专利名称：一种用于扩增hsv-1碱性核酸酶基因的试剂盒和表达hsv-1碱性核酸酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种获得病毒蛋白的方法，具体涉及一种用PCR技术扩增HSV-I碱性 核酸酶基因，通过基因表达得到HSV-I碱性核酸酶的方法。
背景技术：
单纯疱疹病毒I型(HSV-I)为有包膜的DNA病毒，是危害人类健康的常见病原体， 且容易导致复发性感染和潜伏感染。HSV-I感染部位广泛，能引起口唇疱疹、生殖器疱疹、脑 炎、角膜炎等，并与宫颈癌和唇癌有关。HSV-I具有神经毒性，可侵犯中枢神经系统、破坏神 经细胞。碱性核酸酶是由HSV-I基因组中UL12基因编码的，其具有5' 3'的核酸外切 酶和核酸内切酶活性，因其反应最适PH值较高，所以被认为是碱性核酸酶。其在HSV-I的 复制中起着重要作用，有研究证实碱性核酸酶能正确修复DNA复制过程中的断裂和缺口， 并能使处于复制状态的病毒基因组易于包装。该编码基因被敲除后HSV-I突变体复制几乎 停止，说明碱性核酸酶为病毒体内繁殖所必需。还有实验证明，在非容纳细胞中产生的UL12 基因缺陷病毒，由于基因异常而很难感染新的细胞。上述研究证明碱性核酸酶在病毒复制 及感染过程中非常关键，对于阐述抗HSV-I药物作用机理以及建立一种新的干预手段提供 了思路，也为碱性核酸酶成为一种新的抗HSV-I药物筛选靶点提供了证据。因此，纯化得到 大量碱性核酸酶非常重要。然而，因UL12基因片段长，GC含量高，难以通过常规的PCR方法方便、准确地获得 全序列的UL12基因片段，进而获得大量纯化且有活性的碱性核酸酶。文献Purification and Characterization of Herpes Simplex Virus Type 1 Alkaline Exonuclease Expressed in Escherichia coli. JOURNAL OF VIROLOGY. 1996 (3) :2008_2013 中，报道了 以基因工程方法获得碱性核酸酶的方法从HSV-I基因组中分离4. 3kb的HindIII-PstI片 段；将该片段克隆到PUC19中构建pHP-AE ；通过三次亚克隆最终将目的基因片段插入表达 质粒pET-25b(+)中；将表达质粒转化至大肠杆菌诱导表达；变性复性获得活性蛋白。该方 法的技术方案复杂，且难以获得大量碱性核酸酶，成本高，工业化应用困难。也未见有碱性 核酸酶的市售品。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供了用基因工程技术大量获得HSV-I碱性核酸酶的 方法。因此，本发明目的之一是提供一种用于扩增UL12基因片段的试剂盒，包括核苷酸 序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物对1和其他相关试剂。该试剂盒优选还包含T载体。本发明另一个目的是提供一种表达获得有活性的碱性核酸酶的方法，其步骤如 下
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(1)扩增目的基因提取HSV-I病毒基因组作为模板，以SEQ ID NO :1 2所示的 核苷酸序列作为引物扩增HSV-I的UL12基因片段，扩增程序为96°C预变性3min，95°C变 性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31个循环，72°C延伸IOmin ；胶回收扩增的UL12基 因片段；(2)构建重组质粒将获得的UL12基因片段与表达质粒连接，获得重组表达质 粒；(3)诱导表达将步骤(2)获得的重组表达质粒转化大肠杆菌；培养含有重组表达 质粒的大肠杆菌使其复制至处于对数期；加入异丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表 达；离心收集菌体；(4)变性破碎步骤(3)获得的菌体，离心收集沉淀，用包含变性剂的洗涤液洗涤 沉淀，获得蛋白溶液；(5)复性用复性液复性步骤(4)获得的蛋白溶液，获得活性蛋白。上述步骤(1)所述扩增目的基因的方法优选为提取HSV-I病毒基因组作为模板， 以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作为引物扩增HSV-I的UL12基因片段，扩增程序 为96°C预变性3min，95°C变性40s, 68 72°C退火延伸2min30s，31个循环，72°C延伸 IOmin ；胶回收扩增的UL12基因片段；将扩增得到的UL12基因片段与T载体连接形成重组 T载体，再以该重组T载体为模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作为引物进一步 扩增得到核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示的UL12目的基因片段，扩增条件不变。所述退 火、延伸温度均优选为68 °C。上述步骤(2)中表达质粒为pET系列质粒，优选为pET32a_UL12或者pET28a_UL12 质粒。上述步骤(3)中大肠杆菌为E. coli BL12菌株，或者为E. coli Rosetta菌株。上述步骤(4)中变性采用的方法为用洗涤液A两次洗涤步骤(3)获得的菌体；冷冻超声破碎菌体，离心收集沉淀； 用洗涤液B、C、D依次洗涤、离心、收集沉淀；用洗涤液E洗涤沉淀，获得蛋白溶液；所述的洗涤液A 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA, IOOmMNaCl 的溶液；洗涤液B:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、1 % NP40 (乳化剂 NP40系列)的溶液；洗涤液C:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、3% TritonX-100、 ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗涤液D:包含 50mM Tris-HCl [pH8.0]、2mM EDTA、100mM NaCl、0· 5 % TritonX-lOOU. 5M盐酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗涤液E 包含 IOOmM Tri s-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、100mM NaClUOmM β-巯基乙 醇、ImM苯甲基磺酰氟和4 6Μ盐酸胍的溶液。其中盐酸胍浓度优选为4Μ。上述步骤(5)中复性液为包含50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、50mM NaCl,5% 甘油1 %甘氨酸和盐酸胍浓度逐步减小的溶液，所述盐酸胍浓度依次为4M、3M、2M、IM和0M。本发明的优点克服了现有技术的障碍，准确扩增了片段长度达1881bp，GC含量 高于71%的UL12基因片段，得到序列与GeneBank已公布序列同源性高达98. 2%。通过构 建表达质粒、诱导表达、变性和复性一系列步骤得到具有较高核酸内切酶和核酸外切酶活
5性的碱性核酸酶。这为进一步阐明药物作用机制有十分重要的意义，且为体外构建碱性核 酸酶的药物筛选分子模型奠定了实验基础。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
图1实施例1中扩增得到的UL12基因片段凝胶电泳结果。泳道M =DNA Marker DL2000 ；泳道1 :UL12基因；泳道2 :UL12基因。图2进一步扩增得到的UL12基因片段的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1为DL2，000DNA Marker,作为标记；泳道2为用EcoR I/Hind III切割纯化重组pMD19T载体；泳道3为 用 EcoR I/Hind III 切割纯化 pET28a_UL12 ；泳道 4 是空载质粒 pET28a(+)，用 EcoR I/ Hind III处理后作为对照；泳道5为没有酶切处理的pET28a-UL12 ；泳道6为λ-Hind III digest DNAMarker,作为标记。图3进一步扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的UL12基因片段送大连 宝公司测序的彩色波形图。图3a中第259 1个碱基对应已在GenBank上公布的核苷酸 序列如SEQ ID NO :4所示的HSV-117毒株基因序列中第1 259个碱基，且为互补碱基； 图3b中第663 1个碱基对应已在GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示的 HSV-117毒株基因序列中第178 835个碱基，且为互补碱基；图3c中1 703个碱基对 应已在GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的HSV-117毒株基因序列中第 774 1476个碱基；图3d中第1 436个碱基对应已在GenBank上公布的核苷酸序列如 SEQ ID NO 4所示的HSV-117毒株基因序列中第1447 1881个碱基。图4进一步扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示的UL12基因片段序列与 核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的标准国际株序列对比结果。每一小组为3列，第一列为 GenBank上公布的核苷酸序列如SEQ IDNO 4所示的HSV-117毒株基因序列的UL12基因序 列，即国际标准UL12基因序列，第二列为本发明扩增得到的UL12基因序列，即实测UL12基 因序列，第三列为第一列和第二列的共有序列。图5不同诱导表达时间对表达量影响的结果图。泳道3至泳道8对应诱导时间为 10h，8h，6h，4h，3h，0h。泳道2和泳道10作为对照，未添加IPTG，表达时间IOh0蛋白质分 子量标准(低)，在泳道1和泳道9，作为标记。图6pET32a-UL12的E. coli BL21转化子表达结果图。泳道1为pET32a_UL12的 E. coli BL21转化子IPTG诱导后的细菌总蛋白；泳道2为pET32a的E. coli BL21转化子 IPTG诱导后的细菌总蛋白；泳道3为pET32a-UL12的E. coli BL21转化子IPTG诱导后的细 菌培养液上清；泳道4为pET32a的E. coli BL21转化子IPTG诱导后的细菌培养液上清；泳 道5为蛋白质分子量标准(低)，作为标记；泳道6为IPTG诱导后pET32a-UL12的E. coli BL21转化子经超声裂解后的上清；泳道7为IPTG诱导后pET32a的E. coli BL21转化子经 超声裂解后的上清；泳道8为pET32a-UL12的E. coliBL21转化子经IPTG诱导后经超声裂 解后的沉淀；泳道9为pET32a的E. coliBL21转化子经IPTG诱导后经超声裂解后的沉淀。图7pET28a_UL12的E. coli BL21转化子表达结果图。泳道1为蛋白质分子量标准(低)，作为标记；泳道2为pET28a的E. coli BL21转化子IPTG诱导后的细菌总蛋 白；泳道3为pET28a-UL12的E. coli BL21转化子IPTG诱导后的细菌总蛋白；泳道4为 pET28a的E. coli BL21转化子经IPTG诱导后经超声裂解后的沉淀；泳道5为pET28a_UL12 的E. coli BL21转化子经IPTG诱导后经超声裂解后的沉淀；泳道6为IPTG诱导后pET28a 的E. coliBL21转化子经超声裂解后的上清；泳道7为IPTG诱导后pET28a_UL12的E. coli BL21转化子经超声裂解后的上清。图8不同洗涤液变性处理后，碱性核酸酶存在形式鉴定图。泳道1是用变性剂A 和变性剂C处理后的上清液；泳道2是经过变性剂A和变性剂B处理后的上清液；泳道3是 用变性剂A、B、C、D和E处理后的沉淀，且变性剂E中盐酸胍的浓度为4M ；泳道4是用变性 剂A、B、C、D和E处理后的沉淀，且变性剂E中盐酸胍的浓度为6M ；泳道5是蛋白质分子量 标准(低)，作为标记；泳道6是经过变性剂A和变性剂B处理后的沉淀；泳道7是用变性 剂A和变性剂C处理后的沉淀。图9碱性核酸酶活力测定的结果图。E. coli BL21和E. coli Rosetta产生的碱 性核酸酶对pcDNA3. O质粒进行酶切反应的结果泳道M λ Hind IIIdigest DNA Marker ； 泳道1 :pcDNA3. O对照；Ε. coli Rosetta表达的碱性核酸酶与pcDNA3. O反应于37°C孵育 5min (泳道 2)，20min (泳道 4)，40min (泳道 6)，60min (泳道 8) ；E. coli BL21 表达的碱性核 酸酶与pcDNA3. O反应于37 0C孵育5min (泳道3)，20min (泳道5)，40min (泳道7)，60min (泳 道9)。
具体实施例方式实验材料和仪器以下实施例中所用实验材料和仪器，除特别说明，均为市售购买。(1)材料标准单纯疱疹病毒I型(HSV-I) SM44株，购自中国生物制品检定所；Vero细胞购于四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室；E.coli BL12(DE3)plysS 菌株、Ε· coli Rosetta(DE3)、原核表达载体 pET32a(+)、 pET28a (+)，购自 Novagen 公司；高保真Taq 酶、T4DNA 连接酶、DL2, OOODNA Marker、λ -Hind III digestDNAMarker、蛋白质分子量标准(低)、限制性内切酶EcoR I和HindIII, E. coli JM109 菌株、pMD19-T 载体、dNTPs、LA Taq 酶、GC buffer, EDTA, NP-40、TritonX-100，购于 大连TaKaRa公司；核酸测序由大连TaKaRa公司完成；盐酸胍、异丙基硫代-β -D半乳糖苷(IPTG)为美国AMRESC0产品；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，购自美国OMEGA公司；核苷酸序列如SEQ ID NO 1 2所示的引物或者核苷酸序列，由上海Sangon Biotech公司合成；RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司、LB培养基购自英国0X0ID公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)，购自Sigma公司；ddH20、MgCl2,乙醇、PBS 缓冲液、Tris-HCl 缓冲液、NaCl、甘油、甘氨酸、SDS-PAGE
7和琼脂糖凝胶电泳的各种常规试剂。(2)仪器PCR仪，购自美国Thermo公司；紫外可见分光光度计，购自美国Bio-Rad公司；电热恒温培养箱为青岛海尔的产品；超滤管，购自美国MILLIP0RE公司；离心机，购自德国Eppendorf公司；超声细胞破碎仪。实施例1扩增UL12基因片段(1)提取病毒基因组用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养vero细胞，接 种HSV-I待细胞病变，即CPE达到+++ ++++，收获细胞，用病毒DNA抽提试剂盒抽提HSV-I 全基因组；(2)依据GenBank公布的UL12基因片段的核苷酸序列，用PRIMER5. O软件设计引 物，引物序列如SEQ ID NO :1 2所示；(3)扩增目的基因以提取得到的HSV-I全基因组为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示引物对1为引物，扩增目的基因UL12基因片段反应体系模板Ιμ 核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示引物1 μ 1核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示引物1 μ 1GC buffer12. 5μ 1dNTP2 μ 1LAtaq 酶0. 25 μ 1ddH207· 25 μ 1反应条件96°C预变性3min，95°C变性40s，68°C退火延伸2min30s，31个循环， 72°C延伸 IOmin0(4)产物回收0. 8%常规琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，以胶回收试剂盒回收扩 增产物。凝胶电泳结果显示扩增得到的DNA片段为1881bp，与已知UL12基因片段大小相 同。(结果见图1)实施例2进一步扩增UL12基因片段(1)制备模板在T4DNA连接酶作用下将实施例1得到的UL12基因片段与pMD-19T 载体连接，构建成重组PMD19T载体。(2)扩增目的基因以步骤(1)得到的连接有UL12基因片段的重组pMD19T载体为 模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO :1 2所示引物对为引物扩增目的基因UL12基因片段反应体系模板1 μ 1核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示引物 1 μ 1核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示引物 1 μ 1
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GC buffer
12. 5μ 1 2μ 1dNTP 为LAtaq 为(！卿为
0. 25μ 1 7. 25 μ 1反应条件96°C预变性3min，95°C变性40s，68°C退火延伸2min30s，31个循环， 72°C延伸 IOmin0(3)产物回收0. 8%常规琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，以胶回收试剂盒回收扩 增产物。(4)结果检测将胶回收得到的UL12基因片段与pMD_19T载体连接，构建成重组 PMD19T载体，琼脂糖凝胶电泳并测序检验扩增得到的UL12基因片段。结果如图2、图3和图4。图2显示凝胶电泳结果显示扩增得到的DNA片段大约 为1.9kb，与已知UL12基因片段大小相同。图3为核苷酸序列测序的彩色波形图，证明通过 本发明方法扩增得到了核苷酸序列如SEQID N0:3所示的UL12基因片段。图4为本发明扩 增得到的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12基因片段序列与标准国际株UL12基因片 段序列对比结果，从图4可知，核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12实测序列核苷酸 序列如SEQ ID NO 4所示的UL12标准国际株序列=1866/1881 = 99. 20%，也就是说，本 发明扩增得到的核苷酸序列如SEQ IDNO :3所示的UL12基因片段与核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示的标准国际株序列的同源性为99. 20%，证明本发明准确地扩增了 UL12目的基因 片段。实施例3碱性核酸酶的表达和存在形式的鉴定(1)重组表达质粒构建将实施例1或者实施例2得到的UL12基因片段在EcoRI、HindIII内切酶作用下 与pET28a(+)质粒或者pET32a(+)连接形成pET28a_UL12重组表达质粒或者pET32a_UL 12 重组表达质粒，构建的重组质粒含有T7RNA聚合酶启动子，控制碱性核酸酶的表达，并包含 有2个His标签，可以用来纯化蛋白。(2)重组表达质粒在大肠杆菌BL21中诱导表达将步骤(1)得到的pET28a_UL 12重组表达质粒通过CaCl2介导转化至E. coli BL21感受态细胞，37°C培养于含有50μ g/ml卡拉霉素的LB培养板上，220r/min振摇过夜；挑取获得重组表达质粒的大肠杆菌克隆；将大肠杆菌克隆直接接种到50ml含有50 μ g/ml卡拉霉素的LB培养基中，在37°C 摇瓶培养，直到0D600值为0. 4 0. 6 ；加入终浓度为0. 5mM IPTG进行诱导，在37°C摇瓶1 10小时后，离心收集菌体。(3)重组表达质粒在大肠杆菌Rosetta中诱导表达将步骤(1)得到的pET32a_UL 12重组表达质粒通过CaCl2介导转化至E. coli Rosetta感受态细胞，37°C培养于含有30 μ g/ml氨苄青霉素和34 μ g/ml的氯霉素LB培养 板上，220r/min振摇过夜培养；挑取获得重组表达质粒的大肠杆菌克隆；将大肠杆菌克隆直接接种到50ml含有30 μ g/ml氨苄青霉素和34 μ g/ml的氯霉 素的LB培养基中，在37°C摇瓶培养，直到OD6tltl值为0. 4 0. 6 ；
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加入终浓度为0. 5mM IPTG进行诱导，在37°C摇瓶1 10小时后，离心收集菌体。将诱导结果进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5显示，泳道3 8中目的蛋白条带依 次减弱，也就是随着诱导时间的减少，其蛋白表达量逐渐降低。因此，确定最优的诱导时间 为 IOh0(4)碱性核酸酶存在形式的鉴定将步骤(2)或者(3)所得菌体，加500 μ 1 PBS溶液重悬，50 μ 1菌液留样，其余菌 液进行超声破碎(3min，400w)，冷冻离心(4°C，12000rmp, 15min)，分别收集上清和沉淀，沉 淀用PBS重悬。菌液留样、上清和沉淀各加等体积2XSDS加样缓冲液，100°C加热5min变 性，取样用12% SDS-PAGE检验，发现重组碱性核酸酶存在于包涵体中。结果如图6和图7 所示。已知碱性核酸酶大小为86kDa，图6显示pET32a-UL12的E. coli BL21转化子表达结 果；图7显示pET28a-UL12的E. coli BL21转化子表达结果。图6泳道1显示pET32a_UL12的E. coli BL21转化子IPTG诱导后的细菌总蛋白； 泳道6显示IPTG诱导后pET32a-UL12的E. coli BL21转化子经超声裂解后的上清；泳道8 显示pET32a-UL12的E. coli BL21转化子经IPTG诱导后经超声裂解后的沉淀(包涵体)。 泳道1和泳道8中有大小为86kD的目的条带，而在其他泳道则没有。结果证明，目的蛋白 存在于重组质粒的大肠杆菌转化子菌液和经超声裂解后的沉淀中，也就是说，目的蛋白以 包涵体的形式存在，用Bio-Rad公司提供的Quantity One图像分析软件对图6第1泳道的 目的蛋白表达量进行分析，碱性核酸酶表达量占菌体总蛋白的17.4% .图7泳道3显示pET28a-UL12的E. coli BL21转化子IPTG诱导后的细菌总蛋白； 泳道5显示pET28a-UL12的E. coli BL21转化子经IPTG诱导后经超声裂解后的沉淀(包 涵体)；泳道7显示pET28a-UL12的E. coli BL21转化子经超声裂解后经IPTG诱导后的上 清。泳道3和泳道5中有大小为86kD的目的条带，而在其他泳道则没有。结果证明，目的 蛋白存在于重组质粒的大肠杆菌转化子菌液和经超声裂解后的沉淀中，也就是说，目的蛋 白以包涵体的形式存在，用Bio-Rad公司提供的Quantity One图像分析软件对图7第3泳 道的目的蛋白表达量进行分析，碱性核酸酶表达量占总表达量28%以上。实施例4碱性核酸酶的变性、复性和活力测定(1)变性1)将实施例3步骤⑵或者(3)所得菌体用5ml洗涤液A(50mMTris-HCl [pH8. 0]、 2mM EDTAUOOmM NaCl)洗两次；2) 4°C下，收集细菌在冰浴上经过4min超声处理，破碎细胞，得到菌液；3)4°C 下，用 5ml 洗涤液 B(50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaClU % NP-40,即乳化剂NP-40系列)的超声洗涤菌液；4)4°C下，12000rpm 离心 15min，收集沉淀；5)4°C 下，用 5ml 洗涤液 C(50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、3% TritonX-IOOUmM PMSF,即甲基磺酰氟)超声洗涤沉淀；6) 12000rpm 离心 15min，收集沉淀；7)41下，用51111洗涤液0(501111 Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTA, IOOmM NaCl、0· 5% TritonX-lOOU. 5Μ盐酸胍和ImM PMSF)超声洗涤沉淀；8) 12000rpm 离心 15min，收集沉淀；
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9)用 5ml 洗涤液 E(4M 或者 6M 盐酸胍、IOOmM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、10mM β巯基乙醇、和ImM PMSF)洗涤沉淀；10)收集上清在-80°C保存，蛋白质浓度用Bio-Rad分光光度计进行测量。变性最优条件如图8所示，当洗涤液E中的盐酸胍浓度为4M时，处理后的沉淀几 乎没有目标蛋白，目标蛋白溶于洗涤液，非常有利于复性。(2)复性取Iml步骤(1)得到的蛋白溶液，用复性液(50mMTr i s-HCl [pH8. 0],2mM EDTA, 50mM NaCl、5 %甘油、1 %甘氨酸和浓度递减的盐酸胍，盐酸胍的浓度依次为4M、3M、2M、IM和 0M)将其稀释到0. 1-lmg/ml，在透析袋中复性，复性时间为24h，最后用超滤管(4500rpm， 10min,4°C )离心收集复性蛋白溶液，放置-20°C冰箱保存。(3)活力检测取步骤⑵得到的复性蛋白溶液稀释到0. 12mg/ml，用pcDNA3. 0质粒或者线性 UL12基因片段作为底物，进行酶活性测定。反应体系为6. 5 μ 1 200mM Tris-HCl [pH = 9. 0]1. 5μ 1 50mM MgCl22μ 1 pcDNA3. 0 质粒15 μ 1 ddH2010 μ 1 复性蛋白溶液反应条件37°C，5/20/40/60min。反应相应时间后取出5μ 1反应液，用1μ 1 6 X Loading Buffer终止反应，放 于-20°C冰箱，取样做琼脂糖凝胶电泳检验。pcDNA3. 0质粒用于检测碱性核酸酶的外切酶活性，线性UL12基因片段用于检测 碱性核酸酶的内切酶活性。结果如图9所示，本发明得到的碱性核酸酶可以有效的降解核酸，酶活性比较高， 且反应时间为60min时，降解效果最好。综上所述，实验证明本发明提供的方法操作简便、成本低廉，得到的产品活性较高 且量大，为碱性核酸酶工业化生产提供了可能。
1权利要求
一种用于扩增单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶基因片段UL12的试剂盒，包含核苷酸序列如SEQ ID NO1～2所示的引物对和其他相关试剂。
2.根据权利要求1所述的用于扩增单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶基因片段UL12的试 剂盒，其特征在于还包含T载体。
3.根据权利要求2所述的用于扩增单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶基因片段UL12的试 剂盒，其特征在于所述T载体为pMD19-T载体。
4.一种表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其特征在于包括如 下步骤(1)扩增目的基因提取单纯疱疹病毒I型病毒基因组作为模板，以SEQID NO :1 2 所示的核苷酸序列作为引物扩增HSV-I的UL12基因片段，扩增程序为96°C预变性3min， 95°C变性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31个循环，72°C延伸IOmin ；胶回收扩增的 UL12基因片段；(2)构建重组质粒将获得的UL12基因片段与表达质粒连接，获得重组表达质粒；(3)诱导表达将步骤(2)获得的重组表达质粒转化大肠杆菌；培养含有重组表达质粒 的大肠杆菌使其复制至处于对数期；加入异丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶诱导表达；离心收 集菌体；(4)变性破碎步骤(3)获得的菌体，离心收集沉淀，用包含变性剂的洗涤液洗涤沉淀， 获得蛋白溶液；(5)复性用复性液复性步骤(4)获得的蛋白溶液，获得活性蛋白。
5.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其 特征在于步骤(1)所述扩增目的基因的方法为提取单纯疱疹病毒I型病毒基因组作为 模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作为引物扩增HSV-I的UL12基因片段，扩增 程序为96°C预变性3min，95°C变性40s，68°C 72°C退火延伸2min30s，31个循环，72°C延 伸IOmin ；胶回收扩增的UL12基因片段；将扩增得到的UL12基因片段与T载体连接形成重 组T载体，再以该重组T载体为模板，以SEQ ID NO :1 2所示的核苷酸序列作为引物进一 步扩增得到核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的UL12目的基因片段，扩增条件不变。
6.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其 特征在于所述退火、延伸温度均为68°C。
7.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其 特征在于步骤(2)中表达质粒为pET系列质粒。
8.根据权利要求9所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其 特征在于所述表达质粒为pET32a-UL12或者pET28a_UL12质粒。
9.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其 特征在于步骤(3)中大肠杆菌为E. coli BL12菌株，或者为E. coli Rosetta菌株。
10.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其 特征在于步骤(4)中变性采用的方法为用洗涤液A两次洗涤步骤(3)获得的菌体；冷冻超声破碎菌体，离心收集沉淀；用洗涤 液B、C、D依次洗涤、离心、收集沉淀；用洗涤液E洗涤沉淀，获得蛋白溶液；所述的洗涤液 A 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmMNaCl 的溶液；洗涤液 B 包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl U % NP40 的溶液； 洗涤液 C:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl,3% TritonX-IOOUmM 苯甲基磺酰氟的溶液；洗涤液 D:包含 50mM Tris-HCl [ρΗ8· 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、0. 5 % TritonX-100、 1. 5M盐酸胍、ImM苯甲基磺酰氟的溶液；洗涤液E 包含 IOOmM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTAUOOmM NaCl、10mM β -巯基乙醇、ImM 苯甲基磺酰氟和4 6Μ盐酸胍的溶液。
11.根据权利要求10所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法， 其特征在于所述洗涤液E中盐酸胍浓度为4Μ。
12.根据权利要求4所述的表达获得有活性的单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶的方法，其 特征在于步骤(5)中复性液为包含 50mM Tris-HCl [pH8. 0]、2mM EDTA、50mM NaCl、5%甘 油、甘氨酸和盐酸胍浓度逐步减小的溶液，所述盐酸胍浓度依次为4M、3M、2M、1M和0M。
全文摘要
本发明提供了一种用于扩增单纯疱疹病毒I型碱性核酸酶基因片段UL12的试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO1～2所示的引物对和其他相关试剂。本发明还提供一种利用前述试剂盒获得具有生物活性的HSV-1碱性核酸酶的方法。本发明以基因工程的方法获得大量生物性活性较高的HSV-1碱性核酸酶，为进一步寻找抗病毒药物以及阐明药物作用机制有十分重要的意义，也体外构建HSV-1碱性核酸酶的药物筛选分子模型奠定了实验基础。
文档编号C12N9/22GK101979538SQ201010508268
公开日2011年2月23日 申请日期2010年10月15日 优先权日2010年10月15日
发明者代富英, 张磊, 曹康, 郭洪秀, 陈恬 申请人:成都医学院