从血液中分离、培养细胞的方法及进行克隆非人动物的方法
【专利摘要】本发明提供了一种从血液中分离、培养细胞的方法以及一种对非人动物进行克隆的方法。所述从血液中分离、培养细胞的方法包括以下步骤：将所述血液加入到分离液上层后利用密度梯度离心的方式进行离心，以便获得单个核细胞；将所述单个核细胞接种于含有贴壁细胞培养基的体外培养设备，以便获得贴壁细胞；以及将所述贴壁细胞进行传代培养，以便获得体细胞核移植的供体细胞。该方法获得的体细胞核移植的供体细胞可以直接用于手工克隆非人动物，不仅操作过程简单、易于实现、成本较低，且该方法对动物应激刺激少、伤害小，可以保证动物的完整外观、改善动物福利。
【专利说明】从血液中分离、培养细胞的方法及进行克隆非人动物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及从血液中分离、培养细胞的方法及克隆非人动物的方法。
【背景技术】
[0002]体细胞核移植又称克隆，是动物细胞工程最常用的技术手段。通过电击法或直接显微注射法将分化程度较高的体细胞转移至卵母细胞中，再经过化学激活，使其重新编程发育成胚胎，将其移植回代孕母体内，出生完整个体。传统的体细胞核移植技术需要昂贵、精密的显微操作系统，对操作人员的技术要求很高，不适用于大规模的克隆动物生产。
[0003]2001年，丹麦科学家Gabor Vajta首次提出了手工克隆技术，该技术最大的关键点是利用刀片实现“切割去核”，从而完全摆脱显微操作系统，降低了克隆这项技术的仪器投入以及人工支出成本，使克隆这项技术应用于未来的产业化成为可能。目前体细胞核移植的囊胚率在20%-30%之间，而手工克隆动物囊胚率能提高至40%-60%。
[0004]由此，目前用于体细胞移植的供核细胞来源仍有待改进。
【发明内容】
[0005]本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。
[0006]本发明是发明人基于如下事实发现的:近年来，克隆动物越来越具有其广阔的应用前景，例如可用于优质畜种的培育，以有利于濒危动物种质资源保存；生产各类实验动物，由此获得实验动物具有遗传物质均一性、表型一致性等特点，更适用于药理学各项研究；将克隆运用于转基因，可高效率得到转基因动物，缩短实验周期，大量获得转基因动物。在体细胞核移植的过程中，供体细胞种类繁多，包括具有多潜能性的胚胎干细胞、脂肪间充质干细胞，以及终端分化细胞成纤维细胞、肝细胞、颗粒细胞、肝脏细胞等。胚胎干细胞来源于囊胚期的内细胞团，在饲养层细胞上培养可超过上百代，但是操作繁琐，不适于大规模建系传代，并且由于其来源的特殊性，无法得到成体动物的相关信息，对于优质种系克隆具有一定局限性；而骨骼来源的间充质干细胞贴壁细胞，主要是通过分离动物股骨中的骨髓而得到目标细胞，但采用此方法收集的样品，需要将动物先处死以方便进行采集；其它来源的用于供核细胞，在不同程度上都会对动物个体造成组织、器官创伤。目前成纤维是最为常用的克隆体细胞类型，但是对于猪、牛、羊等大动物，基本都是采集其耳缘组织在体外进行原代培养，但是由于其本身的生长环境因素等原因，样品采集很难保证无菌，后期在体外培养制备过程中细菌、真菌污染的概率很高。
[0007]为此，本发明的一个目的在于提出一种对动物的应激刺激少、伤害小，保证动物外观完整的从血液中分离、培养细胞的方法。该方法包括以下步骤:将所述血液加入到分离液上层后利用密度梯度离心的方式进行离心，以便获得单个核细胞；将所述单个核细胞接种于含有贴壁细胞培养基的体外培养设备，以便获得贴壁细胞；以及将所述贴壁细胞进行传代培养，以便获得体细胞核移植的供体细胞。通过根据本发明实施例的从血液中提取、培养细胞的方法制备的体细胞核移植的供体细胞用于手工克隆体细胞核移植，囊胚效率在最高可达55%，平均囊胚率在40%左右。由此，根据本发明实施例的从血液中分离、培养细胞的方法不仅操作过程简单、易于实现、成本较低，且该方法对动物应激刺激少、伤害小，可以保证动物的完整外观、改善动物福利。
[0008]另外，根据本发明实施例的从血液中分离、培养细胞的方法还可以具有如下附加的技术特征:
[0009]根据本发明的实施例，所述血液来自外周血。由于外周血采集操作相对简单、对动物应激刺激少、伤害小，由此不仅可以改善动物福利，且血液与外界相对较为封闭，后期细胞培养污染率基本为零，提高了细胞成活率。
[0010]根据本发明的实施例，所述分离液为中性粒细胞分离液。由此，可以有效地通过利用密度梯度离心的方式将血液中的各种细胞成分按照密度的大小进行分离，经过离心操作血液被分为若干层，每层中含有不同的血液细胞成分，从而有效地得到单个核细胞。
[0011]根据本发明的实施例，所述中性粒细胞分离液的密度为1.077g/mL，其中，所述中性粒细胞分离液含有57g/L聚蔗糖和90g/L泛影酸钠。由此，含有上述成分的中性粒细胞分离液提高了分离血液中不同细胞成分的分离效率，从而可以有效地从其中单核细胞层获得血液中的单个核细胞。
[0012]根据本发明的实施例，所述单个核细胞是从所述分离液离心后中间层收集的。利用密度梯度离心的方式将血液加入上述分离液中进行离心分离后，血液在上述分离液中被分为若干层，每层中分别含有不同细胞成分，由此，可以直接从中间层收集单个核细胞，不仅实验操作过程简单、易于实验，且分层后的每层中的细胞成分单一，由此提高了单个核细胞的分离效率。
[0013]根据本发明的实施例，将所述单个核细胞接种于含有贴壁细胞培养基的体外培养设备，以便获得贴壁细胞进一步包括:首先，将用PBS清洗后的单个核细胞利用第一贴壁细胞培养基在37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养48小时,所述第一贴壁细胞培养包括低糖-MEM、15%FBS、I X非必需氨基酸、10ng/mL的bFGF和30IU/mL肝素；接着，将培养基更换为第二贴壁细胞培养基继续在37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养，所述第二贴壁细胞培养基包括MEM- a、15%FBS、I X非必需氨基酸和10ng/mL的bFGF。由此，经过分离的单个核细胞可以首先在适宜的营养条件下进行初步适应性体外培养，该单个核细胞经过含有低糖-MEM的第一贴壁细胞培养基培养48小时后，将培养基更换为含有MEM- α的第二贴壁细胞培养基继续培养，从而可以得到贴壁性良好的细胞，并且显微镜下呈长梭形成长，其细胞核较大，生长较快，因此适合用于手工克隆体细胞核移植实验。
[0014]根据本发明的实施例，所述体外培养设备是明胶包被的培养皿或明胶包被的培养板。由于，明胶是是多细胞生物的细胞外基质的主要结构成份，可以促进细胞的贴壁和增殖、特异性形态和功能表达，常用于各种细胞的原代细胞的体外培养。由此不仅可以提高单个核细胞在培养设备中的贴壁效率，并且与其它促贴壁类试剂相比，实验成本较低。
[0015]根据本发明的实施例，将所述贴壁细胞进行传代培养进一步包括，将所述贴壁细胞传代培养2-20代。由此，可以将处于对数生长期、活性良好、细胞核较大的单个核细胞进一步用于手工克隆体细胞核移植实验。
[0016]本发明的另一目的在于提供一种对非人动物进行克隆的方法，包括:利用上述从血液中分离、培养细胞的方法，制备体细胞移植的供体细胞；以及基于所述体细胞核移植的供体细胞，通过手工克隆，进行克隆非人动物。由此，可以利用根据本发明实施例的上述从血液中分离、培养的细胞，通过手工克隆，获得非人动物。由于通过根据本发明实施例的从血液中分离、培养细胞的方法不仅实验操作过程简单、易于实现、成本较低，且该方法对动物应激刺激少、伤害小，可以保证动物的完整外观、改善动物福利，因此将获得的体细胞核移植的供体细胞用于非人动物克隆具有广阔的应用前景。
[0017]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0019]图1为根据本发明实施例的从血液中分离、培养细胞的方法示意图。
[0020]图2为根据本发明实施例的利用从血液中分离培养的细胞进行非人细胞克隆的方法示意图。
[0021]图3显示了根据本发明实施例的猪前腔静脉密度梯度分离后培养7d后通过200倍相差显微镜观察到的细胞图。
[0022]图4显示了根据本发明实施例的猪前腔静脉密度梯度分离后培养7d后通过200倍相差显微镜观察到的细胞图，其中部分细胞呈接触抑制生长。
[0023]图5显示了根据本发明实施例的从血液中分离细胞进行贴壁培养传代至Pl代通过100倍相差显微镜观察到的细胞图。
[0024]图6显示了根据本发明实施例的从血液中分离细胞进行贴壁培养传代至Pl代通过200倍相差显微镜观察到的细胞图。
[0025]图7:显示了根据本发明实施例的将分离、培养的细胞用于体细胞核移植，第5天通过100倍霍夫曼显微镜观察到的囊胚形态图。
[0026]图8:显示了根据本发明实施例的流式细胞分析结果图:
[0027]8A为表面标记了⑶29的卵母细胞的流式细胞结果图；
[0028]8B为表面标记了⑶90的卵母细胞的流式细胞结果图；
[0029]8C为表面标记了⑶34的卵母细胞的流式细胞结果图；
[0030]8D为表面标记了⑶45的卵母细胞的流式细胞结果图。
[0031]图9为根据本发明实施例的方法基于本发明实施例的体细胞核移植的供体细胞，并通过手工克隆得到的非人动物。
【具体实施方式】
[0032]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0033]此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0034]本发明是发明人基于如下事实发现的:近年来，克隆动物越来越具有其广阔的应用前景，例如可用于优质畜种的培育，以有利于濒危动物种质资源保存；生产各类实验动物，由此获得实验动物具有遗传物质均一性、表型一致性等特点，更适用于药理学各项研究；将克隆运用于转基因，可高效率得到转基因动物，缩短实验周期，大量获得转基因动物。在体细胞核移植的过程中，供体细胞种类繁多，包括具有多潜能性的胚胎干细胞、脂肪间充质干细胞，以及终端分化细胞成纤维细胞、肝细胞、颗粒细胞、肝脏细胞等。胚胎干细胞来源于囊胚期的内细胞团，在饲养层细胞上培养可超过上百代，但是操作繁琐，不适于大规模建系传代，并且由于其来源的特殊性，无法得到成体动物的相关信息，对于优质种系克隆具有一定局限性；而骨骼来源的间充质干细胞贴壁细胞，主要是通过分离动物股骨中的骨髓而得到目标细胞，但采用此方法收集的样品，需要将动物先处死以方便进行采集；其它来源的用于供核细胞，在不同程度上都会对动物个体造成组织、器官创伤。目前成纤维是最为常用的克隆体细胞类型，但是对于猪、牛、羊等大动物，基本都是采集其耳缘组织在体外进行原代培养，但是由于其本身的生长环境因素等原因，样品采集很难保证无菌，后期在体外培养制备过程中细菌、真菌污染的概率很高。
[0035]由此在本发明的第一个方面，本发明提出了一种从血液中分离、培养细胞的方法。该方法包括以下步骤:将所述血液加入到分离液上层后利用密度梯度离心的方式进行离心，以便获得单个核细胞；将所述单个核细胞接种于含有贴壁细胞培养基的体外培养设备，以便获得贴壁细胞；以及将所述贴壁细胞进行传代培养，以便获得体细胞核移植的供体细胞。通过根据本发明实施例的从血液中提取、培养细胞的方法制备的体细胞核移植的供体细胞用于手工克隆体细胞核移植，囊胚效率在最高可达55%，平均囊胚率在40%左右。由此，根据本发明实施例的从血液中分离、培养细胞的方法不仅操作过程简单、易于实现、成本较低，且该方法对动物应激刺激少、伤害小，可以保证动物的完整外观、改善动物福利。
[0036]下面结合附图1和【具体实施方式】对本发明的从血液中分离、培养细胞的方法做进一步详细说明:
[0037]SlOl:将血液加入到分离液上层后利用密度梯度离心的方式进行离心，以便获得单个核细胞
[0038]根据本发明的实施例，分离血液中细胞的方式并不受特别限制，只要可以达到所采用的血液采集的方式对动物刺激伤害小的目的，可以采用本领域常用的血液采集方法，根据本发明一些实施例，可以通过尾静脉、耳缘静脉等方式进行血液采集，根据本发明的一个具体示例，可以从猪身上通过使用50mL的注射器直接抽取猪前腔静脉血方式提取外周血。由于外周血采集操作相对简单、对动物应激刺激少、伤害小，由此不仅可以改善动物福利，且血液与外界相对较为封闭，后期细胞培养污染率基本为零，提高了细胞成活率。
[0039]本发明的实施例，对上述获得的外周血进行保存的方式并不受特别限制，只要可以防止所采集获得的外周血在进行分离步骤前凝固，可以采用本领域常用的抗凝方式，根据本发明的具体实施例，可以采用向所采集的外周血中加入肝素进行抗凝。发明人惊奇的发现，向1mL所采集的外周血中加入125IU肝素可以有效的防止所采集的外周血凝固。此夕卜，根据本发明的实施例，加入肝素的外周血是置于4摄氏度条件下进行保存运输的。由此，不仅可以防止所采集的外周血凝固，而且可以防止外周血中的有效活性细胞成分降解，从而利于下一步的分离细胞操作。
[0040]由于血液中含有红细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、网织红细胞、浆细胞、肥大细胞、血小板、间充质细胞、成纤维细胞、脂肪细胞和网状细胞等各种细胞，因此需要将上述细胞进行分离，从其中提取体细胞核移植的供体细胞用，从而用于手工克隆。根据本发明的实施例，从血液中分离单个核细胞的方式并不受特别限制，可以采用本领域常用的各种细胞分离方式，根据本发明的具体示例，可以利用将上述所采集的外周血加入分离液上层和密度梯度离心的方法对上述外周血液进行分离。由此，可以有效地利用分离液和密度梯度离心的方式将血液中的各种细胞成分按照密度的大小进行分离，经过离心操作血液被分为若干层，每层中含有不同的血液细胞成分，从而有效地得到单个核细胞。
[0041]根据本发明的实施例，所采用的对上述外周血液进行分离的分离液并不受特别限制，根据本发明的具体示例，所述分离液为中性粒细胞分离液，所述中性粒细胞分离液的密度为1.077g/mL,并且具所述中性粒细胞分离液的具体成分为57g/L聚蔗糖和90g/L泛影酸钠。由此，含有上述成分的中性粒细胞分离液提高了分离血液中不同细胞成分的分离效率，从而可以有效地从上述经过分层外周血的单核细胞层获得血液中的单个核细胞。根据本发明的实施例，经过离心后的血液成分依据不同的密度被分为若干层，试管中从上到下的分层包括但不限于血浆层、细胞层、分离液层、中性粒细胞层、其余的分离液层和红细胞沉淀层，其中所述单个核细胞处于中间云浮状细胞层。根据本发明的实施例，收集所分离的单个核细胞的方法并不受特别限制，可以为本领域常用的各种收集方法，根据本发明的具体示例，可以采用移液吸管将中间云浮状细胞层中的单个核细胞吸取出来，并进一步对吸取出来的单个核细胞进行清洗，根据本发明的具体实施例，清洗的次数可以为2-3次。由此，可以提高对血液细胞的分离效率，从而得到高质量的单个核细胞。
[0042]S102:将单个核细胞接种于体外培养设备，以便获得贴壁细胞
[0043]根据本发明的实施例，将上述分离出并且清洗的单个核细胞接种于含有贴壁细胞培养基的体外培养设备，以便获得贴壁细胞。根据本发明的实施例，对分离出的单个核细胞进行体外培养的方式并不受特别限制，只要可以使得上述单个核细胞贴壁正常生长，可以采用本领域常用的各种体外培养方法，根据本发明的一些实施例，首先将经过清洗的单个核细胞利用第一贴壁细胞培养基在37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养48小时。根据本发明的实施例，所述第一贴壁细胞培养基的成分不受特别限制，只要含有足够的营养并且适合刚从血液分离出来的单个核细胞在体外培养设备中进行贴壁生长，可以采用本领域常用的各种贴壁培养基，根据本发明的具体实施例，所述第一贴壁细胞培养基可以包含低糖-MEM、15%FBS、[I X ]非必需氨基酸、10ng/mL的bFGF和30IU/mL肝素。根据本发明的一些实施例，48小时后将所述第一贴壁细胞培养基更换为第二贴壁细胞培养基继续在37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养，所述第二贴壁细胞培养基额可以包含MEM-a、15%FBS、[IX]非必需氨基酸和10ng/mL的bFGF。其中，根据本发明的实施例，48小时后将所述第一贴壁细胞培养基更换为第二贴壁细胞培养基的方式并不受特别限制，根据本发明的具体示例，可以先将所述第一贴壁细胞培养基弃去，然后采用PBS对细胞进行清洗以便去除残留的第一贴壁细胞培养基，再将第二贴壁细胞培养基加入到已经贴壁的单个核细胞中继续进行培养，根据本发明的实施例，清洗的次数可以为1-2次。其中，ΜΕΜ-α是一种改良的MEM培养基，添加了多种非必需氨基酸和维他命Β12、C等；而使用低糖-MEM可以促进细胞贴壁，48h后改用ΜΕΜ-α可以减少贴壁的血细胞，从而有利于贴壁的有核细胞生长。由此，经过分离的单个核细胞可以首先在适宜的营养条件下进行初步适应性体外培养(即利用含有低糖-MEM的第一贴壁细胞培养基培养48小时)，将培养基更换为更适合已经贴壁生长的含有MEM- α的第二贴壁细胞培养基继续培养，从而使得上述从外周血液中分出的单个核细胞可以在营养成分组成合适并且充足的贴壁培养基中进行适当的生长。
[0044]根据本发明的实施例，所采用的体外培养设备并不受特别限制，只要适合从血液中分离出的单个核细胞生长，可以采用本领域常用的各种培养设备并根据需要进行选择，例如35mm培养皿、60mm培养皿、10mm培养皿、6孔板和4孔板，根据本发明的具体示例，所采用的体外培养可以是明胶包被的培养皿或明胶包被的培养板。由于，明胶是是多细胞生物的细胞外基质的主要结构成份，可以促进细胞的贴壁和增殖、特异性形态和功能表达，常用于各种细胞的原代细胞的体外培养。由此不仅可以提高单个核细胞在培养设备中的贴壁效率，并且降低了实验成本。根据本发明的实施例，采用第而贴壁细胞培养基对贴壁的单个核细胞进行培养的方式并不受特别限制，根据本发明的具体示例，可以采用2-3天进行一次换液操作从而可以保持贴壁的单个核细胞始终处于营养成分适合且充足的贴壁细胞培养基中进行生长。根据本发明实施例的方法获得的单个核细胞贴壁性良好，生长较快，显微镜下呈长梭形成长，其细胞核仁较大、且清晰可见，因此适合用于手工克隆体细胞核移植(见图3)。
[0045]S103:将贴壁细胞进行传代培养，以便获得体细胞核移植的供体细胞
[0046]根据本发明的实施例，当贴壁的单个核细胞成团状接触抑制装生长时(见图4)，可以进行细胞传代培养。根据本发明的具体示例，可以将所述贴壁细胞传代培养2-20代。根据本发明的实施例，将上述呈团状接触抑制装生长的贴壁的单个核细胞进行传代培养的方式并不受特别限制，可以为本领域常用的各种传代方法，根据本发明的具体示例，可以采用如下步骤:弃去原培养基；加入PBS缓冲液润洗细胞2次；弃去PBS缓冲液后将细胞消化液加入细胞，并将细胞放置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中进行消化；加入贴壁培养基2并与经过消化的单个核细胞混合均匀，以便获得细胞悬液；将上述细胞悬液转移到经过明胶包被的培养设备中进行传代培养。通过本发明实施例的传代培养细胞的方法获得单个核细胞生长旺盛，增殖性好(见图5和图6)。其中，根据本发明的实施例，所采用的消化液并不受特别限制，在显微镜下观察只要可以使得贴壁细胞逐渐变圆变亮，并逐渐脱离细胞培养设备从而漂浮于细胞消化液中，可以采用本领域常用的各种细胞消化液，根据本发明的具体实施例，细胞消化液可以为0.05%胰酶-200mg/L EDTA0由此，可以将处于对数生长期、活性良好、细胞核较大的单个核细胞进一步用于手工克隆体细胞核移植实验。
[0047]在本发明的另一方面，本发明提供了一种对非人动物进行克隆的方法，包括:利用上述从血液中分离、培养细胞的方法，制备体细胞移植的供体细胞；以及基于所述体细胞核移植的供体细胞，通过手工克隆，进行克隆非人动物。由此，可以利用根据本发明实施例的上述从血液中分离、培养的细胞，通过手工克隆，获得非人动物。由于通过根据本发明实施例的从血液中分离、培养细胞的方法不仅实验操作过程简单、易于实现、成本较低，且该方法对动物应激刺激少、伤害小，可以保证动物的完整外观、改善动物福利，因此将获得的体细胞核移植的供体细胞用于非人动物克隆具有广阔的应用前景。
[0048]下面结合附图2和【具体实施方式】对本发明的利用从血液中分离培养的细胞进行非人细胞克隆的方法做进一步详细说明:
[0049]S201:卵母细胞体外培养以及表面分子鉴定
[0050]根据本发明的实施例，采集卵母细胞的方式并不受特别限制，只要可以得到健康的卵细胞，可以采用本领域常用的各种方法，根据本发明的具体实施例，可以包括以下步骤:将收集的卵巢放置在装有生理盐水的容器内并保持35摄氏度恒温；然后将上述卵巢放置于装有胚胎洗涤液的培养皿中，利用刀片将卵泡划破，以便使得卵细胞流出；以及将上述卵细胞收集于预先平衡的含有卵细胞培养基的培养设备中培养至卵细胞成熟。根据本发明的实施例，将卵细胞培养至成熟的条件不受特别限制，可以为本领域常用的各种卵细胞培养技术，根据本发明的具体示例，为了达到PH值相对稳定的培养环境，预先将培养基放置在5%浓度的二氧化碳培养箱进行平衡，然后将卵细胞收集于预先平衡的含有胚胎成熟培养基(IVM)四孔板中，每个孔50个胚胎，并将上述载有卵细胞的四孔版置于38.5摄氏度的二氧化碳培养箱中成熟42h。根据本发明的实施例，上述胚胎洗涤液并不受特别限制，可以是本领域常用的各种对胚胎进行洗涤的液体，根据本发明的具体示例，所采用的胚胎洗涤液(ASP)中包含:10%v/v的10XTCM199、0.17mg/mL的碳酸氢钠、0.20mg/mL的丙酮酸钠、3.60mg/mL赫佩斯钠盐、2.63mg/mL的赫佩斯酸、0.20mg/mL的谷氨酰胺、3.00 μ g/mL的两性霉素B、30IU/mL的肝素、2%的血清。由此，可以去除卵巢切割物中的碎片，从而降低所培养目的细胞的污染几率，提高细胞存活率。
[0051 ] 根据本发明的实施例，胚胎成熟培养基(IVM)并不受特别限制，可以为本领域常用的对胚胎进行培养的培养基，根据本发明的具体实例，所采用的胚胎成熟培养基(IVM)包含:[IX]的TCM199、5IU/mL的人绒毛膜促性腺激素、lIU/mL的孕马血清、0.10mg/mL的谷氨酰胺、0.05mg/mL庆大霉素、10%卵泡液、10%v/v血清。由此，通过使卵细胞在该培养基中经过42小时的培养，可以促进卵母细胞的成熟，排出第一极体，从而提高成熟效率(第一极体排出率)，约大于80%。
[0052]根据本发明的实施例，对所获得的卵母细胞进行鉴定的方法不受特别限制，可以为本领域常用的各种细胞鉴定方法，包括但不限于细胞表面分子标记法、流式细胞法等。根据本发明的具体实施例，利用 CD29、CD90、CD34、CD45、FITC Mouse IgGl 和 PE Mouse IgG17种不同的抗体对所获得的卵母细胞进行表面标记，然后利用BD FACSCalibur流式细胞仪以及WinMDI2.8软件进行分析，以便确定所获得的细胞是否为间充质干细胞。
[0053]S202:卵母细胞脱卵丘及去核
[0054]将上述培养成熟的卵细胞从含有胚胎成熟培养基(IVM)的四孔板中转移至透明质酸酶中，以便脱去卵丘颗粒细胞。根据本发明的实施例，将培养成熟的卵细胞从含有胚胎成熟培养基(IVM)的四孔板中转移至透明质酸酶中的转移操作并不受特别限制，可以是本领域常用的转移卵细胞的技术，根据本发明的具体实施例，利用移液枪将成熟完全的卵母细胞从含有胚胎成熟培养基(IVM)的四孔板中至透明质酸酶中。其中，根据本发明的实施例，所采用的透明质酸酶的浓度并不受特别限制，只要可以脱去卵丘颗粒细胞，本领域技术人员可以根据细胞的浓度以及试剂的种类进行适当的调节，根据本发明的具体实施例，所采用的透明质酸酶的浓度可以为lmg/mL。透明质酸酶主要作用是溶解卵丘细胞间透明质酸，从而使卵丘细胞分散，由此，可以采用适当的浓度将上述培养成熟的卵细胞中的卵丘细胞分散以便进一步去除。根据本发明的实施例，脱去卵丘颗粒细胞的操作并不受特别限制，可以采用本领域常用的各种技术，根据本发明的具体实施利，发明人惊奇的发现，采用具有枪头的移液枪来回吸打含有卵母细胞的透明质酸酶，可以利用枪头的小口径反复对卵细胞进行吸打，从而脱去成熟卵细胞外周与之进行代谢联系的卵丘颗粒细胞。
[0055]根据本发明的实施例，去除卵细胞核的方法并不受特别限制，可以为本领域常用的各种去核方法，根据本发明的具体实例，可以先将上述去除了卵丘细胞的裸露卵母细胞放置于蛋白酶中，以便将卵母细胞表层的透明带消化松散，然后将其转移至第二胚胎操作液操作滴中，并根据极体定位的方法，将第一极体连同部分卵母细胞质切除。根据本发明的实施例，第二胚胎操作液可以包括10%v/v的[10X]TCM199、0.17mg/mL的碳酸氢钠、0.20mg/mL的丙酮酸钠、3.60mg/mL的赫佩斯钠盐、2.63mg/mL的赫佩斯酸、0.20mg/mL的谷氨酰胺、2.5μ g/mL细胞松驰素和20%血清。由此，可以有效地去除卵母细胞核。
[0056]根据本发明的实施例，放置上述经过去核的卵母细胞的方式并不受特别限制，本领域技术人员可以根据后续操作需要进行选择，根据本发明的具体示例，将上述去核的卵母细胞转移到第一胚胎操作液操作滴中待用。根据本发明的实施例，第一胚胎操作液可以包括 10%v/v 的[10X]TCM199、0.17mg/mL 的碳酸氢钠、0.20mg/mL 的丙酮酸钠、3.60mg/mL的赫佩斯钠盐、2.63mg/mL的赫佩斯酸、0.20mg/mL的谷氨酰胺、2%的血清。由此，所获得的经过去核的卵母细胞在含有最适合的胚胎操作液环境中存活。
[0057]S203:卵母细胞与供体细胞融合
[0058]根据本发明的实施例，首先将S103中获得的体细胞分散于上述第一胚胎操作液操作滴中，由此，体细胞在该第一胚胎操作液操作滴中呈单个细胞分布状；然后将S202中获得的经过去核的卵母细胞在植物凝集素中放置一段时间后转移到上述含有体细胞的第一胚胎操作液操作滴中，其中根据本发明的一些具体实例，将S202中获得的经过去核的卵母细胞在lmg/mL植物凝集素中放置I?2秒，由此可以使胞质表面带有粘性，从而使得单个体细胞和经过去核的卵母细胞在第一胚胎操作液操作滴中进行充分的贴合。
[0059]根据本发明的实施例，将去核的卵母细胞(胞质)与供体细胞进行融合的方法并不受特别限制，可以是本领域常用的各种细胞融合技术，根据本发明的具体示例，可以将胞质-体细胞转移至载有融合操作液的融合槽中，通过电击进行融合。根据本发明的实施例，融合槽中的融合操作液可以包含3M甘露醇、lmg/mL聚乙烯醇和0.1mM硫酸镁。由此卵母细胞和体细胞可以处于最适合的环境条件中接受电击，从而提高融合效率。根据本发明的实施例，对卵母细胞-体细胞进行融合的条件并不受特别限制，本领域技术人员可以根据具体细胞情况和设备情况进行调节，根据本发明的实施例，电击卵母细胞与体细胞进行融合的条件可以为100V直流电电击9 μ s，4V交流电电击。通过使用交流电可使胞质去极化，从而可以使其可悬挂于电极丝上，而通过直流电脉冲，可使细胞膜形成一个瞬时的穿孔，从而使胞质与供体细胞膜结合并融合。由此，胞质与体细胞可以在最适合的条件下接受电击，从而得到充分的融合，以便获得重构克隆胚胎。根据本发明的实施例，将电击完的细胞转移至胚胎操作液I操作滴中，并将操作盘放置在38.5摄氏度热台上等待I小时，从而提高胚胎后期发育效率。
[0060]S204:激活重构胚，形成胚胎
[0061]根据本发明的实施例，将由S203步骤中获得的融有体细胞的胞质转移至载有激活操作液的融合槽内，并悬挂S202步骤中所获得的去核卵母胞质，然后进行电击。其中利用交流电使重构胚去极化，从而使其可悬挂于电极丝上，第二个胞质也是通过去极化作用，可以使其可与重构胚接触。通过上述方法，使得一个体细胞融合了两个胞质，而胞质的成份增加，能提供更多的营养物质，有利于后期的胚胎发育。根据本发明的实施例，上述激活操作液可以为3M的甘露醇、lmg/mL聚乙烯醇、0.1mM的硫酸镁和0.05mM的氯化钙。
[0062]根据本发明的实施例，进行电击的条件并不受特别限制，本领域技术人员可以根据具体细胞情况和设备情况进行调节，根据本发明的具体实例，电击的条件可以为43V直流电电击80 μ s，然后采用4V交流电电击。由此,通过使用交流电可使重构胚去极化,从而可以使其可悬挂于电极丝上，而通过直流电脉冲，可使细胞膜形成一个瞬时的穿孔，从而使重构胚与胞质细胞膜结合并融合；然后将电击后的胚胎转移至第一胚胎操作液操作滴中，待两个胞质融合。由此，可以提高胚胎的稳定性。
[0063]根据本发明的实施例，对上述经过融合的细胞进行激活的方式不受任何限制，可以为本领域常用的各种激活技术，根据本发明的具体实施例，将经过融合的胚胎进行化学激活，其中根据本发明的具体实例，将经过融合的胚胎转移至化学激活滴中进行化学激活。根据本发明的一些实施例，上述进行化学激活的化学激活滴含有胚胎培养基(IVC)以及5 μ g/mL的细胞松驰素，10 μ g/mL的放线菌酮。根据本发明的实施例，胚胎培养基(IVC)可以包含6.31mg/mL的氯化钠、2.llmg/mL的碳酸氢钠、0.75mg/mL的氯化钾、0.05mg/mL的磷酸二氢钾、0.05mg/mL的硫酸镁、0.62mg/mL的乳酸|丐、0.02mg/mL的丙酮酸钠、0.50mg/mL的内消旋肌醇、0.01g/mL的酹红、0.05mg/mL的谷氨酰胺、0.55mg/mL的亚牛碘酸、0.04mg/mL的庆大霉素、3g/L的牛血清白蛋白、[IX]的非必需氨基酸和[0.5X]的必需氨基酸。由此可以使得上述经过融合的细胞在最适合的培养基成分中被激活。根据本发明的另一些实施例，将经过融合的胚胎转移至胚胎培养基中进行化学激活是在38.5摄氏度、5% 二氧化碳与5%氧气培养箱中进行的。根据本发明的具体示例，将经过融合的胚胎转移至胚胎培养基中并在38.5摄氏度、5% 二氧化碳与5%氧气培养箱中培养4小时。由此，可以使得上述经过激活的细胞在最适合生长的环境条件下进行适应性生长，从而提高胚胎成活率。
[0064]根据本发明的实施例，将上述经过激活和适应性生长的胚胎从上述化学激活滴中转移至打孔的含胚胎培养基的四孔板中，并在38.5摄氏度、5% 二氧化碳与5%氧气培养箱中继续进行培养120h或144h。通过打孔可以使多个无透明带重构胚可在同一个液孔中培养，各自有自己独立的发育空间，并且在同一液孔可以发生紧密的信息交换，有利于胚胎发育。由此，上述经过激活和适应性生长的胚胎可以进一步在适宜的条件和环境下进行生长，从而提高胚胎的成活率。
[0065]S205:胚胎植入
[0066]根据本发明的实施例，将上述经过体外培养的胚胎植入待孕动物输卵管或子宫内，经过足够的孕期克隆出非人动物。根据本发明的实施例，将上述经过体外培养的胚胎植入待孕动物输卵管或子宫内的方式并不受特别限制，可以为本领域惯常采用的胚胎植入技术，根据本发明的具体实施例，将发育到120h的囊胚(见图7)通过手术移植入待孕母体的子宫角内。根据本发明的实施例，胚胎在母体内发育114天左右，通过自然分娩或者剖腹产出克隆非人动物，出生动物见图9。
[0067]实施例1从血液获得单个核细胞
[0068]预先向15mL的锥形离心管内加入125IU肝素，并通过震荡使其均匀分布于锥形离心管的管壁。通过采用50mL的注射器直接抽取猪前腔静脉血方式将小型猪的外周血约12mL收集于上述加入了肝素15mL的锥形离心管内。将该载有外周血的锥形离心管置于4摄氏度冰盒中运输会实验室。
[0069]另取两个15mL的锥形离心管，并向其中分别加入5mL的中性粒细胞分离液(含有57g/L聚蔗糖和90g/L泛影酸钠)后，利用移液枪小心地沿15mL的锥形离心管壁并贴近中性粒细胞分离液液面缓慢加入5mL的所采集的抗凝外周血，并保证该抗凝外周血不与下层的中性粒细胞分离液混合，然后在400g条件下水平离心30分钟。
[0070]离心后，利用移液枪分别从两个离心管收集中间层云浮状单个核细胞，并合并放置于一个新的50mL的锥形离心管。将20mL的PBS加入到前述含有单个核细胞50mL的锥形离心管中，并利用巴氏滴管反复吹打进行清洗。清洗后，将含有单个核细胞的PBS混悬液在300g条件下离心10分钟。离心后，取出50mL的锥形离心管，去除上清液后再向含有单个核细胞沉淀的50mL的锥形离心管中加入20mL的PBS，并再次利用巴氏滴管反复吹打进行第二次清洗。第二次清洗后，将含有单个核细胞的PBS混悬液再次在300g条件下离心10分钟。然后重复上述第二次清洗步骤，对单个核细胞进行第三次清洗。
[0071]实施例2单个核细胞体外培养
[0072]向实施例1中得到的经过3次清洗并弃去离心后PBS上清液的细胞沉淀中加入2mL含有低糖-MEM、15%FBS、[IX]非必需氨基酸、10ng/mL bFGF和30IU/mL肝素的第一贴壁细胞培养基，并利用巴氏滴管将单个核细胞沉淀吹打均匀分散于第一贴壁细胞培养基中。将含有单个核细胞的第一贴壁细胞培养基转移至明胶包被的35mm培养皿中，然后放置在37摄氏度的二氧化碳培养箱中进行培养。
[0073]经过48小时的培养，向载有单个核细胞的35mm培养皿从培养箱中取出，弃去第一贴壁细胞培养基后，加入PBS进行漂洗。弃去PBS后，向载有单个核细胞的35mm培养皿中加入含有MEM-α、15%FBS、[1X]非必需氨基酸和10ng/mL bFGF的第二贴壁细胞培养基，并将培养皿放回培养箱继续进行培养。并且在第72和96小时分别对载有单个核细胞的35mm培养皿采用第二贴壁细胞培养基进行换液处理。该单个核细胞培养5-7天后，置于光学显微镜性进行观察，镜下单个核细胞在培养皿底面上呈成纤维状贴壁细胞生长(见图3)，且细胞核较大，细胞核仁清晰可见。
[0074]实施例3单个核细胞的传代培养
[0075]当贴壁的单个核细胞在显微镜下观察呈团状接触抑制装生长时(见图4)，弃去培养皿中第二贴壁细胞培养基；然后加入PBS缓冲液润洗细胞2次；弃去PBS缓冲液后，向载有贴壁的单个核细胞的培养皿中加入200 μ L0.05%胰酶-200mg/L EDTA,并将细胞放置于37摄氏度的二氧化碳培养箱中进行消化，当在显微镜下观察到贴壁细胞逐渐变圆变亮并逐渐脱离培养皿而漂浮于细胞胰酶中时，向培养皿中加入ImL第二贴壁细胞培养基，并通过巴氏滴管吹打使得单个核细胞与加入的新鲜第二贴壁细胞培养基混合均匀，以便获得细胞悬液；然后将上述细胞悬液转移到经过明胶包被的培养设备中进行传代培养。进过传代培养的贴壁单个核细胞在显微镜下观察，细胞后期生长旺盛，增殖性好(见图5和图6)。将传代培养的第2-20代单个核细胞细胞悬液直接移至1.5mL离心管中待用，用于手工克隆。
[0076]实施例4卵母细胞体外培养及表面分子鉴定
[0077]将从屠宰场收集的猪卵巢放置在装有生理盐水的容器内以保持渗透压平衡，并以35摄氏度恒温条件运输回实验室。将卵巢放置于装有胚胎洗涤液(ASP)的培养皿中(其中胚胎洗涤液(ASP)含有10%v/v的10XTCM199、0.17mg/mL的碳酸氢钠、0.20mg/mL的丙酮酸钠、3.60mg/mL赫佩斯钠盐、2.63mg/mL的赫佩斯酸、0.20mg/mL的谷氨酰胺、3.00 μ g/mL的两性霉素B、30IU/mL的肝素、2%的血清)，用刀片将卵泡划破以使得卵泡中的卵细胞流出。为了达到pH值相对稳定的培养环境,预先将培养基放置在5%浓度的二氧化碳培养箱进行平衡，然后将流出的卵细胞以每孔50个胚胎的密度收集于预先平衡的胚胎成熟培养基(IVM)的四孔板中，其中胚胎成熟培养基(IVM)含有[IX]的TCM199、5IU/mL的人绒毛膜促性腺激素、lIU/mL的孕马血清、0.10mg/mL的谷氨酰胺、0.05mg/mL庆大霉素、10%卵泡液、10%v/v血清。然后将载有胚胎的四孔板置于38.5摄氏度二氧化碳培养箱中进行培养42h至成熟。
[0078]将贴壁的成熟卵母细胞进行消化处理，并在350g条件下离心3分钟，弃去上清液后，向沉淀中加入2mL PBS进行吹打洗涤；然后再次以350g离心3分钟，弃去上清液后向离心管中的沉淀加入700 μ L PBS,吹打混匀后将所得到的悬浮液平均分配加入到7个新的2mL离心管中，即每管加入100 μ L细胞悬浮液；然后分别向每一个离心管中加入5 μ L?20μ L 抗体 7 个不同的抗体:CD29、CD90、CD34、CD45、FITC Mouse IgGl 和 PE Mouse IgGl,旋涡充分混匀后，避光孵育15分钟；然后对标记了表面抗原的细胞进行2次洗涤，条件均为加入ImL PBS，上下晃匀后以350g离心3分钟，弃上清；然后再以0.4mL多聚甲醇(4%浓度溶于PBS)溶解洗涤后的细胞沉淀，使用BD FACSCalibur对其进行上机分析，利用WinMDI2.8软件对结果进行读取，结果参见图8。图8显示了根据本发明实施例的细胞高表达CD29和⑶90表面抗原，而不表达⑶34和⑶45表面抗原。图8的结果显示所获得的卵母细胞高表达⑶29和⑶90表面抗原，不表达⑶34和⑶45表面抗原，其中所获得的卵母细胞的⑶29和CD90的阳性率分别为99.27%和98.62，而CD34和CD45的阳性率分别为0.43%和0.45%。
[0079]实施例5猪卵母细胞脱卵丘及去核
[0080]将上述培养成熟的卵细胞用移液枪从含有胚胎成熟培养基(IVM)的四孔板中转移至lmg/mL透明质酸酶中，用枪头来回吸打从而脱去卵丘颗粒细胞。然后先将上述去除了卵丘细胞的裸露卵母细胞放置于蛋白酶中，以便将覆盖在卵母细胞表层的透明带消化松散，继而将其转移至第二胚胎操作液操作滴中，并根据极体定位的方法，将第一极体连同部分卵母细胞质切除。将去核的卵母细胞转移到第一胚胎操作液操作滴中待用，从而所获得的经过去核的卵母细胞可以在含有最适合的胚胎操作液环境中存活。其中第一胚胎操作液可以包括 10%v/v 的[10X]TCM199、0.17mg/mL 的碳酸氢钠、0.20mg/mL 的丙酮酸钠、3.60mg/mL的赫佩斯钠盐、2.63mg/mL的赫佩斯酸、0.20mg/mL的谷氨酰胺、2%的血清。
[0081]实施例6卵母细胞与供体细胞融合
[0082]将实施例3获得的体细胞放置在第一胚胎操作液操作滴中，并使得体细胞在该操作滴中呈单个细胞分布状。将实施例5获得的经过去核的卵母细胞在lmg/mL植物凝集素中放置I秒?2秒，然后与上述实施例3获得的体细胞合并放入至前述第一胚胎操作液操作滴中，从而使得单个体细胞和经过去核的卵母细胞在第一胚胎操作液操作滴中进行充分的贴合。将去核卵母细胞(胞质)-体细胞转移至载有融合操作液的融合槽中，通过电击进行融合，以便获得重构克隆胚胎。其中融合槽中的融合操作液包含3M甘露醇、lmg/mL聚乙烯醇和0.1mM硫酸镁。电击卵母细胞与体细胞进行融合的条件为10V直流电电击9 μ s，4V交流电电击。陆续电击完所有卵母细胞与体细胞，然后将其转移到第一胚胎操作液操作滴中，将操作盘放置在38.5摄氏度热台上等待I小时。
[0083]实施例7激活重构胚，形成胚胎
[0084]根据本发明的实施例，将实施例6中融有体细胞的胞质转移至载有激活操作液的融合槽内(其中激活操作液含有3Μ的甘露醇、lmg/mL聚乙烯醇、0.1mM的硫酸镁和0.05mM的氯化钙)，并悬挂实施例5中所获得的去核胞质，然后进行电击，以便使重构胚与胞质融合:其中利用交流电使重构胚去极化，从而使其可悬挂于电极丝上，第二个胞质也是通过去极化作用，可以使其可与重构胚接触。电击的条件为43V直流电电击80μ S，然后采用4V交流电电击，4V交流电一直到电击结束后关闭。由此，通过使用交流电可使重构胚去极化，从而可以使其可悬挂于电极丝上，而通过直流电脉冲，可使细胞膜形成一个瞬时的穿孔，从而使重构胚与胞质细胞膜结合并融合；然后将电击后的胚胎转移至第一胚胎操作液操作滴中，待两个胞质融合。
[0085]将经过融合的胚胎转移至化学激活滴中进行化学激活，上述进行化学激活的化学激活滴含有胚胎培养基(IVC)以及5 μ g/mL的细胞松驰素和10 μ g/mL的放线菌酮。其中，胚胎培养基(IVC)包含6.31mg/mL的氯化钠、2.llmg/mL的碳酸氢钠、0.75mg/mL的氯化钾、0.05mg/mL的磷酸二氢钾、0.05mg/mL的硫酸镁、0.62mg/mL的乳酸|丐、0.02mg/mL的丙酮酸钠、0.50mg/mL的内消旋肌醇、0.01g/mL的酹红、0.05mg/mL的谷氨酰胺、0.55mg/mL的亚牛碘酸、0.04mg/mL的庆大霉素、3g/L的牛血清白蛋白、[IX]的非必需氨基酸和[0.5X]的必需氨基酸。将经过融合的胚胎转移至胚胎培养基中在38.5摄氏度、5% 二氧化碳与5%氧气培养箱中进行化学激活，激活时间为4小时。
[0086]将上述经过激活和适应性生长的胚胎从上述化学激活滴中转移至打孔的含胚胎培养基的四孔板中，并在38.5摄氏度、5% 二氧化碳与5%氧气培养箱中继续进行培养120h。
[0087]实施例8胚胎植入
[0088]上述经过体外培养的胚胎植入待孕动物输卵管或子宫内，经过足够的孕期克隆出非人动物。首先将发育到第120h的囊胚(见图7)通过手术移植入待孕母猪体的子宫角内。胚胎在母猪受体内发育114天左右，通过自然分娩或者剖腹产出克隆非人动物，出生动物见图9。
[0089]在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0090]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【权利要求】
1.一种从血液中分离、培养细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤: 将所述血液加入到分离液上层后利用密度梯度离心的方式进行离心，以便获得单个核细胞； 将所述单个核细胞接种于含有贴壁细胞培养基的体外培养设备，以便获得贴壁细胞；以及 将所述贴壁细胞进行传代培养，以便获得体细胞核移植的供体细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液来自外周血。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离液为中性粒细胞分离液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述中性粒细胞分离液的密度为1.077g/mL， 其中，所述中性粒细胞分离液含有57g/L聚蔗糖和90g/L泛影酸钠。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞是从所述分离液离心后中间层收集的。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述单个核细胞接种于含有贴壁细胞培养基的体外培养设备，以便获得贴壁细胞进一步包括: 首先，将用PBS清洗后的单个核细胞利用第一贴壁细胞培养基在37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养48小时，所述第一贴壁细胞培养基包括低糖-MEM、15%FBS、I X非必需氨基酸、10ng/mL 的 bFGF 和 30IU/mL 肝素； 接着，将培养基更换为第二贴壁细胞培养基继续在37摄氏度的二氧化碳培养箱中培养，所述第二贴壁细胞培养基包括MEM-a、15%FBS、1X非必需氨基酸和10ng/mL的bFGF。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体外培养设备是明胶包被的培养皿或明胶包被的培养板。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述贴壁细胞进行传代培养进一步包括，将所述贴壁细胞传代培养2-20代。
9.一种对非人动物进行克隆的方法，其特征在于，包括: 利用根据权利要求1?8任一项所述的方法，制备体细胞核移植的供体细胞；以及 基于所述体细胞核移植的供体细胞，通过手工克隆，进行克隆非人动物。
【文档编号】C12N15/877GK104513807SQ201310461790
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】杨珍珍, 徐颖, 林木飞, 杜玉涛 申请人:深圳华大方舟生物技术有限公司, 深圳华大基因科技有限公司