个实施方式中，多孔基板110是FTA卡。样品采集区112上的可裂解病原体的材料能够裂解样品，降解蛋白并保存核酸分子。其中，裂解样品的作用包括:裂解细胞膜、裂解细胞壁、裂解蛋白、裂解细胞的或细胞器膜、裂解脂类、降解病毒衣壳或以上各项的组合。
[0057]内包装容器120可以为信封、套或夹。可以理解，在其它实施方式中，该转运系统100可以不包括内包装容器120，多孔基板110直接容置在子容器130中。内包装容器120可以采用透明材料制作或者开设有用于观察标签区114以及内包装容器120、子容器130和运输容器140内的内容物的透明窗口。
[0058]子容器130可以为信封、套或夹。子容器130可以采用透明材料制作或者开设有用于观察标签区114的透明窗口。
[0059]运输容器140可以采用透明材料制作或者开设有用于观察标签区114的透明窗口，且运输容器140上的透明窗口与子容器130上的透明窗口重合设置，便于观察标签区114。
[0060]其中标签区114上有一个样品识别码，该识别码可以是由数字或字母组成的一个字符串。每一个多孔基板110上都有一个唯一的识别码，而任意两个多孔基板的识别码均不同。因此用户可以通过这个识别码来标记每一个多孔基板，从而进一步唯一地标记每一个多孔基板上的样品。
[0061]运输容器140、子容器130和/或内包装容器120具有适用于安全保险和/或识别鉴定等作用的设计特点:在不打开运输容器140、子容器130和/或内包装容器120的前提下能够快速方便地目视察看相 关的信息标签上的信息；在不打开运输容器140、子容器130和/或内包装容器120的前提下能够快速方便地目视察看在运输容器140内的多孔基板110上的样品；在不打开运输容器140、子容器130和/或内包装容器120的前提下能够快速方便地目视察看在运输容器140内的样品的相关识别信息；在不打开运输容器140、子容器130和/或内包装容器120的前提下能够快速方便地目视察看运输容器140内是否含有外源的或可疑的物体或以上各项设计的组合。在其它实施方式中，上述适用于安全保险和/或识别鉴定等作用的设计特点可以由如下方式实现的:运输容器140上有相当大的一部分是透明的部分；运输容器140内部没有内部分隔结构；运输容器140内部的结构能够使得运输容器内的所有成分都能从外部清楚地看到或其它适合的设计特点。此外，在本实施方式中，运输容器140上还可以使用能够显示出或指示出运输容器140、子容器130和/或内包装容器120是否曾经被打开过的安全封条142。
[0062]进一步，在本实施方式中，运输容器140、子容器130和/或内包装容器120的设计允许水分和空气在容器内外进行交流，也即运输容器140、子容器130、和/或内包装容器120为透气性材料制作。此外，了降低转运系统内病原体或其它有害生物成分的存活性，从而达到防止生物恐怖分子或其它破坏分子进行破坏活动的目的，运输容器140、子容器130和/或内包装容器120内还可以设置干燥剂。此外，运输容器140在达到不完全密闭，也就是允许空气和水分(湿气)在容器内外进行交流的条件下，同时能也够防止外界与多孔基板110和/或样品的直接物理接触，具体在本实施方式中，运输容器140的外层透明窗口上设有一套开口(未在图中显示)，在内层的子容器130和/或内包装容器120的透明窗口上设计有另一套开口(未在图中显示)，而两套或三套开口的位置和排布方式能够使得在正常情况下，无论内外容器以何种方式放置，开口都不会重合。
[0063]如图4所示，一实施方式的病原体检测方法，可以用于非诊断目的的环境病原体微生物检测，如大气、水源、土壤或食物中病原体微生物等，也可以为诊断提供其他样品内可能含有的病原体的信息。该检测方法使用上述转运系统100，包括如下步骤:
[0064]步骤一:将含有样品203的多孔基板110放置入运输容器140的内包装容器120内，多孔基板110在降解样品203的同时保存有样品203内的核酸分子。
[0065]样品203可以是任何含有核酸分子209的物质，例如:细胞、病原体、非病原体、病毒、细菌、微生物、人类细胞、非人类细胞或以上各项的组合。在一个实施方式中，样品203可以是来自于能够通过空气传播的病原体；来自于躯体的物质,如唾液、痰液、尿液、血液、血溃、皮肤、粪便或以上各项的组合；或者为其它物质，例如:水、食品、植物、工业原料、土壤、垃圾、物体表面样品203、病毒、细菌或以上各项的组合。核酸分子209包括:脱氧核糖核酸(DNA)、转运 RNA (tRNA)、信使 RNA (mRNA)、核糖体 RNA (rRNA)、非编码 RNA (ncRNA)、非蛋白编码 RNA (npcRNA)、非信使 RNA (nmRNA)、功能 RNA (fRNA)、小 RNA (sRNA)、小核仁 RNA(snoRNA)、微 RNA (microRNA 或 miRNA)、小干扰 RNA (siRNA)、Piwi 相互作用 RNA (piRNA)、长非编码RNA (long ncRNA)或以上各项的组合。
[0066]在进行步骤一之前，还包括将样品203转移到多孔基板上或转移至多孔基板110之内的转移样品步骤202，此步骤202可以在采集地直接采集来自某一物体表面233的样品203，例如可以在事件现场235 (例如:在坠机/撞车事故现场、在传染性疾病突发地点、在隔离区内、在偏远的医疗设施、在偏僻村庄或以上各项的组合)，来自于一个移动实验室(例如:一个仅有少数设备或几乎没有设备的实验室)，来自于一个人口稠密或人流密集地段(例如:机场、火车站、汽车站、大学或其它教育机构、办公室、城市、政府办公楼、旅游景点或以上各项的组合)或以上各项的组合。在一个实施方式中，转移样品203的步骤202可以由没有或几乎没有受过培训或专业教育的人员，根据一套指令，将样 品203固定在多孔基板之上或之内，具体在本实施方式中，可以通过如下操作步骤完成:用棉签或药签211将样品203涂抹至多孔基板110上，或将样品203滴在多孔基板110上。将样品203转移到多孔基板110之上(或之内)以后，样品203内的生物(包括其中的病原体)被杀死、灭活、降解或使其失去活性，而样品203内的核酸分子209则被保存下来。样品203内的生物(包括其中的病原体)被杀死、灭活、降解、或使其失去活性这个过程是由多孔基板内的可裂解病原体的材料完成。进一步，还可以通过向样品203采集区112的表面添加乙醇或异丙醇来保存核酸分子209。
[0067]此外，在其它实施方式中，若转运系统100不包含内包装容器120，可以直接将含有样品203的多孔基板110放置在子容器130中。
[0068]在将多孔基板110放置入运输容器140的子容器130或内包装容器120的步骤204中，可采取任何适合于保存样品203并且保证安全的措施。例如在一个实施方式中，多孔基板110是被保存在在一个非密闭的条件下(即透水透气的条件下)；有关样品203的信息的放置方式使得在不打开运输容器140的条件下能够察该信息；样品203的放置方式使得在不打开运输容器140的条件下能够察看样品203的情况或以上各项的组合。
[0069]步骤二:将运输容器140投递至检测点，从运输容器140中取出多孔基板110，并从多孔基板110中提取出样品203。
[0070]在本实施方式中，将运输容器140投递至检测点具体是通过邮政或快递服务231投递运输容器140至检测点。将运输容器140通过邮政或快递等方式进行投递的步骤206包括:指导此类运输的行为、进行此类运输的行为、监督此类运输的行为或以上各项的组合。在一个实施方式中，此类运输行为可以是:在两个地点之间(例如，超过一英里的距离)；在两个城市之间(例如，超过二十英里的距离)；在两个国家之间(例如，超过一百英里、五百英里、一千英里、或上述范围内的任意距离跨度);跨洋(例如，超过三千英里)；或者任何在一定时间范围内的合适距离(例如，在一小时内、一天内、三天内、一周内、一月内或上述范围内的任意时间跨度)。
[0071]将多孔基板110从运输容器140的子容器130中取出的步骤208是在运输容器140到达某一预定地点后才进行的，例如抵达一实验室后。取出步骤208是在合适的条件下按适当的操作步骤进行的，例如:在一个预先指定的和安全的区域内进行操作；根据在不打开运输容器140的条件下可以看到的信息进行操作；根据运输容器140抵达的时间进行操作；在操作过程中可以使用任何合适的邮件包裹自动分类处理装置或手段或以上各项的组合。
[0072]将样品203从多孔基板110上采集下来的步骤210包括将核酸分子209从多孔基板110上提取到样品溶液213中。任何合适的提取装置或手段都可以达到该目的，例如可以使用FTA提取试剂和附件(可以从位于美国威斯康辛州Waukesha的通用电气医疗公司获得);也可以使用QIAamp牌的DNA小量提取试剂盒和附件(可以从位于荷兰Venlo的凯杰公司获得)；也可以使用Agencourt牌小珠、试剂和附件(可以从位于美国马萨诸塞州Danvers的贝克曼库尔特公司获得);也可以使用Omega Bio-Tek的基因组DNA分离试剂盒和附件(可以从位于美国佐治亚州Norcross的Omega Bio-Tek公司获得)或以上各项的组合。
[0073]步骤三:以提取的样品203为基础扩增核酸分子209。
[0074]扩增来自于样品203中的核酸分子209的步骤212中，可以达到在不对样品203中的病原体进行培养的前提下增加其中核酸分子209的量的目的。核酸分子209的量1-100纳克。如果要在样品203的分析步骤214使用多种不同的分析技术，必须保证足够量的核酸分子209存在于反应体系中。在一个实施方式中，扩增步骤212是通过使用特殊引物进行定向扩增来实现的。特殊引物可以是:16S核糖体RNA的引物(如序列表中的SEQ IDN0.4-SEQ ID N0.7);已知的抗生素耐受性基因的引物；致病岛基因的引物；能够定向扩增多种广谱病原体的引物；其它合适的引物或以上各项的组合。设计与挑选合适的引物应当结合所要解决的实际问题，例如为了能够分辨不同物种或同一物种的不同菌株，引物应该在高变区之间的保守区进行挑选；而 为了能够在不同物种间检测同一致病岛标记或抗生素耐受性标记，引物应该在上述标记的保守区进行寻找。上述寻找合适引物的方法依赖于对有关区域的序列进行序列保守性调研。适用于序列保守性调研的方法包括但不仅限于:使用Smith-Waterman算法进行序列比对；使用序列相似性搜索工具例如BLAST (从位于马里兰州Bethesda的美国国家生物技术信息中心可以获得);使用K_mer索引(例如用于下一代测序序列技术的短序列mapping的算法或软件)或以各项的组合。上述引物是在特定条件下被用于序列扩增的，例如:在特定温度区间内；在特定的缓冲液组成和离子浓度区间内；根据引物设计的条件和过程、根据引物寡核苷酸的化学特性、根据反应体系的组成等确定的条件或以上各项的组合。
[0075]步骤四:分析扩增的核酸分子209，得到样品203含有的病原体的检测信息。
[0076]分析样品203中的核酸分子209的步骤214包括使用测序仪215进行测序的步骤。该测序仪215需要能够进行多重PCR和/或高通量并行测序。此类测序仪215能够使得样品203中来自于不同来源的核酸分子209被识别出来。此外，此类测序仪215还能够把样品203中来自于不同来源的核酸分子209 —一分别测序出来。因不需要进行病原体培养，分析步骤214能够在较短的时间内完成，例如:在8小时内、在两小时内、在一小时内、或在以上范围内的任意时间段内。[0077]在一个实施方式中，测序过程使用的测序仪215是一类高通量DNA测序仪，例如来自于加利福尼亚州San Diego的Illumina公司的MiSeq系统或来自于康涅狄格州Guilford的Life Technologies公司的1n Torrent系统等。该类测序仪能够通过并行测序的方法产生出数百万条来自于样品203的核酸分子209测序序列，从而使得在同一个测试过程中检测出所有已知的病原体成为可能。
[0078]在一个实施方式中，分析样品203中的核酸分子209步骤214包括将每一个核酸分子209的化学分子序列217转化为数字化序列219，最后转化为以字符为代表的核酸序列221。核酸序列221能够以数字化序列的形式来储存。每一个核酸分子209序列也可以被称为一个序列。所得的所有序列统称为序列数据223。在一个实施方式中，测序仪产生出的序列数据223可包括一百万个以上的来自于样品203的序列。
[0079]在一个实施方式中，将序列数据223与参考数据库225进行比对的步骤218中，参考数据库225包含有所有已知核酸分子209序列的序列信息，以及每个序列所对应的物种、致病性、其它有用信息或以上各项的组合。如果序列数据223中的某一条序列与数据库225中的某一参照序列经比对后发现达到一定的序列一致性的阈值，则该数据序列223则可以被归类为来自于某一已知来源。如果序列数据223中有N条序列被归类为来源于某一已知来源，则该来源在该样品203中的相对浓度即为N/T，其中T为来自于样品203的序列数据223所包含的所有序列的总数。数据库225可以通过自动的方式或定期的方式(例如每日、每周、每月、每季度、或每年)进行更新。在一个实施方式中，参照数据库225每次更新以后，序列数据223就会自动被重新分析一次，直到来自于样品203的数据不再有被重新分析的意义为止。这个重新分析数据的过程不依赖于样品203的存在或完好与否。来自于样品203的数据有意义的期限可以是一个星期、一个月、三个月、一年、或其它适合的时间段。
[0080]如果序列数据223中 的某一条序列与参考数据库225中的任何一条参考序列都不一致，那么该序列即被归类为一来自于不明来源的序列。样品203中的来自于不明来源的序列仍然有鉴定和/或调查的意义，例如如果在多名有相同症状的病人中同时发现有同一不明来源的序列而在其它病人或健康人员中没有该不明来源的序列，那么这个不明来源的序列极有可能是来自于一个新的以前未知的病原体，而该病原体即为导致这些症状的原因。这些不明来源的序列信息可能对分析有相似性状的不同样品203的之间的相关性有帮助作用。此外，当参考数据库更新后，一些在更新前不存在的参考数据信息可能在更新后出现，从而可以对这些不明来的源数据进行重新分析，从而获得这些不明来源序列的真正来源及其相关信息。
[0081]进一步，请参阅图5，在一个实施方式中，分析步骤214按照判断方法300来鉴定核酸分子209序列是否是来源于某一病原体的，具体该判断方法300包括如下步骤:
[0082]步骤302:产生一数字序列；
[0083]步骤304:将该数字序列与数据库225中的已知核酸序列相比较；
[0084]步骤306:比较之后确定在数据库225中是否存在某一已知序列与该数字序列有显著的和唯一的一致性；
[0085]步骤308:如果数据库225中不存在任何已知序列与该数字序列相一致，那么该数字序列则被定义为来自于未知来源；
[0086]步骤310:如果存在与该数字序列相一致的已知序列，且他们的一致性显著，那么根据该已知序列在信息源301中的其它信息来确定该数字序列来源的信息，例如物种信息、致病性信息、其它有用信息或以上各项的组合；
[0087]步骤312:系统进一步确定该数字序列是否是来源于某一已知病原体的；
[0088]步骤314:如果信息源提供的信息证明该数字序列是来源于非病原体的，那么该数字序列则被归类为非病原体来源；
[0089]步骤316:如果信息源提供的信息证明该数字序列是来源于病原体的，那么系统将进一步提取出关于该病原体的详细信息，例如致病机理、临床症状、治疗药物、治疗方案、其它有用信息或以上各项的组合；
[0090]步骤318:将该数字序列归类为病原体。
[0091]请进一步参阅图1-3，在一个实施方式中，分析结果可以通过任何合适的方式显示给用户的步骤220中，例如可以通过一台计算机、手持电脑、移动电话、任何能够进行通讯的设备229 (例如能够通过互联网、蜂窝移动通讯网络、卫星等进行通讯的设备)或以上各项的组合的方式显示。在进一步的实施方式中，进一步包括显示设备设备在任何地点发送和接受信息的步骤222，例如通过访问某一网页或网络应用程序。结果227能够通过任何合适的介质进行显示。结果227包括如下相关信息，例如样品203分析结果的描述、样品203的卫生健康危害性、处理样品203的手段步骤、样品203中各个成分的浓度、其它有关信息、或以上各项的组合。 [0092]用户在获得一个多孔基板110后，可以通过网上系统(未在图中显示)将多孔基板的识别码与某一个特定的分析服务相链接，从而实际上达到将某一个采集的样品(采集在这个多孔基板上)与该分析服务相链接的目的。在检测点，工作人员可以通过收到的多孔基板上的识别码，在网上系统中查找到与其相链接的分析服务，从而进行分析。在分析完毕后，检测点的工作人员可以将数字化的分析结果与该识别码相链接，而用户可以立刻在网上系统中察看到与该识别码相链接的分析结果。在整个过程中，用户不需要提供关于样品的任何细节，例如样品来源和采样地点等等。这样可以很好地达到保护用户隐私的目的，并且使得样品与分析过程和样品与结果一一对应，减少人为失误，并且加快用户获得结果的速度。
[0093]上述用于病原体检测的转运系统和检测方法可以广谱快速地检测病原体、可以在事先没有预测出某一特定病原体的情况下进行病原体检测、可以在一次测试中检测出所有具有已知核酸分子209序列的病原体、可以使用未受到专业培训或教育的人员进行样品203采集、降低可能来自于样品203的危险性(例如，将样品203灭活)、降低污染样品203的可能性、比在现场当场分析的方法或依赖于活体样品203分析的方法有更低的成本、更有效地应对传染病暴发。
[0094]另外，检测出的病原体可以来源于水源、土壤、食物或空气等环境，获得的检测结果可以作为这些环境中含有的病原体微生物的判断标准，其结果并不是直接获得与疾病有关系的诊断结果，因为疾病的发病机制与众多因素有关，需要综合考虑人体及环境等各方面条件，但这些结果可以作为这些环境中人体患病诊断的中间结果应用，此方法可以广泛推广应用。
[0095]通过上述检测方法，可以较为方便地同时检测出多种病原体，并且不需要用户提前预测样品内可能存在的病原体。同时使用该方法不需要对样品进行实验室内培养，从而缩短了检测时间。在检测完毕后，检测结果可以通过网络或其他通讯方式进行直接传送，进一步缩短了用户等待结果的时间。本实施方式的整个病原体检测过程以及转运系统可以在较短时间内，更加安全地检测出样品内的所有病原菌，并且具有预测非依赖性和活体病原体非依赖性。
[0096]以下为对比例和实施例部分:
[0097]对比例I
[0098]如图6所示，对比例I显示的是检测到的通过直接扩增发酵产物中的细菌16S核糖体RNA的V3区(338位至514位)而得到的DNA，此类DNA的一个代表为大肠杆菌K12菌株DHlOB亚株的16S核糖体RNA基因(如序列表中的SEQ ID N0.1),其V3区的序列如序列表中的SEQ ID N0.2。图6中分析结果显示有三个主峰和多个小峰，其中从左向右数第二个主峰为扩增获得的混合DNA峰。
[0099]实施例1
[0100]如图7所示，实施例1显示的是检测到的通过扩增采集到FTA卡上的发酵产物中的细菌16S核糖体RNA的V3区(338位至514位)而得到的DNA，此类DNA的一个代表为大肠杆菌K12菌株DHlOB亚株的16S核糖体RNA基因(如序列表中的SEQ ID N0.1)，其V3区的序列如序列表中的SEQ ID N0.2。图7中分析结果显示有三个主峰和多个小峰，其中从左向右数第二个主峰为扩增获 得的混合DNA峰，结果中的峰值与对比例I中的结果类似，强度稍有不同，说明可以使用FTA类似的手段进行采样。
[0101]对比例2
[0102]如图8所示，对比例2显示的是检测到的通过直接扩增发酵产物中的细菌16S核糖体RNA的V6区(781位至1082位，也包括V5和V7区)而得到的DNA，此类DNA的一个代表为大肠杆菌K12菌株DHlOB亚株的16S核糖体RNA基因(如序列表中的SEQ ID N0.1)，其V6区的序列如序列表中的SEQ ID N0.3。图8中分析结果显示有三个主峰和多个小峰，其中从左向右数第二个主峰为扩增获得的混合DNA峰。
[0103]实施例2
[0104]如图9所示，实施例2显示的是检测到的通过扩增采集到FTA卡上的发酵产物中的细菌16S核糖体RNA的V6区(781位至1082位，也包括V5和V7区)而得到的DNA，此类DNA的一个代表为大肠杆菌K12菌株DHlOB亚株的16S核糖体RNA基因(如序列表中的SEQID N0.1)，其V6区的序列如序列表中的SEQ ID N0.3。图9中分析结果显示有三个主峰和多个小峰，其中从左向右数第二个主峰为扩增获得的混合DNA峰，结果中的峰值与对比例2中的结果类似，强度稍有不同，说明可以使用FTA类似的手段进行采样。
[0105]对比例3
[0106]如图10所示，对比例3显示的是检测到的通过直接扩增人类唾液样品203中的细菌16S核糖体RNA的V3区(338位至514位)而得到的DNA，此类DNA的一个代表为大肠杆菌K12菌株DHlOB亚株的16S核糖体RNA基因(如序列表中的SEQ ID N0.1)，其V3区的序列如序列表中的SEQ ID N0.2。图10中分析结果显示有三个主峰和多个小峰，其中从左向右数第二个主峰为扩增获得的混合DNA峰。
[0107]实施例3
[0108]如图11所示，实施例3显示的是检测到的通过扩增采集到FTA卡上的人类唾液样品203中的细菌16S核糖体RNA的V3区(338位至514位)而得到的DNA，此类DNA的一个代表为大肠杆菌K12菌株DHlOB亚株的16S核糖体RNA基因(如序列表中的SEQ ID N0.1),其V3区的序列如序列表中的SEQ ID N0.2。图11中分析结果显示有三个主峰和多个小峰，其中从左向右数第二个主峰为扩增获得的混合DNA峰，结果中的峰值与对比例3中的结果类似，强度稍有不同，说明可以使用FTA类似的手段进行采样。
[0109]对比例4
[0110]如图12所示，对比例4显示的是检测到的通过直接扩增人类唾液样品203中的细菌16S核糖体RNA的V6区(781位至1082位，也包括V5和V7区)而得到的DNA，此类DNA的一个代表为大肠杆菌K12菌株DHlOB亚株的16S核糖体RNA基因(如序列表中的SEQ IDN0.1)，其V6区的序列如序列表中的SEQ ID N0.3。图12中分析结果显示有三个主峰和多个小峰，其中从左向右数第二个主峰为扩增获得的混合DNA峰。
[0111]实施例4
[0112]如图13所示，实施例4显示的是检测到的通过扩增采集到FTA卡上的人类唾液样品203中的细菌16S核糖体RNA的V6区(781位至1082位，也包括V5和V7区)而得到的DNA,此类DNA的一个代表为大肠杆菌K12菌株DHlOB亚株的16S核糖体RNA基因(如序列表中的SEQ ID N0.1)，其V6区的序列如序列表中的SEQ ID N0.3。图13中分析结果显示有三个主峰和多个小峰，其中从左向右数第二个主峰为扩增获得的混合DNA峰，结果中的峰值与对比例4中的结果类似，强度稍有不同，说明可以使用FTA类似的手段进行采样。
[0113]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明 专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1.一种用于病原体检测的转运系统，其特征在于，包括多孔基板、子容器及运输容器；所述多孔基板上设有样品采集区及标签区且所述样品采集区含有可裂解病原体并保存所述病原体的核酸分子的材料；所述子容器可容置所述多孔基板，所述运输容器可容置所述子容器，所述子容器及所述运输容器上均设有用于直接目视查看所述标签区以及所述运输容器和所述子容器内的内容物的透明窗口。
2.如权利要求1所述的用于病原体检测的转运系统，其特征在于，所述多孔基板的材料为纤维素类材料、玻璃纤维、微纤维、纳米纤维及布料中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的用于病原体检测转运系统，其特征在于，所述多孔基板为FTA 卡。
4.如权利要求1所述的用于病原体检测的转运系统，其特征在于，所述子容器为信封、套或夹。
5.如权利要求1或4所述的用于病原体检测的转运系统，其特征在于，还包括可容置在所述子容器的内包装容器，所述内包装容器为信封、套或夹。
6.如权利要求5所述的用于病原体检测的转运系统，其特征在于，所述子容器、所述运输容器及所述内包装容器可透气。
7.如权利要求6所述的用于病原体检测转运系统，其特征在于，所述内包装容器、所述子容器及所述运输容器上设有开·口，且所述内包装容器上的开口、所述子容器上的开口及所述运输容器上的开口错开设置。
8.如权利要求1所述的用于病原体检测的转运系统，其特征在于，还包括用于封装所述运输容器的安全封条。
9.如权利要求1所述的用于病原体检测的转运系统，其特征在于，还包括设在所述运输容器内的干燥剂。
10.一种病原体检测方法，其特征在于，该检测方法使用如权利要求1-9中任一项所述的转运系统，所述检测方法包括如下步骤: 将含有样品的多孔基板放置入运输容器的子容器内，所述多孔基板在降解所述样品的同时保存有所述样品内的核酸分子； 将所述运输容器投递至检测点，从所述运输容器中取出所述多孔基板，并从所述多孔基板中提取出所述样品； 以提取的所述样品为基础扩增核酸分子； 分析扩增的所述核酸分子，得到所述样品含有的病原体的检测信息。
11.如权利要求10所述的病原体检测方法，其特征在于，所述分析扩增的所述核酸分子包括如下步骤: 在检测点使用高通量并行测序的方法分析所扩增的核酸分子，所述高通量并行测序的方法同时测得样品内所有核酸分子的序列，该序列数据以数字信息的方式进行存储； 通过序列比对和使用参考数据库，识别出高通量并行测序所产生的序列，判断出样品中核酸分子的来源。
【文档编号】C12M1/00GK103436429SQ201310307267
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2012年10月15日
【发明者】孙亚洲, 张烨婷 申请人:孙亚洲, 张烨婷