专利名称：一种将单核细胞分化培养为成熟的树突状细胞的方法
技术领域：
本发明涉及一种将CD 14+单核细胞分化培养为成熟的树突状细胞的方法，属于细胞生物学领域。
背景技术：
树突状细胞(Dendritic cell, DC)于1973年由Meinman和Cohn首次从小鼠淋巴器官分离获得。是目前所知功能最强的、也是唯一能激活初始性T细胞(NT cell)的专职抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell，APC)，在免疫应答中处于中心地位。近年来基于DC的免疫治疗已经成为研究热点，尤其是体外大量扩增培养DC用于病毒感染和肿瘤治疗已经进入临床实验阶段。DC起源于骨髓CD34+细胞，除大脑以外广泛分布于全身各脏器，但数量极微，仅占外周斑单核细胞的0. 5-1%以下。目前研究表明，经细胞因子作用可在体外诱导分化获得大量DC。具体方法包括有(1)用细胞因子混合剂如干细胞因子(SCF)、IL-3、IL-4、IL-6等培养⑶34+干细胞来源J2)IL-4、GM-CSF培养单核细胞来源；(3)从外周血中分离获得DC。近年来的一个重要进展就是把骨髓和血中的CD34+前体细胞诱导成有免疫刺激活性的DC。具体来源和方法为①脐带血脐带血中含有丰富的细胞因子，具有组织相容性好等特点，用脐带血体外诱导扩增DC成为目前研究的热点。但是从脐带血中纯化出CD34+干细胞费用昂贵。②骨髓骨髓中含有大量的CD34+造血干细胞，在合适的细胞因子刺激下可以诱导高质大量的DC。其主要缺点是骨髓采集不易，而且容易污染，患者比较痛苦，扩增费用昂贵。③ 脾脏脾脏是免疫器官和造血器官，从脾脏分离出来的贴壁单核细胞可以诱导分化为典型 DC ；但脾脏来源受限。由于DC存在异质性，不同组织来源，不同的培养扩增条件可以得到不同分化成熟阶段的DC。由于外周血采集方法简单易行，并且较骨髓而言不易污染。目前很多人主张用外周血来源的DC做免疫治疗。常用的方法是从正常人外周血分离获得单核细胞，加入GM-CSF、IL-4，进一步地成熟需要肿瘤坏死因子-α (TNF- α )、⑶40或其他试剂如细菌脂多糖(LPQ的刺激。体外培养1周后，可获得大量高纯度的DC。但是此种方法细胞诱导周期较长，细胞因子价格昂贵。2008年Brian C. Schanen利用transwell技术(一类有通透性的杯状的装置，常用于肿瘤侵袭实验，共培养实验等)将外周血单核细胞(PBMC)和人脐静脉血内皮细胞(HUVEC)进行共培养，在PBMC通过上层的HUVEC后，在下层分化为未成熟的DC，整个分化过程不需要外源细胞因子，并且更接近体内DC分化的过程，但是这种培养方法transwell价格比较昂贵并且只适用于小量培养(Brian C. Schanen and Donald R.Drake III. A novel approach for the generation of human dendritic cells from blood. Journal of Immunological Methods2008,335,53-64)。基于现有技术存在的问题，本发明欲使用人脐静脉内皮细胞株作为饲养层细胞， 并提供相应的细胞因子，以诱导单核细胞的成熟和分化，旨在提供一种经济、方便、高效的 DC培养分化技术，解决现有技术存在的问题。
发明内容
本发明提供了一种将CD 14+单核细胞分化培养为成熟的树突状细胞的方法，所述方法包括以下步骤(1)以能分泌促进细胞成熟的细胞因子的人脐静脉内皮细胞作为饲养层细胞，培
养至贴壁；(2)接种CD 14+细胞，与(1)所述饲养层细胞进行共培养36_60小时；(3)收集步骤(2)获得的悬浮细胞；(4)将步骤( 获得的细胞与能分泌促进细胞分化的细胞因子且已经贴壁生长的饲养层细胞人脐静脉内皮细胞共培养12-36小时；(5)收集步骤(4)获得的悬浮细胞，即为成熟的树突状细胞。在一个优选技术方案中，所述人脐静脉内皮细胞为Ea. hy926细胞。在另一个优选技术方案中，所述步骤O)中所述的能分泌促进细胞成熟的细胞因子为GM-CSF和/或IL-4。在又一个优选技术方案中，所述GM-CSF和IL-4为融合表达蛋白。为获得更好的技术效果，所述步骤O)中所述的培养时间可以为48小时。在一个优选技术方案中，所述步骤中所述的能分泌促进细胞分化的细胞因子为 TNF- α。为获得更好的技术效果，所述步骤⑷中所述的培养时间为M小时。在另一个优选技术方案中，所述⑶14+单核细胞分离于人外周血。在另一个优选技术方案中，所述细胞因子的表达载体为慢病毒载体pBPLV。为获得更好的技术效果，所述Ea. hy926细胞在共培养之前需要经过的剂量为 40Gy的γ射线照射。本发明利用能分泌促进细胞成熟和分化的细胞因子的人脐静脉内皮细胞株用作 DC培养的饲养层细胞，不仅模拟了体内DC分化时在体内的微环境和细胞因子催化的过程， 避免了用人脐静脉血内皮细胞HUVEC作为饲养层时，原代细胞来源受限，每次提取都必须从脐带中分离得到，而且培养时需要加入细胞因子的问题。本发明所具体使用的人脐静脉内皮细胞株Ea. hy^6细胞，是HUVEC和肺癌细胞A549的融合细胞，可以增殖100代以上， 并且培养时不需要加入细胞因子，克服了培养复杂以及不稳定等因素，优化了 DC的培养系统。与传统方法相比具有经济、快速、可以大量培养的特点及优势。
图IGM-CSF和IL-4、以及TNF- α PCR扩增产物鉴定图；图2重组慢病毒载体pBPLV (GFP)构建示意图；图3重组质粒pBPLV-GMCSF-2A-IL4酶切图谱；图4重组质粒PBPLV-IL2信号肽-STNF- α酶切图谱；图5慢病毒载体包装电镜图；图6Ea. hy926细胞感染电镜图；图7DC体外培养倒置显微镜观察形态图；图8DC的表型变化的流式细胞分析图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明进行更为详细的说明，但是这些实施例用于更好地理解本发明，但并不限定本发明。本发明的保护范围以权利要求书为准，在本发明的发明构思范围内，以本领域普通技术人员的技术水平和本领域公知常识水平作出的任何改变均处于本发明的保护范围内。实施例1分泌GM-CSF和IL-4、以及TNF- α的Ea. hy926细胞的构建1.慢病毒多基因共表达载体的建立1)分别扩增 GM-CSF-2A，以及 2A-IL4 序列。2A序列正向引物5，-3，GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT2A序列反向引物5，-3，AGGGCCGGGATTCTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTCTGCC CTC2)扩增融合基因 GM-CSF-2A-IL4。3)扩增 IL2 信号肽-sTNF- α。2)与3)的PCR扩增的结果见图1，在图1中，各泳道依次为(1). GM-CSF_2A_IL4 重叠PCR结果；(2) IL2信号肽-sTNF- α ； (3)分子量标记DL. marker2000。通过聚合酶链式反应(PCR)分别获得了 GM-CSF、IL4共表达基因948bp，以及目的基因IL2信号肽-sTNF-α 530bp左右。测序结果经过序列比对与Genebank公布序列一致(IL4Gene ID 3565，GM-CSF Gene ID 1437，TNF-α Gene ID 7124，IL2 信号肽序列参考文献单纯分泌性TNF-α真核表达质粒的构建及表达细胞株的建立，细胞与分子免疫学杂志(J Cell Mol Imumuno 1)2000 ； 16(1))。4)目的基因连接pEASY-Tl载体(购自"TransGen Biotech公司)测序(按产品说明书进行操作)。 5)慢病毒载体pBPLV (pBPLV是通过将pMAl载体(该载体是将原始质粒pRRLSIN. cPPT. PGK-GFP. WPRE (购自 ADDGENE 公司)参考 Amedola M, et al. Coordinate dual-gene transgenesis by lentiviral vectors carrying synthetic bidirectional promoters. Nat Biotechol, 2005, 23(1) :108-116文献进行改造而得)用限制性内切酶PstI、Mil进行双酶切后与正义链为5，-ggctagcatgctctagagcgctg-3，，反义链为 3，-acgtccgatcgtac gagatctcgcgacagct-5’多克隆位点序列链接得到的)与目的基因37°C分别双酶切汕后，T4 连接酶的作用下16°C过夜(所用的酶均来自TaKaRa公司，按照说明书进行操作)。载体构建示意图见图2，在图2中，通过双酶切、连接过程获得重组质粒 PBPLV-GM-CSF-2A-IL4 (xba I，sail)、pBPLV_IL2 信号肽-TNF-α (pst I，sall)。6)构建后的质粒鉴定图3为重组质粒pBPLV-GMCSF-2A-IL4酶切图谱。其中(1) sail单酶切；(2)xbal 单酶切；(3)双酶切；(4)分子量标记maker 15000。图4为重组质粒PBPLV-IL2信号肽-STNF- α酶切图谱。其中(1) DLmarker2000 ； (2)pst I 单酶切；(3)sal I 单酶切 J4)pst I、sail 双酶切；(5)DLmarker 15000。通过双酶切鉴定，两个重组质粒都可以切除目的基因的条带，该结果表明构建质粒成功。
2.慢病毒载体的包装以293FT细胞系(是经人工改造过的人胚肾细胞系，购自invitrogen公司cat no :R700-07)为包装细胞，利用invitrogen慢病毒三质粒包装系统(pLPl、pLP2、pLP/VSVG 均购自invitrogen公司)，包装慢病毒。步骤1)准备质粒。第三代慢病毒包装系统，包含慢病毒载体、包装质粒pLPl和pLP2、 包膜质粒pLP/VSVG四个质粒，要求质粒DNA的0拟60Λ80的比值为1. 80左右，浓度在 0.l_3ug/ul02)培养细胞，注意不要让其生长过度，长至90 %汇合即传代，传代超过20 代则不应使用。3)制备DNA-Lipofectamin2000复合物。在一个无菌的5ml管中，加入1. 5ml无血 ^raOpti-MEM 1 (invitrogen cat no :31985-062),依次加入4. 2ug pLPl、2ug pLP2、2. 8ug pLP/VSVG和5ug慢病毒表达质粒，轻轻混勻。在另一个无菌的 5ml 管中，将 42ulLipofectamine (invitrogen，cat no :11668-027)稀释于1. 5ml无血清Opti-MEM I无血清培养基中，轻轻混勻，室温放置5min，混合以上两管液体，轻轻混勻，室温孵育20min，形成DNA-Lipofectamin2000复合物。4)在DNA-Iipid复合物形成过程中，胰蛋白酶消化细胞，计数，将细胞重悬于含血清的生长培养基中，使其密度达到1. MlO6个/ml。注意培养基中不能含抗生素。5)将DNA-Lipofectamin2000复合物加入到含有5ml生长培养基的IOcm细胞培养皿中。培养基中不含抗生素。6)将5ml 293FT细胞细胞悬液加入到含有DNA-Lipofectamin2000复合物和生长培养基的IOcm细胞培养皿中，轻轻前后摇晃移动培养皿混勻。将细胞置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养过夜。7)次日，用IOml包含丙酮酸钠的的完全培养基(高糖DMEM，10 %胎牛血清，0. ImM非必需氨基酸，2mM-L-谷氨酰胺，青-链霉素，ImM丙酮酸钠)更换含有 DNA-Lipofectamin2000复合物的培养基。8)转染48_72h后收集上清于15ml无菌离心管中。9)4°C，3000rpm离心15min去除细胞碎片，或用0. 45um滤膜过滤。如果需要浓缩，则需要50000g超速离心池收集病毒沉淀。293FT细胞包装慢病毒，在慢病毒载体构建成功后，利用invitrigen慢病毒三质粒包装系统在细胞中进行慢病毒的包装。包装细胞24h后，通过电镜观察，既可以看到细胞内有GFP表达，阳性细胞比列超过95% (图幻，包装效率很高。包装7 后，培养上清为淡黄色，收集毒液， 用0. 45um滤膜过滤除去细胞碎片，置于-70°C备用。3.慢病毒感染EA.hy^6细胞(购自中科院上海生命科学研究所细胞资源中心，中科院典型培养物保藏委员会细胞库)去除EA. hy926细胞培养基，加入慢病毒毒液及中浓度 8ug/ml 的 polybrene(sigama cat no :h9268)，置于 37°C>5% CO2 细胞培养箱中培养过夜。次日，去除毒液，添加完全培养基，待细胞生长至80% -90%汇合时，按1 3传代。图6为电镜观察的Ea. hy926细胞感染结果，可见利用上述慢病毒感染内皮细胞株 EA. hy926,感染效率达90%。获得GM-CSF、IL4共表达株，以及TNF- α表达株。实施例2制备饲养层细胞1)上述慢病毒感染Ea. hy926细胞，获得IL4、GM-CSF-Ea. hy926饲养层细胞和 TNF- α -Ea. hy926饲养层细胞；感染步骤同实施例1中慢病毒感染EA. hy926细胞；2)利用荧光细胞分选技术，根据GFP荧光强弱分选出GFP强表达株和弱表达株；3) IL4、GM-CSF-Ea. hy926 和 TNF- α -Ea. hy926 细胞以剂量 40Gy 的 γ 射线照射抑制其增殖，照射后的细胞更换培养基，于细胞培养箱孵育2-3h，PBS液冲洗，制备成饲养层细胞。实施例3PBMC和饲养层细胞共培养1)正常人外周血PBMC的制备(按照淋巴细胞分离液试剂盒说明书进行操作，人淋巴细胞分离液ftOduct Number =LTS 1077，购自中国医学科学院生物工程研究所灏洋生物公司)；幻免疫磁珠法分选外周血⑶14+单核细胞(使用德国美天旎公司Monocyte Isolation Kit II Order no. 130-091-153，按说明书进行分离)；3)待GM-CSF、IL4_Ea. hy926饲养层细胞贴壁后，接种PBMC细胞，48h收集悬浮的细胞接种于TNF- α -Ea. hy926饲养层细胞，24h后收集悬浮细胞即为成熟的DC。图7为DC体外培养倒置显微镜观察形态学，通过图7可见诱导成熟后，显微镜下 DC的表形，加入TNF- α后，细胞大部分悬浮，胞浆透明，胞体大，细胞膜伸出的树突更加明显，细胞分布于培养板中，数量明显增加，呈典型的DC形态。图8是DC的表型变化的流式细胞分析图，DC细胞与荧光标记的单克隆抗体孵育后，流式分析其表面标志的表达，其中虚线代表同型对照组，细实线代表为刺激成熟的树突状细胞，粗实线表示刺激成熟的树突状细胞。刺激成熟后，DC表面CD32的表达减少，而 ⑶80、⑶86、⑶40这些在适应性免疫中起到共刺激作用的分子表达增加。HLA-DR表达稍有增加，⑶14的表达变化不大。
权利要求
1.一种将CD 14+单核细胞分化培养为成熟的树突状细胞的方法，所述方法包括以下步骤(1)以能分泌促进细胞成熟的细胞因子的人脐静脉内皮细胞作为饲养层细胞，培养至贴壁；(2)接种CD14+细胞，与(1)所述饲养层细胞进行共培养36-60小时；(3)收集步骤( 获得的悬浮细胞；(4)将步骤C3)获得的细胞与能分泌促进细胞分化的细胞因子并已经贴壁生长的饲养层细胞人脐静脉内皮细胞共培养12-36小时；(5)收集步骤(4)获得的悬浮细胞，即为成熟的树突状细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人脐静脉内皮细胞为Ea.hy926细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤( 中所述的能分泌促进细胞成熟的细胞因子为GM-CSF和/或IL-4。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述GM-CSF和IL-4为融合表达蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述的培养时间为48小时。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的能分泌促进细胞分化的细胞因子为TNF-α。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的培养时间为24小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD14+单核细胞分离于人外周血。
9.根据权利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述细胞因子的表达载体为慢病毒载体pBPLV。
10.根据权利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述Ea.hy926细胞在共培养之前需要经过剂量为40Gy的γ射线照射。
全文摘要
本发明提供了一种将CD 14+单核细胞分化培养为成熟的树突状细胞的方法，所述方法将CD 14+细胞分别与能分泌促进细胞成熟和分化的细胞因子的人脐静脉内皮细胞共培养，使CD 14+细胞成为成熟的树突状细胞，与传统方法相比，本发明具有经济、快速、可以大量培养的特点及优势。
文档编号C12N5/0786GK102443568SQ20101050831
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月15日 优先权日2010年10月15日
发明者乔志新, 于群, 冯秋月, 张公庆, 李伟静, 杨晓琮, 王婧, 王璇琳, 石晓月, 程宏, 贺敏 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所