专利名称：一种检测蚊传病原体的多重pcr试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及蚊媒病原体(乙型脑炎病毒、登革热病毒、疟 原虫、丝虫)的基因检测，特别是一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒及检测方法。
背景技术：
在我国流行或曾经流行的蚊媒病有疟疾、丝虫病、乙型脑炎、登革热等。检测蚊媒 携带病原体是早期发现流行、预防蚊媒病的有效措施之一。蚊虫是疟疾、丝虫病、乙型脑炎、登革热等多种传染病的传播媒介。蚊媒病的监测， 以往的研究多是针对单种病原体检测，对于蚊媒病的防治应当综合考虑。从蚊媒方面来监 测病原体，属于早期监测和发现传染病的方法，半巢式多重PCR检测蚊媒病原体方法将为 蚊媒病防治提供一种早期的综合高效的监测方法，对蚊媒病的有效预警和控制有较大价值。目前，世界上仍有100多个国家为疟疾流行区，约22亿人受疟疾的威胁，每年有 300 500万疟疾临床病例，死亡人数为110 270万。疟疾也是严重危害我国人民身体健 康，影响社会经济发展的重大寄生虫病。经过多年坚持不懈的积极防治，我国在控制疟疾流 行、减少危害程度方面取得了显著成效。由于我国疟疾疫区各类流行因素尚未根本改变，流 动人口剧增导致传染源扩散与积累，气候变暖、生态环境变化造成媒介按蚊密度增加，恶性 疟原虫和媒介按蚊对防治药物抗性的产生和扩散，这些问题严重影响了我国疟疾防治工作 的进程，近年来疟疾发病数呈不稳定状态。国家卫生部已经制定了消除疟疾的计划，为保证 该计划的实施，应当有计划、连续、系统地开展疟疾疫情、监测，掌握疟疾流行规律和趋势， 为评价防治效果和制订疟疾防治对策提供科学依据。有效的蚊媒检测是加强我国预防控制 疟疾的重要技术保障，是有效开展预防和控制疟疾工作的重要内容。淋巴丝虫病是严重危害人民健康的寄生虫病之一，在我国流行的丝虫病有班氏丝 虫病和马来丝虫病两种，分别由班氏吴策线虫和马来布鲁线虫引起。曾经在15个省(市、 区)流行，受威胁人口达3. 3亿。经过40年的防治，实现了全国基本消灭丝虫病。现有报 告，在经济、卫生条件较差的边远贫困地区，以及防治、监测工作中存在薄弱环节的地区，与 邻国丝虫病流行区接壤地带，外来流动人口聚集地区，即使只存在个别的高密度微丝蚴血 症者就可在当地引起丝虫新感染。灭病务尽，防止丝虫病在我国死灰复燃，消灭丝虫病地区 仍需继续开展监测工作。对于黄病毒属病毒，以乙脑、登革热为例。乙脑是由乙脑病毒引起，由蚊虫传播的 急性传染病。乙脑致死率和致残率高，是威胁人群特别是儿童健康的主要传染病之一。夏秋 季为发病高峰季节，流行地区分布与媒介蚊虫分布密切相关，我国曾是乙脑高度流行区，在 20世纪60年代和70年代初期全国曾发生大流行，70年代以后随着大范围接种乙脑疫苗， 乙脑发病率明显下降，近年来维持在较低的发病水平，全国乙脑报告病例数每年在5000 10000例之间，但由于疫苗接种的盲区或其他原因，局部地区时有暴发流行。登革病毒有1 4型，经埃及伊蚊和白纹伊蚊传播。按照《中华人民共和国传染病防治法》的规定为乙类传染病。是热带、亚热带地区的一个非常重要的公共卫生问题。目 前，世界上约有25亿人受到登革病毒感染的威胁，每年发生登革病毒感染患者超过1亿人， 并且有50万人发展成为登革出血热或登革休克综合征，造成大约25000人死亡。我国20 世纪90年代以来，本病主要在广东、福建流行，多为小规模流行或散发。1999年和2004年 因输入性病例导致福建和浙江等地发生暴发流行，其它省区近年来也常有输入性病例的发 生。由于登革病毒传播迅猛、发病率高，特别是近些年由于人员流动频繁和国际旅游的迅 猛发展，使登革病毒的流行范围及其传播媒介埃及伊蚊和白纹伊蚊的分布范围也在相应扩 大。登革病毒在一个地区往往存在不同血清型病毒的交替流行，这更增加了登革出血热和 登革休克综合征发生的威胁。登革出血热和登革休克综合征的病死率较高，不仅严重影响 人民的身体健康，而且严重影响当地经济、贸易和旅游事业的发展。实施流行性乙型脑炎和 登革热的蚊媒监测，有助于提前发现疫情，科学地预测、预警，及时采取有效防治措施，降低 发病率。从蚊媒方面来监测疟原虫丝虫黄病毒属病毒感染，在传染病监测中属于早期监测 和发现传染病流行的方法，蚊媒检测对于蚊媒病的有效预警和控制有重要的意义。以往的 研究都是针对一种病原体检测，对于蚊媒病的防治应当综合考虑。简便准确的检测方法是发现蚊传病原体的重要技术保障，掌握其流行规律和趋势 为评价防治效果和制订防治对策提供科学依据(Nuchprayoon et al.，2003)。还可用于蚊 传疾病的临床检测。监测蚊虫感染情况，对疟疾和丝虫病控制具有重要影响(Gage et al., 2008)。诊断丝虫病和疟疾，传统方法是显微镜镜检，虽然此方法方便，费用低廉并且相对准 确，但是往往需要技术熟练和费时的劳动，而且不足以检测疟原虫低密度血样。为解决这些 不足，发展了免疫学方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫吸附层析(ICT)，用来精确 评估血样和蚊虫群体病原体携带情况[Nuchprayoon et al. ,2003, Wirtz et al.，1985]。 以后又发展了更简单，更敏感的诊断方法，即基于更先进的免疫免疫吸附层析(ICT)和聚 合酶链反应(PCR)技术。如高度敏感的种属特异性免疫吸附层析(ICT)能够快速检测血检 阴性血样中的班氏丝虫(Weil et al. ,1997)；类似的技术已经开发用于检测人体内疟原虫 和岐体内子孢子(Bangs et al. ,2002, Wirtz et al.，1985，Wongsrichanalai，2001)。使用敏感特异的检测技术如PCR可以获得准确的疾病流行状况。检测蚊虫体内疟 原虫、丝虫DNA可以间接反映人群的感染情况(Bockarie et al.，2000，Chanteau et al.， 1994, Goodman et al. , 2003, Ramzy et al. , 1997, Rao et al. , 2006, Rougemont et al., 2004,Vasuki et al.，2008，Chansiri and Phantana，2002，Farid et al. ,2001, Williams et al.，2002)。用RFLP-PCR方法以班氏丝虫SspI 188bp重复DNA序列为靶基因，能检测0. Ipg 的班氏丝虫基因组 DNA (Chansiri and Phantana, 2002, Farid et al.，2001，Williams et al. ,2002) ο 以丝虫转录间隔 1 区(internal transcribed spacerl，ITS-1)序列为靶基因 RFLP-PCR可以检测多种丝虫(Nuchprayoon et al. ,2005) 使用多重PCR法检测蚊虫和血 样中班氏丝虫和马来丝虫(Chansiri etal.，2001，Mishra et al.，2005，Mishra et al.， 2007)。巢式PCR敏感度高，与传统PCR相比它能检测到更微量的丝虫，但目前使用巢式PCR 检测丝虫鲜有报道。随着班氏丝虫和马来丝虫ITS-I基因序列的发表，可以在这个高度重 复序列上设计引物，建立基于PCR原理的各种新的检测方法。
在疟原虫检测方面，免疫层析试验已作为诊断疟疾的选择，但是其灵敏度不足而 不能用于常规诊断(Humar et al.，1997，Tham et al.，1999)。DNA探针相比镜检灵敏度 有所提高(Waters and McCutchan，1989)，但是这种方法不适于大量样本的筛选。PCR检测 多以小核糖体亚基 DNA (SSU rDNA)为靶基因(Li et al.，1995 ；Schindler et al.，2001 ； Snounou et al.，1993)。由于疟原虫SSU rDNA基因拷贝数较少，每个基因组4_8拷贝(Goman et al.，1991)，巢式 PCR 被用来检测微量原虫(Rubio et al. , 1999 ；Schindler et al.， 2001 ；Snounou et al.，1993 ；Zalis et al.，1996)。巢式PCR 比传统PCR特异性和灵敏度更 高，但巢式PCR是两次PCR，步骤较为繁琐(Picken et al. , 1996)；单管半巢式PCR(Single tube hemi-nested PCR, STHN PCR)步骤简单，但敏感度不及两步巢式 PCR (Montenegro et al.，2004)。real-time PCR以18S rDNA为靶基因检测人血样中4种疟原虫，灵敏度高特异 性强，但real-time PCR成本较高，不适合大量样本的筛选(Rougemont et al. ,2004) 虽然有许多关于检测蚊媒黄病毒属特定种或属的分子诊断(Chow et al. ,1993, Fulop et al. ,1993,Tanaka,1993,Chang et al. ,1994,Puri et al. ,1994,Pierre et al., 1994，Meiyu et al.，1997，Kuno, 1998)，但迄今为止仅 Scaramozzino 和 Lanciotti 报道的 属特异性半巢式PCR具有较高敏感性。Pyke (2004)用TaqMan RT-PCR检测了澳大利亚脑炎 病毒，1(01^(2006)用139]\&111仪31-^1116 one-step RT-PCR定量检测了登革病毒，Dyer(2007) 用同样方法建立了检测节肢动物传播的黄病毒属的方法，国内周晓俊等.(2008)建立了 SYBR Green I Real-time PCR检测黄病毒属的方法，该技术不仅实现了 PCR从定性别定量 的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等 特点，但缺点则是机器及反应耗材费用相对较高，造成目前在使用上无法达到普及。总之， 国内外对于蚊传病原体的检测大多灵敏度不高，成本较高，且不能同时检测蚊虫携带的多 种病原体。本发明也可用于西尼罗病毒、黄热病毒的初步鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒及检测方法，所述 的这种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒及检测方法要解决现有技术中的检测蚊传病原 体的方法灵敏度不高、成本较高、且不能同时检测蚊虫携带的多种病原体的技术问题。本发明一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，含有如下引物1)检测黄病毒属病毒第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)检测黄病毒属病毒第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)检测疟原虫第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物的序列如SEQ IDNO 6所示；4)检测疟原虫第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，
下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)检测马来丝虫第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)检测马来丝虫第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 13所示。进一步的，所述的黄病毒属病毒包括乙型脑炎病毒、或者登革热病毒1型、或者登 革热病毒2型、或者登革热病毒3型、或者登革热病毒4型、西尼罗病毒和黄热病毒。进一步的，所述的疟原虫属包括恶性疟原虫、或者间日疟原虫、或者诺氏疟原虫、 或者卵形疟原虫、或者三日疟原虫。进一步的，所述的试剂盒中还含有聚合酶链式反应试剂。进一步的，所述的试剂盒中还含有阴性质控标准品。进一步的，所述的试剂盒中还含有阳性标准品。进一步的，所述的阴性质控标准品为灭菌ddH20。进一步的，所述的阳性标准品为乙型脑炎cDNA、或者登革热病毒cDNA、或者间日 疟原虫DNA、或者恶性疟原虫DNA。进一步的，所述的聚合酶链式反应试剂中各组份为1) 10倍聚合酶链式反应缓沖液；2)四种脱氧核糖核苷酸，四种脱氧核糖核苷酸的浓度均为25mM ；3)小牛血清蛋白BSA，小牛血清蛋白BSA的浓度为5mg/ml ；4) EXTaq 酶，EXTaq 酶的浓度为 5U/ μ L ；5)灭菌双蒸水。进一步的，所述的10倍聚合酶链式反应缓沖液的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。进一步的，所述的试剂盒中的所有的引物的浓度均为ΙΟμΜ。本发明还提供了一种检测蚊传病原体的方法，包括一个提取蚊虫核酸的步骤，还 包括一个将提取的核酸在PCR扩增仪上进行扩增的步骤，还包括一个将扩增的产物进行电 泳检测的步骤，还包括确定蚊传病原体具体种类的测序步骤。进一步的，在一个将提取的核酸在PCR扩增仪上进行扩增的步骤中，1)检测黄病毒属病毒第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)检测黄病毒属病毒第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)检测疟原虫第一轮PCR的引物
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上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；4)检测疟原虫第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)检测马来丝虫第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)检测马来丝虫第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，下游引物的序列如SEQ IDNO 13所示。本发明还提供了上述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒在检测乙型脑炎 病毒、或者登革热病毒1型、或者登革热病毒2型、或者登革热病毒3型、或者登革热病毒 4型、或者西尼罗病毒和黄热病毒/恶性疟原虫、或者间日疟原虫、或者诺氏疟原虫、或者卵 形疟原虫、或者三日疟原虫/马来丝虫、或班氏丝虫中的应用。本发明和已有技术相比较，其效果是积极和明显的。本发明建立了一种对上述蚊 媒病原体的快速有效分子鉴定方法，为蚊媒病的早期有效预警提供可靠的信息资料。本发 明建立了半巢式多重PCR检测蚊传病原体(疟原虫、丝虫、黄病毒)的方法，将为我国蚊媒 病防治工作提供一种低廉高效的早期监测和发现传染病流行的方法。半巢式多重PCR检测 蚊媒病原体方法将为我国蚊媒病防治提供一种早期的综合高效的监测方法，对蚊媒病的有 效预警和控制有较大价值。本发明可以应用于多种样品的检测，如蚊虫、病人血液、组织液等。使用本发明 的试剂盒可快速、灵敏、同时检测蚊虫携带的多种病原体包括乙型脑炎病毒、登革热病毒 1-4型、黄热病毒、恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、马来丝 虫等多种病原体。从而为我国蚊媒病防治工作提供一种低廉高效的早期监测和发现蚊媒病 流行的方法，对预防蚊媒病提供有效预警资料。
图1是采用本发明的试剂盒检测蚊传疟原虫(恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原 虫、卵形疟原虫、三日疟原虫和马来丝虫)的结果图；M :DNA分子标准Marker I ；K 阴性对照(ddH20PCR产物)；1 蚊虫内马来丝虫与约 氏疟原虫DNA模板PCR产物；2 海南病人血样恶性疟原虫DNA模板PCR产物；3 淮北病人 滤纸血迹疟原虫DNA模板PCR产物；4 淮北病人滤纸血迹疟原虫DNA模板PCR产物；5 马 来丝虫DNA模板PCR产物；6 马来丝虫DNA模板PCR产物(当第一轮PCR循环次数过多，在 第二轮PCR产物中会出现第一轮PCR的条带431bp)。图2是采用本发明的试剂盒检测黄病毒属病毒(乙型脑炎病毒、登革热病毒1-4 型、黄热病毒)；M =DNA分子标准Marker I ；K 阴性对照(ddH20PCR产物)；1 乙型脑炎病毒cDNA 模板PCR产物(当第一轮PCR循环次数过多，在第二轮PCR产物中会出现第一轮PCR的条
8带260bp) ；2 乙型脑炎病毒cDNA模板PCR产物；3 乙型脑炎病毒cDNA模板PCR产物；4 乙型脑炎病毒cDNA模板PCR产物；5 登革热I型病毒cDNA模板PCR产物；6 登革热II型 病毒cDNA模板PCR产物；7 登革热III型病毒cDNA模板PCR产物；8 登革热IV型病毒cDNA 模板PCR产物。
具体实施例方式下面实施例进一步对本发明进行说明。下面实施例中采用的样本、动物及试剂如下感染马来丝虫的蚊虫样品来自中国疾控中心寄生虫研究所，蚊虫黄病毒属病毒培 养液来自第二军医大学流行病教研室，斯氏按蚊第二军医大学原生物教研室饲养，恶性疟 原虫样本为本教研室采自云南和海南的疟原虫培养品，间日疟原虫样本为本教研室采自淮 北间日疟病人滤纸血样，约氏疟原虫为第二军医大学原生物教研室液氮保存的约氏疟原虫 样品，小鼠由第二军医大学实验动物中心提供的昆明小白鼠。分子生物学试剂组织DNA提取试剂盒、DNA分子标准Marker I (北京天根)，脱 氧核苷三磷酸(dNTP)、ExTaq DNA 聚合酶、Loading buffer (TaKaRa), Quant cDNA 第一链合 成试剂盒(QIAGEN)，琼脂糖(西班牙)，小牛血消蛋白BSA、核酸染料GoodView(北京索莱 宝)，双蒸水(上海生工)，引物由上海生工合成。聚合酶链式反应(50 μ L体系)试剂含有10倍聚合酶链式反应缓冲液(含 MgCl2)、特异引物均为10 μ M、dNTP (2. 5mM each)、小牛血清蛋白BSA(5mg/ml)和灭茵双蒸 水，EXTaq 酶。10倍PCR Buffer的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。实施例1本发明一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，含有如下引物1)检测黄病毒属病毒第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)检测黄病毒属病毒第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)检测疟原虫第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；4)检测疟原虫第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)检测马来丝虫第一轮PCR的引物
上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)检测马来丝虫第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 13所示。进一步的，所述的黄病毒属病毒包括乙型脑炎病毒、或者登革热病毒1型、或者登 革热病毒2型、或者登革热病毒3型、或者登革热病毒4型、西尼罗病毒和黄热病毒。进一步的，所述的疟原虫属包括恶性疟原虫、或者间日疟原虫、或者诺氏疟原虫、 或者卵形疟原虫、或者三日疟原虫。进一步的，所述的试剂盒中还含有聚合酶链式反应试剂。进一步的，所述的试剂盒中还含有阴性质控标准品。进一步的，所述的试剂盒中还含有阳性标准品。进一步的，所述的阴性质控标准品为灭菌ddH20。进一步的，所述的阳性标准品为乙型脑炎cDNA、或者登革热病毒cDNA、或者间日 疟原虫DNA、或者恶性疟原虫DNA。进一步的，所述的聚合酶链式反应试剂中各组份为1) 10倍聚合酶链式反应缓沖液；2)四种脱氧核糖核苷酸，四种脱氧核糖核苷酸的浓度均为2. 5mM ；3)小牛血清蛋白BSA，小牛血清蛋白BSA的浓度为5mg/ml ；4) EXTaq 酶，EXTaq 酶的浓度为 5U/μ L ；5)灭菌双蒸水。进一步的，所述的10倍聚合酶链式反应缓沖液的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。进一步的，所述的试剂盒中的所有的引物的浓度均为ΙΟμΜ。实施例2本发明还提供了一种检测蚊传病原体的方法，包括一个提取蚊虫核酸的步骤，还 包括一个将提取的核酸在PCR扩增仪上进行扩增的步骤，还包括一个将扩增的产物进行电 泳检测的步骤，还包括确定蚊传病原体具体种类的测序步骤。进一步的，在一个将提取的核酸在PCR扩增仪上进行扩增的步骤中，1)检测黄病毒属病毒第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)检测黄病毒属病毒第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)检测疟原虫第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 5所示，0137]下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；
0138]4)检测疟原虫第二轮PCR的引物
0139]上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示，
0140]下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；
0141]5)检测马来丝虫第一轮PCR的引物
0142]上游引物的序列如SEQ ID NO 10所示，
0143]下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；
0144]6)检测马来丝虫第二轮PCR的引物
0145]上游引物的序列如SEQ ID NO 12所示，
0146]下游引物的序列如SEQ ID NO 13所示。
0147]实施例3检测蚊虫携带疟原虫属(恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、卵形疟 原虫、三日疟原虫和马来丝虫)的步骤如下描述
0148]a.提取核酸取单只蚊虫(斯氏按蚊)放入1. 5ml离心管中研磨至其被完全碾成 粉末，使用天根DNA提取试剂盒DP304 (北京天根)，按说明提取DNA。
0149]
0150]
0151]
0152]
0153]
0154]
0155]
0156]
0157]
0158]
0159]
0160] 0161] 0162] 0163]
b. PCR扩增
第一轮PCR条件
IOXBuffer
dNTP (2. 5mM)
BSA(5mg/ml)
FP(IOyM)
RP(IOyM)
DNA模板
EXTaq
ddH20
PCR循环参数 1. 94 0C
5 μ L 4μ L 1 μ L
各IyL(丝虫疟原虫第-各IyL(丝虫疟原虫第-1. 5μ L 0. 4μ L(2U) 34. 1 μ L
“轮PCR引物) -轮PCR引物)
0164] 5
94 0C 56 0C 72 0C
4Min 25Sec 20Sec 50Sec
go to step 2 29_33times
5Min
0165]6. 72 °C
0166]第二轮PCR条件
0167]IOXBuffer
0168]dNTP (25mM)
0169]BSA(5mg/ml)
0170]FP(IOyM)
0171]RP(IOyM)
0172]DNA模板(第一轮PCR产物)
0173]EXTaq
5 μ L 4μ L 1 μ L
各IyL(丝虫疟原虫第: 各IyL(丝虫疟原虫第:
1 μ L 0. 4μ L(2U)轮PCR引物) 轮PCR引物)
11
dNTP (2. 5mM)4 μ LBSA(5mg/ml)1 μ LFP :malm(10yM)1 μ LRP :Rcfm9279-9301(10yM)1 μ LcDNA 模板l.OyLEXTaq0. 3μ L(l. 5U)ddH2036. 7μ LPCR循环参数1. 94 °C4Min2. 94 °C25Sec3. 53 °C25Sec4. 72 °C30Sec5. go to step 225_30times6. 72 °C5Min第二轮PCR条件IOXBuffer5μ LdNTP (25mM)4 μ LBSA(5mg/ml)1 μ LFP :R9102-9123(10uM)1 μ LRP :Rcfm9279-9301(10yM)1 μ L模板(第一轮PCR产物)IyLEXTaq0. 3μ L(l. 5U)ddH2036. 7 μ Ltotal50 μ LPCR循环参数1. 94 °C4Min2. 94 °C25Sec3. 53 °C20Sec4. 72 °C30Sec5. go to step 2 32_34times6. 72 °C5Min上面所述的引物具体为黄病毒属病毒的第一轮PCR引物特异引物malm 5' -AACATGTTGGGRAARAGAGAGAA-3‘特异弓丨物Rcfm9279-9301:5'-GTGTCCCAKCCKGCKGTRTCATC-3 ‘黄病毒属病毒的第二轮PCR引物特异引物R9102-9123 :5' -ATYTGGTWYATGTGGYTTGGAG-3‘
特异弓丨物 Rcfm9279-9301:5'-GTGTCCCAKCCKGCKGTRTCATC-3 ‘c.电泳和观察配制1. 5-2%的琼脂糖凝胶，取5-10μ L扩增后的样品，在紫外灯
13下观察，检测是否有一条约200bp的核酸条带，如果有一 200bp的核酸条带，说明蚊虫携带 黄病毒属病毒(乙型脑炎病毒、登革热病毒1-4型、黄热病毒)，反之则没有。若要确定黄病 毒属病毒的类型，割胶纯化，以第二轮PCR上游引物测序(此片断测序易成功)，对于多重黄 病毒属病毒同时感染不宜直接测序的情况，可克隆测序解决。如图2所示。
权利要求
一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于含有如下引物1)检测黄病毒属病毒第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO2所示；2)检测黄病毒属病毒第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO4所示；3)检测疟原虫第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO6所示；4)检测疟原虫第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO7所示或如SEQ ID NO8所示，下游引物的序列如SEQ ID NO9所示；5)检测马来丝虫第一轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO10所示，下游引物的序列如SEQ ID NO11所示；6)检测马来丝虫第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO12所示，下游引物的序列如SEQ ID NO13所示。
2.如权利要求1所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的 黄病毒属病毒包括乙型脑炎病毒、或者登革热病毒1型、或者登革热病毒2型、或者登革热 病毒3型、或者登革热病毒4型、西尼罗病毒和黄热病毒。
3.如权利要求1所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的 疟原虫属包括恶性疟原虫、或者间日疟原虫、或者诺氏疟原虫、或者卵形疟原虫、或者三日 疟原虫。
4.如权利要求1所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的 试剂盒中还含有聚合酶链式反应试剂。
5.如权利要求1所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的 试剂盒中还含有阴性质控标准品。
6.如权利要求1所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的 试剂盒中还含有阳性标准品。
7.如权利要求5所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的 阴性质控标准品为灭菌ddH20。
8.如权利要求6所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的 阳性标准品为乙型脑炎cDNA、或者登革热病毒cDNA、间日疟原虫DNA、恶性疟原虫DNA。
9.如权利要求4所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的聚 合酶链式反应试剂中各组份为1)10倍聚合酶链式反应缓沖液；2)四种脱氧核糖核苷酸，四种脱氧核糖核苷酸的浓度均为2.5mM ；3)小牛血清蛋白BSA，小牛血清蛋白BSA的浓度为5mg/ml；4)EXTaq 酶，EXTaq 酶的浓度为 5U/ μ L ；5)灭菌双蒸水。
10.如权利要求9所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的 10倍聚合酶链式反应缓沖液的成份如下Tris-HClIOOmMKCl500mMMgCl215mM。
11.如权利要求1所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，其特征在于所述的 试剂盒中的所有的引物的浓度均为10 μ M。
12.—种检测蚊传病原体的方法，其特征在于包括一个提取蚊虫核酸的步骤，还包括 一个将提取的核酸在PCR扩增仪上进行扩增的步骤，还包括一个将扩增的产物进行电泳检 测的步骤，还包括确定蚊传病原体具体种类的测序步骤。
13.如权利要求12所述的一种检测蚊传病原体的方法，其特征在于 在一个将提取的核酸在PCR扩增仪上进行扩增的步骤中，1)检测黄病毒属病毒第一轮PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID Ν0:1所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 2所示；2)检测黄病毒属病毒第二轮PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID NO: 3所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 4所示；3)检测疟原虫第一轮PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID NO: 5所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 6所示；4)检测疟原虫第二轮PCR的引物上游引物的序列如SEQ ID NO 7所示或如SEQ ID NO 8所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 9所示；5)检测马来丝虫第一轮PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID N0:10所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO 11所示；6)检测马来丝虫第二轮PCR的引物 上游引物的序列如SEQ ID NO: 12所示， 下游引物的序列如SEQ ID NO: 13所示。
14.权利要求1所述的一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒在检测乙型脑炎病毒、 或者登革热病毒1型、或者登革热病毒2型、或者登革热病毒3型、或者登革热病毒4型、或 者西尼罗病毒和黄热病毒/恶性疟原虫、或者间日疟原虫、或者诺氏疟原虫、或者卵形疟原 虫、或者三日疟原虫/马来丝虫、或班氏丝虫中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种检测蚊传病原体的多重PCR试剂盒，所述的试剂盒中包括六对特异的引物，本发明还提供了一种检测蚊传病原体的方法，采用PCR扩增的产物进行电泳，通过PCR扩增片段的长度来检测和鉴定是否存在乙型脑炎病毒、登革热病毒、黄热病毒、恶性疟原虫、恶性疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、马来丝虫、班氏丝虫等病原体。本发明能同时检测各种已报道的蚊传病原体，以及可能从境外输入的黄热病毒和西尼罗病毒，而且快速、准确、灵敏，本发明可以应用于多种样品的检测，如蚊虫、病人血液、组织液等。本发明为我国蚊媒病防治工作提供一种低廉高效的早期监测和发现蚊媒病流行的方法。
文档编号C12Q1/70GK101979665SQ201010508779
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月15日 优先权日2010年10月15日
发明者周正斌, 朱淮民 申请人:中国人民解放军第二军医大学