专利名称：一种多种性传播病原体同步检测的pcr方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速检测五种性传播疾病病原体的PCR方法及试剂盒，适用于性 传播疾病的快速临床诊断和流行病学调查。
背景技术：
性传播疾病(Sexually Transmitted disease，STD)是目前的常见病多发病。传统 的性传播疾病检测方法主要包括病原体的分离和生物学试验、电镜技术、免疫荧光技术、 荧光定量PCR技术等，这些方法在疾病诊断中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，诸 如周期长，操作繁琐，每次只能检测出一种或两种病原体。目前，多重混合性传播疾病感染 率明显上升(申建维，孙秀琴，程冬娥.女性生殖道性传播疾病病原体混合感染调查.中华 医院感染学杂志[j]，2007，(05).)，应用较广泛的荧光定量PCR技术一次只能检测出一种 病原体，如果有一份标本，要检测是否含有上述病原体的一种或多种，则需要分别进行多次 PCR反应，检测成本高，给性传播疾病的检测和诊断带来困难，实验诊断技术已经明显滞后。目前，正在发展的单管多重PCR技术，即在一个反应管中、在同一反应条件下对两 个或两个以上的不同靶基因进行同步扩增，这样能大大提高PCR的效率。我们利用单管多重PCR技术，摸索其PCR反应及抗污染的最佳条件，成功地用同一 份处理标本和一次PCR扩增同时检测U. urealyticum(解脲支原体，UU)、M. homins (人型支 原体，MH)、M. genitalium(生殖支原体，MG)、Chlamydia trachomatis (沙眼衣原体，CT)和 Neisseria gonorrhoeae (淋病奈瑟菌，NG)五种STD病原体，通过盲法分析评价认为这是一 种高效率高特异的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供了一种多种性传播病原体同步检测的方法，该方法通过设计 专用扩增引物，给出五种病原体的同步检测的多重PCR条件，该方法易行，能快速、简便地 同步检测标本中五种病原体。为达到上述目的，本发明采用以下技术措施设计合适的引物，使引物之间不发生 干扰，并具有相似的扩增条件。其步骤是A.设计一套用于同步扩增五种病原体UU、MH、MG、CT, NG的引物，各引物针对相应 病原体高度保守基因，不同引物的退火温度近似，引物两两之间无三碱基以上之互补，PCR 产物两两长度之差大于40-50bp，以利于琼脂糖凝胶分离，五种病原体NG、UU、CT、MG和MH 的引物序列见表1:表1 五种病原体NG、UU、CT、MG和MH的引物序列
权利要求
一种多种性传播疾病病原体同步检测的PCR方法及试剂盒，该方法包括以下试剂及步骤A.设计用于同步扩增五种病原体NG、UU、CT、MG和MH的引物，各引物为针对相应病原体的高度保守基因，引物的退火温度为56℃～64℃，引物两两之间无三碱基以上之互补，PCR扩增产物两两长度之差大于40～50bp；B.五种病原体NG、UU、CT、MG和MH的引物序列为C.五种病原体NG、UU、CT、MG和MH基因同步检测的PCR，反应体积25ul，Taq酶1.0U，缓冲液lx GC，Mg2+3.0mmol/L，dNTPs400umol/L，引物微摩尔浓度(umol/L)组合为 NG MH MG CT UU NP1/NP2 MHP1/MHP2 MP1/MP2 CP1/CP2 UP1/UP2 0.5 0.4 0.4 0.4 1.5 反应在热循环仪上进行，热循环参数为94℃预变性3min，然后94℃1min、60℃1min、72℃2min 35个循环，最后72℃延伸5minD.扩增后，取10μl PCR产物和0.8μl Generuler(深圳晶美)在1×TEB缓冲液、5 6V/cm条件下跑2％琼脂糖凝胶电泳40min，EB染色后于UVP凝胶成像仪(UVP Inc，美国)下观察结果。 dest_path_FA20177452200910003800801C00011.tif
全文摘要
本发明公开了一种同步快速检测五种性传播疾病病原体(淋球菌(NG)、人型支原体(MH)、生殖支原体(MG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU))的单管多重PCR的方法及试剂盒，其特点是通过合理设计引物，优化引物浓度组合及PCR条件，在同一个反应管中和同一个热循环条件下，对五种病原体同时进行扩增，并通过凝胶电泳分离和检侧。该发明除具有经典PCR的灵敏度、快速、简便等特点以外，主要是实现了五种病原体的同步检测，成本更低，能用于开发相关试剂盒，用于临床诊断和流行病学调查和控制。
文档编号C12Q1/04GK101935686SQ200910003800
公开日2011年1月5日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者刘伟, 周玉球, 唐文志, 张永良, 戴小波, 蔡桂丰, 谭星蓉 申请人:唐文志