一种筛选抗hsv-1药物的试剂盒和方法

专利名称：一种筛选抗hsv-1药物的试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及药物筛选领域，具体涉及一种筛选抗HSV-1药物的试剂盒和方法。
背景技术：
单纯疱疹病毒I型(HSV-1)为有包膜的DNA病毒，是危害人类健康的常见病原体， 且容易导致复发性感染和潜伏感染。HSV-1感染部位广泛，能引起口唇疱疹、生殖器疱疹、脑 炎、角膜炎等，并与宫颈癌和唇癌有关。HSV-1具有神经毒性，可侵犯中枢神经系统、破坏神 经细胞。目前，治疗由HSV-1引起的上述疾病的有效药物主要为阿昔洛韦(ACV)，其吸收差， 且根据国家药品不良反应监测中心病例报告显示，其引起的急性肾功能损害和血尿问题突 出。因此，筛选更多抑制该病毒的药物非常必要。现有技术中公知的主要筛药体系仍为传统的动物模型筛药体系和细胞模型筛药 体系，存在实验周期较长，实验步骤较复杂等缺点，难以迅速将潜在药物筛选出来，不能满 足药物研发初期高通量快速筛选药物的要求。碱性核酸酶是由HSV-1基因组中UL12基因编码的，已经被报道有5’ 3’的核酸 外切酶和核酸内切酶活性，因其反应的最适PH值较高，所以被认为是碱性核酸酶。在HSV-1 的复制中起着重要的作用，有研究证实碱性核酸酶能正确修复DNA复制过程中的断裂和缺 口，并能使处于复制状态的病毒基因组易于包装。该编码基因被敲除后HSV-1突变体复制 几乎停止，说明碱性核酸酶为病毒体内繁殖所必须。还有实验证明，在非容纳细胞中产生的 UL12基因组缺陷病毒，由于有异常基因组而很难感染新的细胞。上述研究证明碱性核酸酶 在病毒的复制及其感染过程中是非常关键的，这为碱性核酸酶成为一种新的抗疱疹病毒药 物筛选靶点提供了证据。也就是说，能够抑制碱性核酸酶活性的物质也具有抑制HSV-1的作用，进而推测 这些物质具有治疗由HSV-1引起的各种疾病的作用。因此，筛选治疗这些疾病的潜在药物 可以通过检测其能否抑制碱性核酸酶活性来实现。然而，UL12基因片段长，GC含量高，难以通过常规的PCR方法方便、准确地获得全 序列的UL12基因片段，进而获得大量有活性的碱性核酸酶，目前也未见市售品出现，因此 以碱性核酸酶作为筛药体系关键成分制备快速筛药系统难以适应临床大量应用的需要。

发明内容
为了克服现有技术存在的缺点，本发明提供了 一种方便快捷地筛选大量抗HSV-1 药物的方法。因此，本发明目的之一是提供一种用于筛选抗HSV-1药物的试剂盒，包含HSV-1碱 性核酸酶、碱性缓冲液、MgCl2和核酸。上述试剂盒内各成分浓度优选如下HSV_1碱性核酸酶浓度为0. 5 0. 7mg/ml、碱 性缓冲液浓度为40 60mM、MgCl2浓度为2 4mM、核酸浓度为1. 4 1. 6 y g/ml。上述试剂盒内各成分浓度进一步优选如下HSV-1碱性核酸酶浓度为0. 64mg/ml、碱性缓冲液浓度为50mM、MgCl2浓度为3mM和核酸浓度为1. 516 u g/ml。为了克服现有技术难以方便获得大量有活性的碱性核酸酶的缺陷，本发明试剂盒 中HSV-1碱性核酸酶是用如下方法得到的其步骤如下(1)扩增目的基因提取HSV-1病毒基因组作为模板，以SEQ ID NO :1 2所示 的核苷酸序列作为引物扩增HSV-1的UL12基因片段，扩增程序为96°C预变性3min，95°C 变性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31个循环，72°C延伸lOmin ；胶回收并纯化扩增的 UL12基因片段；(2)构建重组质粒用内切酶将步骤⑴获得的UL12基因片段与表达质粒连接， 获得重组质粒；(3)诱导表达将步骤(2)获得的重组质粒转化至大肠杆菌，涂布在含有适当抗生 素的平板上；培养重组质粒的大肠杆菌转化子使其生长至对数期；加入异丙基2b-D2硫代 半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达；离心收集菌体；(4)变性a，用含有变性剂的洗涤液两次洗涤步骤(3)得到的菌体；b，冷冻超声破 碎细胞，离心收集沉淀；c，用含有不同变性剂的多种洗涤液分别洗涤沉淀，离心，收集沉淀； d，用含有高浓度变性剂的洗涤液超声洗涤沉淀，得到蛋白溶液；(5)复性用盐酸胍浓度逐步减小的复性液复性步骤(4)得到的蛋白溶液，获得活 性蛋白。上述HSV-1碱性核酸酶的方法步骤(1)还优选包括如下步骤将T载体与得到的 UL12基因片段连接形成重组T载体，以该重组T载体为模板，以SEQ ID NO :1 2所示的 核苷酸序列作为引物扩增得到核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的HSV-1的UL12基因片段， 扩增程序为96°C预变性3min，95°C变性40s，68°C 72°C退火延伸2min 30s，31个循环， 72°C延伸lOmin ；胶回收并纯化扩增的UL12基因片段。本方法中退火、变性温度均优选为 68 °C。上述得到HSV-1碱性核酸酶的方法步骤(2)中表达质粒为pET系列质粒，优选为 pET32a-UL12 或者 pET28a_UL12 质粒。上述得到HSV-1碱性核酸酶的方法步骤(3)中大肠杆菌为E. coli BL12菌株或者 为 E. coli Rosetta 菌株。上述得到HSV-1碱性核酸酶的方法中步骤⑷采用的变性方法为用洗涤液A两次洗涤步骤(3)获得的菌体；冷冻超声破碎菌体，离心收集沉淀；用 洗涤液B、C、D依次洗涤、离心、收集沉淀；用洗涤液E溶解沉淀，获得蛋白溶液；所述的洗涤液A 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmMNaCl 的溶液；洗 涤液 B 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmMNaCl、1 % NP-40 (乳化剂 NP40 系列) 的溶液；洗涤液 C:包含 50mMTris-HCl[pH8.0]、2mM EDTAUOOmM NaCl,3% TritonX-100、 ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗涤液D 包含50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmM NaCl、0. 5% TritonX-100、1. 5M盐酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗涤液E 包含100mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、10mM3 -巯基乙醇、ImM 苯甲基磺酰氟和 4 6M 盐酸胍的溶液。洗涤液E中盐酸胍浓度优选为4M。上述得到HSV-1碱性核酸酶的方法步骤(5)中的复性液为包含 50mMTris-HCl[pH8. 0]、2mM EDTA、50mM NaCl、5%甘油、1 %甘氨酸和盐酸胍浓度递减的溶液，盐酸胍浓度依次为4M、3M、2M、1M和0M。本发明试剂盒中碱性缓冲液为Tris-HCl缓冲液，核酸为环状DNA或者线性DNA， 环状DNA可以是pcDNA3. 0质粒，线性DNA可以是单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶基因片段 UL12。本发明试剂盒中碱性缓冲液的pH值优选为8. 5 9. 5，进一步优选为9. 0。本发明另一个目的是提供一种用上述试剂盒筛选抗HSV-1药物的方法，往上述试 剂盒中加入待测药物，反应5 60分钟后，检测所述试剂盒内的核酸降解程度。上述待测 药物浓度优选为150 1200ii g/ml。本发明的有益效果克服传统筛药体系的缺点，操作简单，成本低，可用于快速高 通量筛选抗HSV-1的潜在药物。


图1实施例1步骤(1)扩增UL12基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。泳道M:DNA Marker DL2000 ；泳道 1 :UL12 基因。图2进一步扩增UL12基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1为DL2，000DNA Marker,作为标记；泳道2为用EcoR I/Hind III切割纯化重组pMD19T载体；泳道3为 用 EcoR I/Hind III 切割纯化 pET28a_UL12 ；泳道 4 是空载质粒 pET28a(+)，用 EcoR 1/ Hind III处理后作为对照；泳道5为没有酶切处理的pET28a-UL12 ；泳道6为人-Hind III digest DNA Marker,作为标记。图3进一步扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的UL12基因片段送大连 宝公司测序的彩色波形图。图3a中第259 1个碱基对应已在GenBank上公布的核苷酸 序列如SEQ ID NO :4所示的HSV-117毒株基因序列中第1 259个碱基，且为互补碱基； 图3b中第663 1个碱基对应已在GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示的 HSV-117毒株基因序列中第178 835个碱基，且为互补碱基；图3c中1 703个碱基对 应已在GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的HSV-117毒株基因序列中第 774 1476个碱基；图3d中第1 436个碱基对应已在GenBank上公布的核苷酸序列如 SEQ ID NO 4所示的HSV-117毒株基因序列中第1447 1881个碱基。图4进一步扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的UL12基因片段序列与 核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的标准国际株序列对比结果。每一小组为3列，第一列为 GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ IDN0 4所示的HSV-117毒株基因序列的UL12基因序 列，即国际标准UL12基因序列，第二列为本发明扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所 示的UL12基因序列，即实测UL12基因序列，第三列为第一列和第二列的共有序列图5不同诱导表达时间对表达量的影响结果图。泳道3至泳道8对应诱导时间为 10h，8h，6h，4h，3h，0h。泳道2和泳道10作为对照，未添加IPTG，表达时间10h。蛋白质分 子量标准(低)，在泳道1和泳道9，作为标记。图6不同洗涤液变性处理后，碱性核酸酶存在形式鉴定图。泳道1是用变性剂A 和变性剂C处理后的上清液；泳道2是经过变性剂A和变性剂B处理后的上清液；泳道3是 用变性剂A、B、C、D和E，且变性剂E中盐酸胍的浓度为4M ；泳道4是用变性剂A、B、C、D和 E，且变性剂E中盐酸胍的浓度为6M ；泳道5是蛋白质分子量标准(低)；泳道6是经过变性剂A和变性剂B处理后的沉淀；泳道7是用变性剂A和变性剂C处理后的沉淀。图7碱性核酸酶活力测定的结果图。E. coli BL21和E. coli Rosetta产生的重 组融合蛋白AN对pcDNA3. 0质粒进行酶切反应的结果。泳道M 入Hind III digest DNA Marker ；泳道1 :pcDNA3. 0对照；E. coli Rosetta表达的碱性核酸酶与pcDNA3. 0反应于 37°C孵育 5min (泳道 2)，20min (泳道 4)，40min (泳道 6)，60min (泳道 8) ；E. coli BL21 表 达的碱性核酸酶与pcDNA3. 0反应于37°C孵育5min (泳道3)，20min (泳道5)，40min (泳道 7)，60min (泳道 9)。图85种药物检测结果图。大豆苷元位于泳道1，黄芪总苷位于泳道2，绿原酸位于 泳道3，苦参碱位于泳道4，氧化苦参碱位于泳道5，泳道6没有添加试剂盒反应体系，泳道7 仅有DNA底物作为对照，泳道8为人-HindiII digest DNA Marker,作为标记。
具体实施例方式实验材料和仪器以下实施例中所用实验材料和仪器，除特别说明，均为市售购买。(1)材料标准单纯疱疹病毒I型(HSV-1) SM44株，购自中国生物制品检定所；Vero细胞购于四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室；E.coli BL12(DE3)plysS 菌株、E. coli Rosetta(DE3)、原核表达载体 pET32a(+)、 pET28a (+)，购自 Novagen 公司；高保真Taq 酶、T4 DNA 连接酶、DL2, 000DNA Marker、A -Hind III digestDNAMarker、蛋白质分子量标准(低)、限制性内切酶EcoRI和HindIII、E. coli JM109 菌株、pMD19-T 载体、dNTPs、LA Taq 酶、GC buffer, EDTA、NP-40、TritonX-100，购于大连 TaKaRa 公司；核酸测序由大连TaKaRa公司完成；异丙基硫代-0 -D半乳糖苷(IPTG)、盐酸胍，为美国AMRESC0产品；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，购自美国OMEGA公司；核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物，由上海Sangon Biotech公司合成；RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司、LB培养基，购自英国0X0ID公司；XTT，购自 Bio Basic ING 公司苯甲基磺酰氟(PMSF)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)，购自Sigma公司；黄氏总苷、苦参碱、氧化苦参碱、大豆总苷、牛蒡子苷，购自四川省维克奇生物技术 有限公司；阿昔洛韦，购于武汉华龙生物制药有限公司。ddH20、MgCl2、乙醇、PBS 缓冲液、Tris-HCl 缓冲液、NaCl、甘油、甘氨酸、SDS-PAGE 和琼脂糖凝胶电泳的各种常规试剂。(2)仪器PCR仪，购自美国Thermo公司；紫外可见分光光度计，购自美国Bio-Rad公司；电热恒温培养箱为青岛海尔的产品；
超滤管，购自美国MILLIP0RE公司；离心机，购自德国Eppendorf公司；超声细胞破碎仪。实施例1获得HSV-1碱性核酸酶⑴扩增UL12基因片段提取病毒基因组用DMEM培养vero细胞，接种HSV-1待细胞病变，即CPE达到 +++ ++++，收获细胞，用病毒DNA抽提试剂盒抽提HSV-1全基因组；引物设计依据GenBank公布的UL12基因片段的核苷酸序列，用PRIMER5. 0软件 设计引物，引物序列如SEQ ID NO :1 2所示；扩增目的基因以提取得到的HSV-1全基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示引物对为引物，扩增目的基因UL12基因片段反应体1 模板1 U 1核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示引物1 P 1核苷酸序列如SEQ IDNO 2所示引物1 P 1GC buffer12. 5u 1dNTP2u 1LAtaq 酶0. 25 u 1ddH207. 25 u 1反应条件96°C预变性3min，95°C变性40s，68°C退火延伸2min30s 31个循环， 72°C延伸 lOmin。产物回收0. 8%常规琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，以胶回收试剂盒回收扩增产 物。凝胶电泳结果显示扩增得到的DNA片段为1881bp，与已知UL12基因片段大小相 同。(结果见图1)(2)进一步扩增UL12基因片段制备模板在T4DNA连接酶作用下将步骤(1)得到的UL12基因片段与pMD_19T载 体连接，构建成重组PMD19T载体。扩增目的基因以步骤(1)得到的连接有UL12基因片段的重组pMD19T载体为模
板，以核苷酸序列如SEQ IDN01 --2所示引物对为引物扩增目的基因UL12基因片段
反应体系
模板1 u 1
核苷酸序列如SEQIDNO:1所示引物1 u 1
核苷酸序列如SEQIDNO:2所示引物1 U 1
GC buffer12. 5u 1
dNTP2u 1
LAtaq 酶0. 25u 1
ddH207. 25u 1
反应条件96 °C预变性3min，95 °C变性40s，68 °C退火延伸2min30s，31个循环，
872°C延伸 lOmin。产物回收0. 8%常规琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，以胶回收试剂盒回收扩增产 物。结果检测将胶回收得到的UL12基因片段与pMD-19T载体连接，构建成重组 PMD19T载体，琼脂糖凝胶电泳并测序检验扩增得到的UL12基因片段。结果如图2、图3和图4。图2显示凝胶电泳结果显示扩增得到的DNA片段为 1881bp，与已知UL12基因片段大小相同。图3为核苷酸序列测序的彩色波形图，证明通过本 发明方法扩增得到了核苷酸序列如SEQ IDN0:3所示的UL12基因片段。图4为本发明扩增 得到的核苷酸序列如SEQID NO 3所示的UL12基因片段序列与核苷酸序列如SEQ ID NO 4 所示的标准国际株UL12基因片段序列对比结果，从图4可知，核苷酸序列如SEQ ID NO :3所 示的UL12实测序列核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的UL12标准国际株序列=1866/1881 =99. 20%，也就是说，本发明扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示的UL12基因片 段与核苷酸序列如SEQID NO :4所示的标准国际株序列的同源性为99. 20%，证明本发明准 确地扩增了 UL12基因片段。(3)碱性核酸酶的表达1)重组表达质粒构建将步骤(1)或者步骤(2)得到的UL12基因片段在EcoRI、HindHI内切酶作用下 与pET28a(+)质粒或者pET32a(+)连接形成pET28a_UL 12重组表达质粒或者pET32a_UL12 重组表达质粒，构建的重组质粒含有T7RNA聚合酶启动子，控制碱性核酸酶的表达，并包含 有2个His标签，可以用来纯化蛋白。2)重组表达质粒在大肠杆菌BL21中诱导表达将步骤(1)得到的pET28a_UL12重组表达质粒通过CaCl2介导转化至E. coli BL21 感受态细胞，37°C培养于含有50 u g/ml卡拉霉素的LB培养板上，220r/min振摇过夜；挑取获得重组表达质粒的大肠杆菌克隆；将大肠杆菌克隆直接接种到50ml含有50 u g/ml卡拉霉素的LB培养基中，在37°C 摇瓶培养，直到0D6(1(1值为0. 4 0. 6 ；加入终浓度为0. 5mM IPTG进行诱导，在37°C摇瓶1 10小时后，离心收集菌体。3)重组表达质粒在大肠杆菌Rosetta中诱导表达将步骤(1)得到的pET32a_UL12重组表达质粒通过CaCl2介导转化至E. coli Rosetta感受态细胞，37°C培养于含有30 u g/ml氨苄青霉素LB培养板上，220r/min振摇过 夜培养；挑取获得重组表达质粒的大肠杆菌克隆；将大肠杆菌克隆直接接种到50ml含有30 u g/ml氨苄青霉素和34 u g/ml的氯霉 素的LB培养基中，在37 °C摇瓶培养，直到0D600值为0. 4 0. 6 ；加入终浓度为0. 5mM IPTG进行诱导，在37°C摇瓶1 10h后，离心收集菌体。图5的电泳图显示，泳道3 8中目标蛋白条带依次减弱，也就是随着诱导时间的 减少，其表达蛋白的含量逐渐降低。因此，确定最优的诱导时间为10h。(4)碱性核酸酶的变性、复性和活力测定(1)变性
将步骤3中(2)或者(3)所得菌体用5ml洗涤液A(50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl)洗两次；4°C下，收集细菌在冰浴上经过4min超声处理，破碎细胞，得到菌液；4°C下，用 5ml 洗涤液 B(50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmMNaClU % NP-40, 即乳化剂NP40系列)的超声洗涤菌液；4°C下，12000rpm 离心 15min，收集沉淀；4 °C 下，用 5ml 洗涤液 C(50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、100mMNaCl、3 % TritonX-lOOUmM PMSF，即甲基磺酰氟)的洗涤液C超声洗涤沉淀；12000rpm 离心 15min，收集沉淀；4°C 下，用 5ml 洗涤液 D(50mM Tris-HCl [pH8. 0] ,2mM EDTA、100mMNaCl、0. 5 % TritonX-lOOU. 5M盐酸胍和ImM PMSF)超声洗涤沉淀；12000rpm 离心 15min，收集沉淀；用5ml 洗涤液 E (4M 或者 6M 盐酸胍、lOOmM Tris-HCl [pH8. 0]、2mMEDTA、lOOmM NaClUOmM 3巯基乙醇、和ImM PMSF)洗涤沉淀；收集上清在-80°C保存，蛋白质浓度用Bio-Rad分光光度计进行测量。变性最优条件如图6所示，当洗涤液E中的盐酸胍浓度为4M时，处理后的沉淀几 乎没有目标蛋白，目标蛋白溶于洗涤液，非常有利于复性。(2)复性取lml 变性得到的蛋白溶液，用复性液(50mMTris-HCl[pH8. 0]、2mMEDTA、50mM NaCl、5%甘油、甘氨酸和浓度递减的盐酸胍，盐酸胍的浓度依次为4M、3M、2M、1M和 0M)将其稀释到0. 1-lmg/ml，在透析袋中复性，复性时间为24h，最后用超滤管(4500rpm， 10min,4°C )离心收集复性蛋白溶液，放置-20°C冰箱保存。(3)活力检测取复性得到的复性蛋白溶液稀释为0. 12mg/ml，用pcDNA3. 0质粒或者线性UL12基 因片段作为底物，进行酶活性测定。反应体系为6. 5u 1 200mM Tris-HCl [pH 9. 0]1. 5u 1 50mM MgCl22 ill pcDNA3. 0 质粒15 ill ddH2010 ill复性蛋白溶液反应条件37°C，5/20/40/60min。反应相应时间后取出5iU反应液，用liil 6 X Loading Buffer终止反应，做 0.8%琼脂糖凝胶电泳检验。其中环状DNA用于检测药物对单纯疱疹病毒I型碱性核酸内切酶的抑制作用，线 性DNA用于检测药物对单纯疱疹病毒I型碱性核酸外切酶的抑制作用。结果如图7所示，本发明得到的碱性核酸酶可以有效的降解核酸，酶活性比较高， 且反应时间为60min时，降解效果最好。实施例2筛选抗HSV-1药物及验证试验
(1)筛选抑制碱性核酸酶的药物制备待测药物取每个待检测的药物在20%乙醇中溶解，形成不同浓度溶液， 绿原酸300iig/ml、苦参碱1.2mg/ml、黄芩苷1. 2mg/ml、氧化苦参碱1. 2mg/ml、大豆苷元 300y g/ml。制备筛药体系取实施例1获得的碱性核酸酶制备成为0. 64mg/ml的溶液；制备 50mM Tris-HCl 缓冲液[pH 9. 0]；制备 3mM MgCl2溶液；制备 1. 516 u g/ml pcDNA3. 0溶液作 为底物。各成分的体积分别为碱性核酸酶溶液:12u 1 ；Tris-HCl缓冲液6. 25 u 1 ；MgCl2 溶液1. 5 ill ；pcDNA3. 0 溶液1. 0 ill。筛选取4. OiU待测药物的溶液，与筛药体系中Tris-HCl缓冲液、MgCl2溶液、 pcDNA3. 0溶液混合，加入碱性核酸酶溶液，于37°C孵育45min。在0. 8%的琼脂糖凝胶电泳 中检测pcDNA3. 0降解程度。结果如图8所示，黄芩苷、苦参碱、氧化苦参碱和大豆总苷可以有效抑制碱性核酸 酶活性。(2)验证实验药物的细胞毒件试骑将Vero细胞接种到96孔板，用RPMI 1640生长液培养，待细胞长成单层，将每一 个待检药物(绿原酸、苦参碱、黄芩苷、氧化苦参碱、大豆苷元、牛蒡子苷)用培养基配置成 1200 u g/ml的母液，在1. 5ml EP管中倍比稀释3次，每一次稀释保留1000 yl在1. 5mlEP 管内，最小的稀释倍数为1 8，每种药物有4个不同浓度；96孔板分为8个区域，6个区域用于检测6种药物，剩余两个区域为空白对照和阴 性对照。每个区域12个孔，每3个孔浓度相同。将96孔板中的培养液倒掉，加入相应药物200 u 1，在37°C，C02环境中培养3天。每孔加入20111的乂17溶液(制备方法取21^ XTT溶于无菌水中，终浓度为 lmg/ml，再加入20 u 1 (0. lmol/L的PMS溶液)，37°C、C02环境孵育6h后，用酶标仪(波长 为450nm)测定吸光度0D值，测量重复三次。毒性百分比通过与阴性对照比较得到。按照 Reed-Muench方法计算得到最大无毒浓度(MNTC)。结果如表1所示表权利要求
一种用于筛选抗单纯疱疹病毒I型药物的试剂盒，其特征在于包含独立包装的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶、碱性缓冲液、MgCl2和核酸。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶浓 度为0. 5 0. 7mg/ml、碱性缓冲液浓度为40 60mM、MgCl2浓度为2 4mM、核酸浓度为 1. 4 1. 6 y g/ml0
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶浓 度为0. 64mg/ml、碱性缓冲液浓度为50mM、MgCl2浓度为3mM、核酸浓度为1. 516ug/ml0
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶是 以如下方法得到的(1)扩增目的基因提取单纯疱疹病毒I型病毒基因组作为模板，以SEQID NO :1 2 所示的核苷酸序列作为引物扩增HSV-1的UL12基因片段，扩增程序为96°C预变性3min， 95°C变性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31个循环，72°C延伸lOmin ；胶回收扩增的 UL12基因片段；(2)构建重组质粒将获得的UL12基因片段与表达质粒连接，获得重组表达质粒；(3)诱导表达将步骤(2)获得的重组表达质粒转化大肠杆菌；培养含有重组表达质粒 的大肠杆菌使其复制至处于对数期；加入异丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶诱导表达；离心收 集菌体；(4)变性破碎步骤(3)获得的菌体，离心收集沉淀，用包含变性剂的洗涤液洗涤沉淀， 获得蛋白溶液；(5)复性用复性液复性步骤(4)获得的蛋白溶液，获得活性蛋白。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述得到单纯疱疹病毒I型碱性核酸 酶的方法步骤(1)扩增目的基因的方法为提取单纯疱疹病毒I型病毒基因组作为模板， 以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作为引物扩增HSV-1的UL12基因片段，扩增程序 为96°C预变性3min，95°C变性40s，68 °C 72°C退火延伸2min30s，31个循环，72°C延伸 lOmin ；胶回收扩增的UL12基因片段；将扩增得到的UL12基因片段与T载体连接形成重组 T载体，再以该重组T载体为模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作为引物进一步 扩增得到核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12目的基因片段，扩增条件不变。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述得到单纯疱疹病毒I型碱性核酸 酶的方法中退火、变性温度为68°C。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述得到单纯疱疹病毒I型碱性核酸 酶的方法步骤(2)中表达质粒为pET系列质粒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述得到单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶 的方法中表达质粒为pET32a-UL12或者pET28a_UL12质粒。
9.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述得到单纯疱疹病毒I型碱性核酸 酶的方法步骤(3)中大肠杆菌为E. coli BL12菌株或者为E. coli Rosetta菌株。
10.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述得到单纯疱疹病毒I型碱性核酸 酶的方法中步骤(4)采用的变性方法为用洗涤液A两次洗涤步骤(3)获得的菌体；冷冻超声破碎菌体，离心收集沉淀；用洗涤 液B、C、D依次洗涤、离心、收集沉淀；用洗涤液E溶解沉淀，获得蛋白溶液；所述的洗涤液 A 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmMNaCl 的溶液；洗涤 液 B 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmMNaCl、1 % NP_40(乳化剂 NP40 系列) 的溶液；洗涤液 C:包含 50mMTris-HCl[pH8.0]、2mM EDTAUOOmM NaCl,3% TritonX-100、 ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗涤液D 包含50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、lOOmM NaCl.O. 5% TritonX-100、1. 5M盐酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗涤液E 包含lOOmM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaClUOmM 3 -巯基乙醇、ImM 苯甲基磺酰氟和 4 6M 盐酸胍的溶液。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于所述洗涤液E中盐酸胍浓度为4M。
12.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述得到单纯疱疹病毒I型碱性核酸 酶的方法步骤(5)中的复性液为包含50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、50mM NaCl、5%甘 油、甘氨酸和盐酸胍浓度递减的溶液，盐酸胍浓度依次为4M、3M、2M、1M和0M。
13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述碱性缓冲液为Tris-HCl缓冲液， 核酸为环状DNA或者线性DNA。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，所述的环状DNA为pcDNA3.0质粒，线性DNA为编 码单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶基因片段UL12。
15.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述碱性缓冲液的PH值为8.5 9. 5。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于所述碱性缓冲液的pH值为9.0。
17.一种利用权利要求1所述的试剂盒筛选抗单纯疱疹病毒I型药物的方法，其特征在 于将待测药物与所述试剂盒中的试剂混合，反应5 60分钟，检测核酸降解程度。
18.根据权利要求17所述的筛选抗单纯疱疹病毒I型药物的方法，其特征在于所述 待测药物浓度为150 u g/ml-1200 u g/ml。
全文摘要
本发明提供了一种用于筛选抗单纯疱疹病毒I型药物的试剂盒，其包含了单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶、碱性缓冲液、MgCl2和核酸。还提供了一种用于筛选抗单纯疱疹病毒I型药物的方法，步骤为在所述试剂盒中加入待测药物，反应5～60分钟后，检测核酸降解程度。本发明提供的筛选抗单纯疱疹病毒I型药物的方法克服了传统筛药方法复杂、成本高等缺点，实现快速、简便、低成本筛药。
文档编号C12N9/22GK101974613SQ201010508269
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月15日 优先权日2010年10月15日
发明者何婷, 曾南, 李学东, 陈恬, 陈洪宇 申请人:成都医学院