双特异性抗体及其制造方法

双特异性抗体及其制造方法
【专利摘要】本发明涉及产生双特异性抗体的体外方法，包括如下步骤：a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含IgG4-样CH3区，b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述第二抗体包含IgG4-样CH3区，c)在允许核心铰链区的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所述第一和第二抗体，和d)获得双特异性抗体。本发明进一步涉及通过本发明的方法获得的双特异性抗体。
【专利说明】双特异性抗体及其制造方法
[0001] 本发明是申请日为2008年03月28日，申请号为200880018280. 1，发明名称为"双 特异性抗体及其制造方法"的发明专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及产生双特异性抗体的新方法，并涉及可以通过这些方法获得的双特异 性抗体。
[0003] 发明背景
[0004] 人免疫球蛋白G(IgG)抗体存在4种具有不同结构和功能性质的亚型。IgG包括两 个重链-轻链对（半分子），它们通过位于铰链区中的重链间二硫键连接。人IgG4分子存 在多种分子形式，它们的区别在于位于铰链区中的重链间二硫键的有无。IgG4分子以两个 重链间二硫键均已形成或者均未形成的形式存在（6, 7)。然而，不论是否存在这些链间二硫 键（6, 8)，人IgG4在溶液中均以由两个Ig重链和两个轻链组成的四聚体形式存在，这是免 疫球蛋白G分子的共同性质，因为在CH3结构域之间和在CHl和CH2结构域之间存在相对 强的非共价相互作用（4)。只有在非还原条件下发生变性时，两个非共价关联的半分子才会 解离，如大小测定分析（size-determination analysis)例如SDS-PAGE所表现的（6,9)。
[0005] 几年来人们已经知道，人IgG4分子与其它的IgG亚类不同，以单价分子形式与抗 原相互作用。已经发现，血清来源的人IgG4不能沉淀纯化的抗原，因为它不能交联。虽然 这种血清来源的IgG4在功能上是单价的（1，2)，但与之形成对照的是，重组产生的IgG4在 与抗原相互作用中的行为表现为二价（3)。根据这些观察结果，有人提出，血清中的IgG4分 子能够交换半分子（即，由一个重链和一个轻链构成的分子），结果产生双特异性分子，这 样的分子不能交联相同的抗原（3-5)。这种半分子交换过程在本文也被称作"Fab臂交换"。
[0006] 双特异性抗体作为治疗药物的潜力是令人感兴趣的，因为它们可以用作例如调节 物，使效应物机制重新靶向于疾病相关的位点。然而，开发双特异性抗体的其中一个主要 的障碍就是通过传统的技术，例如杂交瘤和化学偶联方法，难以产生足够量和品质的材料 (10)。
[0007] WO 2005/062916介绍了用于在小鼠体内基于IgG4形成多聚分子的方法。此外，WO 2005/062916还介绍，在盐缓冲液中体外共同温育两种具有不同抗原结合特异性的IgG4抗 体可形成能够同时与两种抗原反应的产物。然而，WO 2005/062916中没有证明，这些产物 是聚集体还是双特异性的抗体，并且反应的产出在所用条件下较低。 发明概要
[0008] 现在人们惊奇地发现，在还原条件下，两种具有不同抗原结合特异性的IgG4_或 IgG4_样抗体能够进行高效的半分子交换，从而形成双特异性抗体，而不会伴随形成聚集体 (aggregates)〇
[0009] 因此，在第一个主要方面中，本发明涉及一种用于产生双特异性抗体的体外方法， 所述方法包括如下步骤：
[0010] a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含IgG4-样CH3区， [0011] b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述 第二抗体包含IgG4-样CH3区，
[0012] c)在允许核心铰链区的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所述 第一和第二抗体，和
[0013] d)获得双特异性抗体。
[0014] 不受限于任何具体的理论，我们认为抗体的两个区域对其进行半分子交换的能力 具有重要的影响。
[0015] 首先，半分子交换的能力可能受到分子的核心铰链区中的序列差异的影响，因为 在核心铰链区中具有CPSC序列的抗体，例如IgG4,比具有CPPC核心铰链序列的抗体，例 如IgGl，更容易交换。不受限于任何理论，提出这样的假设，即CPSC序列导致核心铰链 (core-hinge)更有柔性（flexible),并使链内二硫键的形成成为可能。值得一提的是，核 心铰链的结构与蛋白质-二硫化物-异构酶（PDI)的活性结构域CXXC相似。不同同种型 的PDI的这些CXXC基序催化蛋白质中二硫键的形成、还原和重排。因此，不受限于任何具 体的理论，认为具有IgG4-样核心铰链序列的抗体可能具有内在的重排二硫键的活性，这 种活性被本发明方法中所用的条件所激发。
[0016] 第二，同样不受限于任何理论，结果显示为了允许交换反应发生，CH3区的序列应 当是IgG4-样，即使得不会形成强的半分子间相互作用。
[0017] 在另一个主要方面中，本发明涉及通过本发明的方法获得的或者可以通过本发明 的方法获得的分离的双特异性抗体，并涉及包含这样的抗体的药物组合物。
[0018] 在进一步的方面中，本发明涉及一种包含两个IgG4-样CH3区的分离的双特异性 抗体，并涉及包含这样的抗体的药物组合物。
[0019] 在更进一步的方面中，本发明涉及一种用于选择具有期望性质的双特异性抗体的 方法，所述方法包括如下步骤：
[0020] a)提供一系列抗体，其中每种抗体具有不同的靶标特异性，并且其中每种抗体包 含IgG4_样CH3区，
[0021] b)在还原条件下将所述系列中的每种抗体与所述系列中的另一种抗体进行温育， 从而产生一系列的抗体混合物，其中每种混合物包含不同的双特异性抗体（a different bispecific antibody),
[0022] c)测定所得的一系列抗体混合物的给定的期望性质，和
[0023] d)选择具有期望性质的双特异性抗体混合物。
[0024] 附图简述
[0025] 图L经纯化的重组IgGl和IgG4的SDS-PAGE分析。纯化之后，将Betvl和Feldl， IgGl和IgG4抗体在非还原SDS-PAGE上进行分析。
[0026] 图2. nu/nu Balb/c小鼠体内，在不同时间点上双特异性IgG的水平。将异源交联 测定确定的双特异性IgG的量对Bet V 1结合测定确定的Bet V 1特异性IgG的量进行作 图。含IgGl血浆样品和含IgG4血浆样品的数据分别用空心和实心符号表示。虚线代表在 IgG半分子交换是随机且完全的条件下双特异性IgG的计算量。
[0027] 图3.在体内产生双特异性人IgG4分子。㈧各组SCID小鼠 （η = 5)注射嵌合抗 体混合物：100 μ g IgGl-Betvl/100 μ g IgGl-Feldl (正方形），100 μ gIgG4-Betvl/100 μ g IgG4-Feldl (圆形），或 3) 100 μ g IgG4-Betvl/100 μ gIgG4-Feldl+2, 000 μ g 无关重组 IgG4(IgG4-EGFR;三角形）。通过评估血浆中针对Bet V 1和Fel d 1的双特异性活性来随 时间追踪双特异性抗体的产生。双特异性IgG相对于总IgG-Bet V 1浓度的分数用百分比 表示。带星号的箭头指示在过量的无关IgG4的存在下接受IgG4-Betvl/IgG4-Feldl的小鼠 体内预期的双特异反应性水平（4% )，不带星号的箭头指示接受IgG4-Betvl/IgG4-Feldl 混合物的小鼠体内预期的双特异反应性水平（50% )。误差棒代表SEM。（B)通过评估小鼠 血楽中放射性标记的Fel d 1与Fel d 1偶联Sepharose的交联来测试单特异交联活性。 单特异反应性表示为通过交联结合的放射性标记Fel d 1的量与总IgG-Fel d 1的比值， 以便校正IgG的清除。误差棒表示SEM。
[0028] 图4.小鼠血浆中双特异活性的SEC分析。
[0029] 将在t = 24h时从给予了一种IgG4混合物的小鼠获得的血浆（10 μ 1)在 Superdex200柱上进行分离。小鼠被给予了含有300 μ g Bet V 1结合性IgG4和300 μ g Fel d 1结合性IgG4的混合物。在级分中Fel d 1特异性IgG( )的浓度在抗原结合试 验中测量，双特异性IgG Bet V I-Fel d 1(·)的浓度在Bet vl-Fel d 1交联测定中确 定。用IVIg对柱进行校准，结果显示单体、双体和聚集型IgG分别在12. 9, 11. 0和8. 4ml 洗脱（数据未显示）。
[0030] 图5. IgG在全血组分中的交换
[0031] 是将嵌合IgG混合物在37°C的全血、血细胞、血浆和血清中温育24h，之后在异源 交联测定（Fel d 1-Bet V 1)中测量双特异活性，来评估IgG4和IgGl的交换。血液从两个 供体获得：A(黑色条形）和B(灰色条形）。确定在添加了嵌合IgG4(图A)、嵌合IgGl (图 B)或者没有添加 IgG(图C)的混合物中的双特异性活性。所有提供的数据均是在37°C温 育24h后测量的。
[0032] 图6.人血细胞的IgG交换
[0033] 在37°C将嵌合IgG混合物与单个核细胞（MNC)、血小板（Thr)和红细胞（Ery)温 育48h，之后在异源交联测定（Fel d 1-Bet V 1)中测量双特异活性，来评估IgG4(黑色条 形）和IgGl(灰色条形）的交换。作为对照，还在无血清培养基（SFC)中温育抗体混合物。 双特异性表示为被结合的 125I-Bet V 1相对于总添加量的百分比。
[0034] 图7. HEK和小鼠细胞系的IgG4交换
[0035] 在37°C将嵌合IgG混合物与HEK细胞、小鼠 B细胞（J558)或杂交瘤细胞温育，来 评估IgG4半分子的交换。在异源交联测定（Fel d I-Bet V 1)中对分别在t = Oh (灰色 条形）和t = 24h(黑色条形）获取的1 μ 1样品中的双特异活性进行测量。双特异性表示 为被结合的125I-Bet V 1与总添加量的百分比。
[0036] 图8.红细胞介导的IgG4交换
[0037] 将IgG4-Betvl/IgG4-Feldl混合物与新鲜纯化的红细胞（ery，实心符号）温育产 生了双特异性抗体，而对于IgGl同种型的混合物没有观察到双特异性。作为对照，将抗体 混合物在无红细胞的PBS中温育（空心符号）。箭头指示双特异性IgG的最大预期百分比 (50% )。误差棒表示重复测量结果的范围。
[0038] 图9. IgG4在PBS中的交换
[0039] 通过测量双特异活性（图A)、二价性和抗原结合来评估IgGl (白柱），IgG4 (灰色 条形）和IgG4在过量的无关IgG4(黑色条形）存在下在PBS中的交换。图A中IgG半分 子的交换是从双特异IgG的浓度（在异源交联测定中确定）和假设IgG半分子的交换是随 机且完全的情况下双特异IgG的最大预期浓度计算而得的。交换表示为占最大交换的百分 t匕，最大交换为100%。在图B中描绘了随时间变化的Fel d 1二价性，其是在同源交联测 定中测得的。将t = 0时的二价IgG的浓度设定为100%，将二价IgG的浓度标准化。
[0040] 图10.红细胞裂解物的IgG4交换
[0041] 在来自红细胞的裂解物中37°C温育嵌合IgG4混合物来评估IgG4半分子的交换。 将IgG4与递增稀释度的裂解物一起温育。在异源交联测定中对在所示时间点获取的样品 进行双特异活性（Bet V I-Fel d 1)测量。双特异性表达为被结合的125I-Bet V 1相对于 添加量的百分比。
[0042] 图11.受红细胞裂解物诱导的双特异活性的SEC分析
[0043] 将IgG4与新鲜制备的红细胞裂解物在37°C温育24h，随后在Superdex200柱上进 行分级。Superdex200 柱在 ΑΚΤΑ HPLC 单兀（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) 上以0.5ml/min运行。级分中Bet v 1特异性IgG(_)的浓度在抗原结合测定中进行测 量，双特异性IgG Fel d 1-Bet V 1(·)的浓度在Bet V I-Fel d 1交联测定中加以确定。 对该柱进行校准，结果显示单体、双体和聚集型IgG分别在12. 1，10. 3和8. 3ml洗脱（数据 未显不）。
[0044] 图12. GSH介导的IgG4交换
[0045] 通过在PBS/叠氮化物（Azide)中递增浓度GSH的存在下温育IgG4来评估GSH 介导的IgG4半分子交换。在所示的时间点采取样品，测量其中的抗原结合和双特异活性。 IgG4半分子的交换是从双特异性IgG的测得浓度（在异源交联测定中确定）以及假定IgG4 半分子的交换是随机且完全的情况下双特异性IgG4的最大预期浓度计算而得的。交换表 示为占最大交换的百分比，最大交换设定为100%。
[0046] 图13. GSH介导的IgG4半分子交换的SEC
[0047] IgG4 与 GSH(0· 5mM)温育，随后在 Superdex200 柱上进行分离。Superdex200 柱在 ΑΚΤΑ HPLC 单兀（Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)上以 0· 5ml/min 运行。级分 中Bet V 1特异IgG( )的浓度在抗原结合测定中进行测量，双特异性IgG Fel d I-Bet V 1(·)的浓度在Bet V I-Fel d 1交联测定中加以确定。对该柱进行校准，结果显示单 体、双体和聚集型IgG分别在12. 1，10. 3和8. 3ml洗脱（数据未显示）。
[0048] 图14. GSH介导的IgG4交换的温度依赖性
[0049] 将IgG4_Betvl及IgG4_Feldl混合物在示明的温度下在PBS中与GSH温育。在t =Oh (灰色条形）和t = 24h (黑色条形），对双特异性IgG4的浓度进行评估。由这些数据 计算双特异性IgG相对于IgG4Betvl浓度的分数，并表示为百分比。误差棒表示重复测量 的范围。
[0050] 图15.由一组还原剂介导的IgG4交换
[0051] 将PBS中的IgG4-Betvl和IgG4-Feldl在不同作用剂（全部为还原性，GSSG除外） 的存在下在37°C温育24h。Bet V 1特异性IgG的浓度在Bet V 1结合测定中进行测量，双 特异性IgG的浓度在异源交联测定（Fel d 1-Bet V 1)中进行测量。计算双特异性IgG相 对于IgG-Betvl浓度的百分比。标准误差棒表示从三次测量计算出的SEM。
[0052] 图16.使用GSH的完全人类IgG4抗体的交换
[0053] (A)将 IgG4-CD20/IgG4-EGFr 或 IgGl-CD20/IgGl-EGFr 混合物在有或者没有(λ 5mM GSH的条件下在37°C进行温育。在示明的时间点采取样品。在夹心式ELISA中测量双特异 性抗体的形成。Y轴表示405nm的光密度，作为双特异性CD20/EGFR抗体形成的量度。
[0054] (B) GSH剂量依赖性的IgG4交换。将IgG4-CD20和IgG4-EGFr的混合物与所示浓度 的GSH 37°C温育24h。双特异性抗体的形成在夹心式ELISA中测量。在Y轴上绘制405nm 的光密度，作为双特异性CD20/EGFR抗体形成的量度。
[0055] (C)GSH-介导的IgG4半分子交换受到反应中所用成分的影响，并且在较低GSH浓 度的培养基（Freestyle 293)中发生。
[0056] (D)GSH-介导的IgG4半分子交换在0· 5mM GSH比在5mM GSH更高。
[0057] (E/F)通过 ESI-TOF 质谱检测 IgG4-EGFR 和 IgG4-CD20 之间的 Fab 臂交换。IgG4 混合物在不存在（E)或存在（F)0. 5mM GSH的条件下温育24小时，之后用PNGase F使 抗体去糖基化，并通过ESI-TOF质谱确定所得抗体的分子量。图中显示的是经去卷积 (deconvoluted)ESI-TOF质谱。数据代表2次实验的结果。
[0058] 图17.猕猴IVIg参与重组人IgG4抗体的Fab臂交换
[0059] A)将两种重组人IgG4抗体（IgG4-⑶20和IgG4-EGFr)的混合物在存在或不存在 纯化猕猴免疫球蛋白或人IVIg的条件下在37°C与GSH温育24h。双特异性抗体通过Fab 臂交换的形成在夹心式ELISA.中进行测量。
[0060] B)将两种重组人IgG4抗体（IgG4-⑶20和IgG4-EGFr)的混合物在存在或不存在 过量（圆括号内所示）的来自数种动物（来源也示于圆括号中）的纯化猕猴免疫球蛋白或 人IVIg的条件下在37°C与GSH温育24h。在夹心式ELISA.中测量双特异性抗体通过Fab 臂交换的形成。
[0061] C)将两种重组人IgG4抗体（IgG4-⑶20和IgG4-EGFr)的混合物在存在或不存在 过量（圆括号内所示）的经纯化的黑猩猩、狒狒、食蟹猴（cynomolgous monkey)、马和猪免 疫球蛋白（圆括号内也指示了来源）或人IVIg的条件下在37°C与GSH温育24h。在夹心 式ELISA中测量双特异性抗体通过Fab臂交换的形成。
[0062] 图18.恒定区序列下划线的序列代表CH3区
[0063] 图19. IgGl突变体的GSH介导的半分子交换
[0064] (A)用0、0. 1、1和IOmM GSH测试GSH浓度对不同IgGl突变体的半分子交换的影 响。交换的测试使用如下的混合物：
[0065] _IgG4 a-feldl wt 和 IgG4 a-betvl wt (图中表不为 IgG4 wt)
[0066] -IgGl a-feldl wt 和 IgG4 a-betvl wt (表不为 IgGl wt)
[0067] -IgGl a-feldl CPSC 和 IgGl a-betvl CPSC (表示为 IgGl-CPSC)
[0068] -IgGl a-feldl CH3(IgG4)和 IgGl a-betvl CH3(IgG4)(表示为 IgGl-CH3(IgG4))
[0069] -IgGl a-feldl CPSC_CH3(IgG4)和 a-betvl IgGl CPSC_CH3(IgG4))(表示为 IgGl-CPSC-CH3(IgG4))
[0070] ⑶用0· 5和5mM GSH测试GSH浓度对不同IgGl突变体与野生型IgG4 (IgG4wt) 分子的半分子交换的影响。交换的测试使用如下的混合物：
[0071] -IgGl a-feldl wt 和 IgG4 a-betvl wt (表不为 IgGl)
[0072] -IgGl a-feldl CPSC 和 IgG4 a-betvl wt(表示为 IgGl-CPSC)
[0073] -IgGl a-feldl CH3(IgG4)和 IgG4 a-betvl wt (表示为 IgGl_CH3(IgG4))
[0074] -IgGl a-feldl CPSC-CH3 (IgG4)和 IgG4 a-betvl wt (表示为 IgGl-CPSC-CH3(G4))
[0075] -IgGl a-feldl R238Q 和 IgG4 a-betvl wt (表示为 IgGl_R238Q)
[0076] -IgGl a-feldl K292R 和 IgG4 a-betvl wt (表示为 IgGl_K292R)
[0077] -IgGl a-feldl Q302E 和 IgG4 a-betvl wt (表示为 IgGl_Q302E)
[0078] -IgGl a-feldl P328L 和 IgG4 a-betvl wt (表示为 IgGl_P328L)
[0079] -IgGl a-feldl CPSC-K292R 和 IgG4 a-betvl wt (表示为 IgGl-CPSC_K292R)
[0080] _IgG4 a-feldl wt 和 IgG4 a-betvl wt (表不为 IgG4)
[0081] (C)用0· 5和5mM GSH测试GSH浓度对不同IgGl突变体的半分子交换的影响。交 换的测试使用如下的混合物：
[0082] -IgGl a-feldl wt 和 IgGl a-betvl wt (表不为 IgGl)
[0083] -IgGl a-feldl CPSC 和 IgGl a-betvl CPSC (表示为 IgGl-CPSC)
[0084] -IgGl a-feldl CH3(IgG4)和 IgGl a-betvl CH3(IgG4)(表示为 IgGl-CH3(IgG4))
[0085] -IgGl a-feldl CPSC-CH3(IgG4)和 IgGl a-betvl CPSC-CH3(IgG4)(表示为 IgGl-CPSC-CH3(IgG4))
[0086] -IgGl a-feldl R238Q 和 IgGl a-betvl R238Q(表示为 IgGl-R238Q)
[0087] -IgGl a-feldl K292R 和 IgGl a-betvl K292R(表示为 IgGl_K292R)
[0088] -IgGl a-feldl Q302E 和 IgGl a-betvl Q302E(表示为 IgGl_Q302E)
[0089] -IgGl a-feldl P328L 和 IgGl a-betvl P328L(表示为 IgGl_P328L)
[0090] -IgGl a-feldl CPSC-K292R 和 IgGl a-betvl CPSC_K292R(表示为 IgGl-CPSC-K292R)
[0091] _IgG4 a-feldl wt 和 IgG4 a-betvl wt (表不为 IgG4)
[0092] 图20.在0. 5mM GSH下，具有野生型（IgG4)核心铰链的IgG4分子参与重组人 IgG4抗体的Fab臂交换，而具有IgGl核心铰链的分子不参与。（A)两种重组人IgG4抗体 (IgG4-⑶20和IgG4-EGFr，如上文说明的）的混合物在存在或不存在过量（50和100微克 /ml)的那他珠单抗（Tysabri)的条件下在37°C与0.5mM GSH温育24h。在夹心式ELISA 中测量双特异性抗体通过Fab臂交换的形成。（B)将两种重组人IgG4抗体（IgG4-CD20 和IgG4-EGFr，如上所述）的混合物在存在或不存在等摩尔量（10微克/ml)的那他珠单 抗（Tysabri)或吉妥单抗（Mylotarg)的条件下在37°C与0. 5mM GSH温育24h。在夹心式 ELISA中测量双特异性抗体通过Fab臂交换的形成。
[0093] 图21.在292位点具有额外突变的IgGl-CPSC构建体的半分子交换。用0. 5mM GSH 测试不同IgGl突变体的半分子交换。交换的测试使用如下的混合物：
[0094] -IgGl_2F8 wt 和 IgGl_7D8 wt(表示为 IgGl)
[0095] -IgGl-2F8-CPSC 和 IgGl-7D8-CPSC (表示为 IgGl-CPSC)
[0096] -IgGl-2F8-CH3 (IgG4)和 IgGl-7D8-CH3 (IgG4)(表示为 IgGl-CH3 (IgG4))
[0097] -IgGl-2F8-CPSC-CH3 (IgG4)和 IgGl-7D8-CPSC-CH3 (IgG4)(表示为 IgGl-CPSC-CH3(IgG4))
[0098] -IgGl-2F8-CPSC-R238Q 和 IgGl-7D8-CPSC-R238Q (表示为 IgGl-CPSC-R238Q)
[0099] -IgGl-2F8-CPSC-K292R 和 IgGl-7D8-CPSC-K292R (表示为 IgGl-CPSC-K292R)
[0100] -IgGl-2F8-CPSC-K292Y 和 IgGl-7D8-CPSC-K292Y(表示为 IgGl-CPSC-K292Y)
[0101] -IgGl-2F8-CPSC-K292F 和 IgGl-7D8-CPSC-K292F(表示为 IgGl-CPSC-K292F)
[0102] -IgGl-2F8-CPSC-K292W 和 IgGl-7D8-CPSC-K292W(表示为 IgGl-CPSC-K292W)
[0103] -IgGl-2F8-CPSC-Q302E 和 IgGl-7D8-CPSC-Q302E (表示为 IgGl-CPSC-Q302E)
[0104] -IgGl-2F8-CPSC-P328L 和 IgGl-7D8-CPSC-P328L(表示为 IgGl-CPSC-P328L)
[0105] -IgG4-2F8 wt 和 IgG4-7D8 wt(表示为 IgG4)
[0106] 在夹心式ELISA中测量双特异性抗体通过Fab臂交换的形成。
[0107] 图22.核心铰链的稳定化可在体内保护IgG4抗体治疗剂免于遭受Fab臂交换。
[0108] (A)通过 ESI-TOF 质谱检测 IgG4-EGFR-CPPC 和 IgG4-CD20 之间的 Fab 臂交换。将 IgG4-EGFR-CPPC/IgG4-CD20混合物在5mM GSH的存在下（F)温育24小时，之后用PNGase F使抗体去糖基化，并通过ESI-TOF质谱确定所得抗体的分子量。图中显示了去卷积后的 ESI-TOF谱。在使用5mM GSH时可以检测到双特异性EGFR/⑶20抗体（在没有GSH或0. 5mM GSH的条件下温育未产生双特异性抗体（数据未显示））。
[0109] (B)将数组（n = 4)SCID 小鼠用 IgG4-CD20/IgG4-EGFR(空心圆）、IgG4-CD20/ IgGl-EGFR和IgG4-CD20/IgG4-EGFR-CPPC等抗体混合物（每种300 μ g)进行注射。通过 ELISA对双特异性抗体的产生进行经时追踪和定量。双特异性抗体的定量使用体外交换 的抗体混合物作为对照。数据点代表4只小鼠的在不同的实验中至少测量2次的平均值 土SEM。在 IgG4-CD20/IgGl-EGFR 和 IgG4-CD20/IgG4-EGFR-CPPC 混合物中未能检测到双特 异性抗体。示明了测定的检测限（虚线），代表2000ng/ml的血清水平。
[0110] 图23. CXXC-突变体的经时Fab臂交换
[0111] 将CXXC-突变抗体的混合物在37°C与0.5mM GSH温育。在示明的时间点采取样 品。测量双特异性抗体的形成。交换的测试使用如下的混合物：
[0112] -IgGl a-feldl wt 和 IgGl a-betvl wt (表不为 IgGl)
[0113] _IgG4 a-feldl wt 和 IgG4 a-betvl wt (表不为 IgG4)
[0114] -IgG4 a-feldl CGHC 和 IgG4 a-betvl CGHC(表示为 CGHC)
[0115] -IgG4 a-feldl CGC 和 IgG4 a-betvl CGC (表示为 CGC)
[0116] -IgG4 a-feldl CPRC 和 IgG4 a-betvl CPRC (表示为 CPRC)
[0117] -IgG4 a-feldl CPHC 和 IgG4 a-betvl CPHC (表示为 CPHC)
[0118] 图24 :CXXC突变体的GSH介导的Fab臂交换
[0119] 用1-20, 000 μ M GSH测试GSH浓度对CXXC突变体的Fab臂交换的影响。交换的 测试使用如下的混合物：
[0120] -IgGl a-feldl wt 和 IgGl a-betvl wt (表不为 IgGl)
[0121] _IgG4 a-feldl wt 和 IgG4 a-betvl wt (表不为 IgG4)
[0122] -IgG4 a-feldl CGHC 和 IgG4 a-betvl CGHC (表示为 CGHC)
[0123] -IgG4 a-feldl CGC 和 IgG4 a-betvl CGC (表示为 CGC)
[0124] -IgG4 a-feldl CPRC 和 IgG4 a-betvl CPRC (表示为 CPRC)
[0125] -IgG4 a-feldl CPHC 和 IgG4 a-betvl CPHC(表示为 CPHC)
[0126] 发明详细说明
[0127] 定义
[0128] 术语"免疫球蛋白"是指一类结构相关的糖蛋白，由两对多肽链，一对低分子量轻 链（L)和一对重链（H)所构成，所有4条链均通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构 已经得到了详尽的表征。见例如《Fundamental Immunology》第七章（Paul, W.，ed·，2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)) (11)。简而言之，每条重链典型地由一个重链可变区（本文 缩写为％或VH)和一个重链恒定区构成。重链恒定区通常由三个结构域构成：CH1、CH2和 CH3。每条轻链典型地由一个轻链可变区（本文缩写为'或VL)和一个轻链恒定区构成。轻 链恒定区通常由一个结构域Q构成。V h和八区可以进一步分为高可变性区（或高变区，其 在序列和/或结构限定的环的形式上具有高度可变性），也称作补体决定区（CDR)，它们之 间散布着更加保守的区，称作框架区（FRs)。每个常由三个CDR和4个FR构成， 从氨基端向羧基端的排列顺序是：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4 (另见（12))。典型 地，该区中氨基酸残基用Kabat(13)所述的方法进行编号。使用该编号系统，肽的实际线性 氨基酸序列可以包含更少或更多的氨基酸，相应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入。 例如，重链可变结构域可以在V h OTR2的52位残基之后包含单氨基酸插入（依照Kabat的 残基52a)，和在重链FR的82位残基之后插入残基（例如依照Kabat的残基82a，82b和82c 等）。对于给定的抗体，可以通过将该抗体序列与一条"标准的"Kabat编号序列在同源区 域处进行比对，来确定其残基的Kabat编号。
[0129] 在本发明语境中，术语"抗体（Ab) "是指这样的免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子 的片段，或两者之任一的衍生物，其能够在典型的生理条件下以相当长时间的半衰期特异 性结合抗原,例如至少大约30分钟，至少大约45分钟，至少大约1小时，至少大约2小时， 至少大约4小时，至少大约8小时，至少大约12小时，大约24小时或者更长，大约48小时 或者更长，大约3、4、5、6或更多天等，或者其它任何相关的功能上定义的时间段（例如足以 诱导、促进、提高和/或调节与抗体结合抗原相关联的生理响应的时间，和/或足以供抗体 招募Fc介导的效应物活性的时间）。免疫球蛋白分子的重链和轻链可变区包含可以和抗原 相互作用的结合结构域。抗体（Abs)的恒定区可以介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子， 包括免疫系统的各种细胞（例如效应细胞），和补体系统的成分，例如Clq，经典补体激活途 径的第一个成分。如上文指出的，除非在另外指出或明显与上下文矛盾，本文中的术语"抗 体"包括含有突变的或野生型的核心铰链区并保留特异性结合抗原的能力的抗体片段。
[0130] 已经显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实施。术语"抗体"中 涵盖的结合性片段的实例包括例如F (ab'）2片段，它们是二价片段，包括两条Fab片段，这 两条片段通过位于铰链区的一个二硫键相连。尽管这些片段一般包含在抗体的含义之内， 但是它们作为总体以及各个独立的个体都是本发明的独特特征，展示不同的生物性质和效 用。还应当理解，除非另外具体指出，术语"抗体"还包括通过任何已知的技术，例如酶切、 肽合成和重组技术，所提供的多克隆抗体、单克隆抗体（mAbs)、类抗体多肽例如嵌合抗体和 人源化抗体，以及保留特异性结合抗原能力的抗体片段（抗体结合片段）。所产生的抗体可 以具有任何同种型。
[0131] 如本文所使用的，术语"人抗体"或"人类抗体"意图包括具有来源于人种系免疫球 蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列 编码的氨基酸残基（例如由于体外随机或定点突变或由于体内体细胞突变引入的突变）。 然而，如本文所使用的，术语"人抗体"或"人类抗体"不意图包括如下的抗体，其中来自另 一哺乳动物物种（例如小鼠）的种系的CDR序列被移植到人类框架序列上。
[0132] 如本文所使用的，"分离的抗体"意图指示如下的抗体，其基本上不含其它具有不 同抗原特异性的抗体。然而，特异性结合某种特定人靶抗原的表位、同种型或变异体的分离 抗体可能具有与其它相关抗原（例如来源于其它物种的抗原（例如物种同源物））的交叉 反应性。而且，分离的抗体可以基本不含其它的细胞材料和/或化学品。在本发明的一个 实施方案中，将一组具有不同特异性的"分离"单克隆抗体组合在明确限定的组合物中。
[0133] 如本文所使用的，术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"是指抗体分子单一 分子组合物的制备物。单克隆抗体组合物显示针对特定表位的单一结合特异性和亲和性。 因此，术语"人单克隆抗体"是指显示单一结合特异性、且具有来源于人种系免疫球蛋白序 列的可变和恒定区的抗体。人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，杂交瘤包括相互融合的B细 胞和永生化细胞，其中B细胞是从基因组中包含人重链转基因和轻链转基因的转基因或转 染色体非人动物（例如转基因小鼠）获得的。
[0134] 如本文使用的，术语"结合"在某一抗体结合预定抗原的语境中通常是亲和力相当 于Kd为大约KT 7M或者更低，例如大约KT8M或者更低，例如大约KT9M或者更低，大约KT kiM 或者更低，或者大约KT11M或者更低的结合，所述Kd例如使用BIAcore 3000设备，以抗原 作为配体，并以抗体作为分析物，通过表面等离子体共振（SPR)技术来加以确定；其结合预 定抗原的亲和力，相当于比其针对除该预定抗原或紧密相关抗原之外的非特异抗原（例如 BSA、酪蛋白）的结合亲和力的Kd至少低10倍，例如至少低100倍，例如至少低1000倍，例 如至少低10, 〇〇〇倍，例如至少低100, 〇〇〇倍的KD。亲和力相差的量取决于抗体的KD，从而 当抗体Kd非常低（即抗体特异性很高）时，针对抗原的亲和力较针对非特异抗原的亲和力 相差的量可以是至少10, 〇〇〇倍。
[0135] 如本文所使用的，术语"kd"（sec，是指特定抗体-抗原相互作用的解离速度常 数。该值又称为Iw f值。
[0136] 如本文所使用的，术语"ka"(M4X sec，是指特定抗体-抗原相互作用的结合速度 常数。
[0137] 如本文所使用的，术语"KD"（M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
[0138] 如本文所使用的，术语"KA"（M^是指特定抗体-抗原相互作用的结合平衡常数， 是通过k a除以1^获得的。
[0139] 如本文所使用的，"同种型"是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类型（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE 或 IgM)。
[0140] 术语"表位"是指能够特异结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由表面分子集团 (surface groupings of molecules)构成，例如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特异的三 维结构特征，以及特异的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于，在变性溶剂的存在 下，与前者的结合会丧失，而后者不会。表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基（也称 作表位的免疫显性组分）和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽 有效封闭的氨基酸残基（换言之，该氨基酸残基位于特异抗原结合肽的足迹（footprint) 内）。
[0141] 如本文所使用的，人抗体如果满足下述条件，则是"来源于"或"衍生自"（derive from)特定的种系序列的：该抗体是从使用人免疫球蛋白序列的系统获得的，例如通过免 疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因库，且其中所选择的 人抗体的氨基酸序列与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少90%，例如至 少95 %，例如至少96 %，例如至少97 %，例如至少98 %，或者例如至少99 %的同一性。典型 地，在重链CD3之外，来源于特定人种系序列的人抗体将显示与由该种系免疫球蛋白基因 编码的氨基酸序列不超过20个氨基酸的差异，例如不超过10个氨基酸的差异，例如不超过 5个，例如不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。
[0142] 术语"双特异性抗体"意图包括任何具有两种不同的结合特异性的抗体，即该抗体 结合两种不同的表位，这两种表位可以位于相同的靶抗原上，或者更一般地，位于不同的靶 抗原上。
[0143] 如本文所使用的，术语"效应细胞"是指免疫响应效应期中，而不是免疫响应的识 别期和激活期中所涉及的免疫细胞。免疫细胞的实例包括骨髓或淋巴来源的细胞，例如淋 巴细胞（例如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞（CTL))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬 细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞，例如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱 细胞。一些效应细胞表达特异的Fc受体，并执行特异的免疫功能。在一些实施方案中，效 应细胞能够诱导抗体依赖的细胞毒性（ADCC)，例如自然杀伤细胞能够诱导ADCC。例如，表 达FcR的单核细胞、巨噬细胞参与特异杀伤靶细胞、将抗原呈递给免疫系统的其它成分、或 结合呈递抗原的细胞等作用。在一些实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原或靶细胞。特 定FcR在效应细胞上的表达可以被体液因子例如细胞因子所调节。例如，已经发现，Fe YRI 的表达被干扰素 Y (IFN-γ)和/或G-CSF上调。这种提高的表达可增加带有Fe YRI的细 胞对靶标的细胞毒活性。效应细胞可以吞噬或裂解靶抗原或靶细胞。
[0144] "治疗"是指以缓解、减轻、阻止或根除（治愈）症状或疾病状态为目的施用有效量 的本发明治疗活性化合物。
[0145] "有效量"是指在必要的给药剂量（dosage)或时程下，可有效获得期望的治疗结果 的量。抗体的治疗有效量可随多种因素变化，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，和抗 体在个体内引发期望的响应的能力。治疗有效量同时还指抗体或抗体部分的治疗有益效应 超过任何毒性或有害效应。
[0146] 术语"IgG4_样核心铰链区"是指如下的核心铰链区，其中半胱氨酸残基与抗体分 子中其它半胱氨酸/二硫桥相比显著地更容易被还原和/或二硫键异构体化。因此，对于 具有IgG4-样核心铰链区的抗体，可以找到这样的还原性条件，在该条件下核心区的半胱 氨酸残基/二硫桥可以被还原，继而与另一个半分子中的核心铰链半胱氨酸形成二硫桥， 而同时抗体内的其它二硫桥以及抗体的整体结构仍保持完整。例如，IgG4-样核心铰链区 可以是IgG4核心铰链区，或者是另一种同种型抗体的核心铰链序列，其中核心区CPPC序列 的其中一个脯氨酸被突变，例如突变成丝氨酸，如CPPC突变成CPSC。
[0147] 在本专利申请的语境中，术语" IgG4-样CH3区"是指与IgG4 (例如人IgG4)的CH3 相同的CH3区，或者在功能上与IgG4CH3区等价的CH3区。在此语境中，"功能上等价"的 意思是所述CH3区与IgG4的CH3区相似，不形成稳定的半分子间相互作用。给定的CH3区 的稳定的半分子间相互作用的形成，可以通过用该CH3区替换IgG4的CH3,然后在实施例 31或32给定的条件下进行交换测试来加以检验。如果观察到交换，则没有形成稳定的半分 子间相互作用。例如，IgG4-样CH3区可以是这样的CH3区，其容许半分子交换的效率与来 自IgG4的CH3区相当。由此，IgG4-样CH3区可以在结构上与IgG4的CH3区相似，例如与 IgG4的CH3区的序列有超过75%，例如超过90%的相似性。然而，作为附加条件或者替代 条件，在此语境下IgG4-样CH3区可以是这样的CH3区，它在结构上与IgG4的CH3区不相 近，但具有相似的功能特征，即它不含任何参与和其它包含相同的CH3区氨基酸序列的肽 形成二硫键或共价或稳定非共价重链间键（例如盐桥）的氨基酸残基。例如，IgG4-样CH3 区可以是突变的IgGlCH3区，其中可参与半分子间CH3-CH3相互作用的一个或多个氨基酸 残基已被改变或删除。
[0148] 术语"还原性条件"或"还原性环境"是指如下的条件或环境，其中底物，在这里是 抗体核心区中的半胱氨酸残基，更可能被还原而不是被氧化。
[0149] 术语"还原剂"是指这样的化合物，它还原它的环境中的分子，即改变其环境中的 分子，使之更加被还原（more reduced)或者更具有还原性（more reducing)。还原剂通过 提供电子发挥作用，这样其自身在还原了底物之后被氧化。因此，还原剂是提供电子的作用 齐U。还原剂的实例包括二硫苏糖醇（DTT)、巯基乙醇、半胱氨酸、巯基乙醇酸盐（或酯）、半 胱胺（cysteamine)、谷胱甘肽和硼氢化钠。在一个实施方案中，还原剂不包括酶。
[0150] "二硫键形成"是指在一个或两个多肽内存在的两个半胱氨酸之间形成共价键的 过程，其可图不为〃 _s--s_〃。
[0151] "二硫键还原"是指断裂二硫键，从而形成两个巯基（-SH基团）的过程。
[0152] 术语"二硫键异构化"是指不同半胱氨酸之间二硫键的交换，即二硫键改组 (shuffling)〇
[0153] "蛋白质二硫键异构酶"是指催化蛋白质中二硫键的异构化的酶。
[0154] 在二硫桥还原的语境中使用的"无显著还原"一般是指，在溶液中发生还原的所述 二硫桥少于10%，例如少于5 %，例如少于2 %，或者少于1 %。
[0155] 发明的各方面和实施方案
[0156] 如上文所述，在第一个主要方面中，本发明涉及一种用于产生双特异性抗体的体 外方法，所述方法包括如下步骤：
[0157] a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含IgG4_样CH3区，
[0158] b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述 第二抗体包含IgG4-样CH3区，
[0159] c)在允许核心铰链区的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所述 第一和第二抗体，和
[0160] d)获得双特异性抗体。
[0161] 在优选实施方案中，本发明方法中使用的第一和第二抗体是单克隆抗体。单克隆 抗体可以，例如，通过首先由Kohler et al. (14)描述的杂交瘤方法产生，或者可以通过重 组DNA方法产生。单克隆抗体还可以用例如Clackson等（15)和Marks等（16)介绍的技 术从噬菌体抗体文库中分离。单克隆抗体可以从任何合适的来源获得。因此，例如，可以用 感兴趣的抗原，例如以在表面上表达该抗原的细胞或者编码感兴趣的抗原的核酸的形式， 免疫小鼠，从该小鼠获得脾B细胞,从该小鼠脾B细胞制备杂交瘤,从该杂交瘤获得单克隆 抗体。还可以从来自经过免疫的人或非人哺乳动物（例如大鼠、狗、灵长动物等）的抗体表 达性细胞衍生的杂交瘤获得单克隆抗体。
[0162] 在一个实施方案中，本发明的抗体是人抗体。指定的人单克隆抗体可用携带部分 人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括 在本文中分别被称作HuMb小鼠和KM小鼠的小鼠，并在本文中统称为"转基因小鼠"。
[0163] HuMAb小鼠含有人免疫球蛋白基因迷你座位（miniloci)，其编码未重排的人重 链（μ和Y)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及使内源μ和κ链座位失活的靶定突变 (targeted mutations) (17)。因此，所述小鼠表现出小鼠 IgM或κ表达降低，在应答于 免疫时，被引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变而产生高亲和性的人 IgG, κ单克隆抗体（17-20)。HuMb小鼠的制备在参考文献21-25中有详细介绍。另见 US 5, 545, 806,US 5, 569, 825,US5, 625, 126,US 5, 633, 425,US 5, 789, 650,US 5,877,397, US 5,661，016、US5, 814, 318、US 5, 874, 299、US 5, 770, 429、US 5, 545, 807、WO 98/24884、 W094/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918 和 WO 01/09187。
[0164] HCo7小鼠在它们的内源轻链（kappa)基因中有一个JKD中断（disruption)(如 Chen等（26)所述），在它们的内源重链基因中有一个CMD中断（如WO 01/14424的实施例 1所述），一个KCo5人kappa轻链转基因（如Fishwild等（25)所述），和一个HCo7人重链 转基因（如US 5, 77〇, 4?所述）。
[0165] HCol2小鼠在其内源轻链（kappa)基因中有一个JKD中断（如Chen等（26)所 述），在其内源重链基因中有一个CMD中断（如WO 01/14424的实施例1所述），一个KCo5 人kappa轻链转基因（如Fishwild等（25)所述），和一个HCol2人重链转基因（如WO 01/14424的实施例2所述）。
[0166] 在KM小鼠品系中，内源小鼠 kappa轻链基因如Chen等（26)所述的那样被纯合地 中断，并且内源小鼠重链基因如WO 01/09187的实施例1所述那样被纯合地中断。这种小 鼠品系携带一个人kappa轻链转基因，KCo5,如Fishwild等（25)所述。该小鼠种系还携带 一个人重链转染色体，其包括染色体14的片段hCF (SC20)，如WO 02/43478所述。
[0167] 来自这些转基因小鼠的脾细胞可用于根据众所周知的技术产生分泌人单克隆抗 体的杂交瘤。这些转基因非人类动物、包含编码表达本发明所用抗体的可操作核酸序列的 非人类动物、用一个或多个编码靶标的核酸序列稳定转染的非人类动物等，是本发明的额 外特征。
[0168] 本发明使用的人单克隆或多克隆抗体或者本发明使用的来源于其它物种的抗体， 还可以用转基因方式来产生，其是通过产生另一种用目的免疫球蛋白重链和轻链序列转基 因的非人类哺乳动物或植物，并由所述动物或植物生产可回收的形式的抗体。就哺乳动物 中的转基因生产而言，抗体可以在山羊、牛或其他哺乳动物的奶中产生并回收。见例如US 5, 827, 690、US5, 756, 687、US 5, 750, 172 和 US 5, 741，957。
[0169] 进一步，本发明使用的人类或其它抗体可以通过展示型（display-type)技术产 生，这类技术包括但不限于噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示和其它技术，使用本 领域众所周知的技术，并且可以对所得的分子进行额外的突变，例如亲和性突变，因为这些 技术是本领域熟知的（见例如参考文献27, 28和30 (噬菌体展示），29 (核糖体展示），31-35 和US 5, 733, 743)。如果使用展示技术产生非人类抗体，则这些抗体可以被人源化。
[0170] 如上文解释的，在一些实施方案中，本发明方法中使用的第一和/或第二抗体是 IgG4抗体。然而，本发明使用的抗体理论上可以是任何同种型，只要CH3区中的序列允许半 分子交换即可。例如，本发明方法中使用或获得的抗体可以包括在SEQ ID NO: 19-22中显 示的任何恒定区序列（在任何指明的突变位置之外）。
[0171] 因此，在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二抗体在核心铰链区中包含 CPPC序列。在另一个实施方案中，第一和/或第二抗体包含IgG4-样核心铰链区。例如，在 一些实施方案中，所述第一和/或第二抗体是在核心铰链区中包含CX 1X2C序列的抗体，其中 &和X 2可以是任何氨基酸，但X JP X 2不能都是脯氨酸。在另一个实施方案中，所述第一和 /或第二抗体是在核心铰链区中包含CX3PC或CPX 3C序列的抗体，其中X3可以是除脯氨酸之 外的任何氨基酸。在进一步的实施方案中，所述第一和/或第二抗体是在核心铰链区中包 含CSPC、CPSC、CRPC、CPRC、CGHC或CPHC序列的抗体。上述突变可以通过例如本领域众所 周知的定点突变来引入。
[0172] 同种型的选择通常由期望的效应功能（例如⑶C诱导作用或ADCC中的活性）来 指导。同种型的实例包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4(见例如SEQ ID N0:19-22)。可以使用 人轻链恒定区kappa或lambda中的任何一种。如果希望的话，本发明使用的抗体类型可以 通过已知的方法加以转换。例如，本发明使用的原本为IgM、IgGl或IgG2的抗体可以被类 型转换为本发明的IgG4抗体。因此，本发明抗体的效应物功能可以通过同种型转换而变为 例如IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgD，IgA，IgE或IgM抗体，用于各种治疗用途。
[0173] 在一个实施方案中，本发明使用的第一和/或第二抗体是全长抗体。在另一个实 施方案中，本发明使用的第一和/或第二抗体是抗体片段。
[0174] 在本发明的方法的一个实施方案中，第一和/或第二抗体包含IgG4CH3区，例如具 有图18所示序列（SEQ ID N0:22)的IgG4CH3区。
[0175] 然而，在本发明的方法的另一个实施方案中，第一和/或第二抗体包含非IgG4同 种型的CH3区，其中该CH3区不包含，或者经过了修饰而不包含任何这样的氨基酸残基：所 述氨基酸残基可以参与和包含相同的CH3区氨基酸序列的其它肽形成二硫键或者共价的 或稳定非共价的重链间键。
[0176] 例如，在此处的一个进一步的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有图18所 示序列（SEQ ID NO: 19)的CH3区，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨 基酸替换：238位的Arg (R)已被Gln (Q)取代；239位的Asp (D)已被Glu (E)取代；292位 的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被 Leu(L)取代。
[0177] 在一个优选实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所不序列（SEQ ID NO: 19)的CH3区，其中292位的Lys(K)已被Arg (R)取代。
[0178] 在另一个实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列（SEQ ID NO: 19)的CH3区，但是其中292位的Lys (K)已被Tyr (W)或Phe (F)取代。
[0179] 在另一个进一步的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列 (SEQ ID N0:20)的CH3区，其中CH3区已被修饰从而发生了下列氨基酸替换中的一种或多 种或者全部5种：234位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；276位的Met(M)已被Val (V)取代； 288位的Lys (K)已被Arg (R)取代；298位的Gln (Q)已被Glu (E)取代；和324位的Pro (P) 已被Leu(L)取代。
[0180] 在一个优选的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列（SEQ ID NO: 20)的CH3区，其中234位的Arg(R)已被Gln (Q)取代。
[0181] 在一个进一步优选的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所不序列 (SEQ ID NO: 20)的CH3区，其中234位的Arg (R)已被Gln (Q)取代；且324位的Pro (P)已 被Leu (L)取代。
[0182] 在另一个进一步的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列 (SEQ ID N0:21)的CH3区，其中CH3区已被修饰从而发生了下列氨基酸替换中的一种或多 种或全部10种：285位的Arg (R)已被Gln (Q)取代；314位的Ser (S)已被Asn (N)取代；322 位的Asn (N)已被Lys (K)取代；327位的Met (M)已被Val (V)取代；339位的Lys (K)已被 Arg(R)取代；349位的Gln (Q)已被Glu (E)取代；352位的lie (I)已被Val (V)取代；365位 的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已被Tyr(Y)取代；和375位的Pro(P)已被 Leu(L)取代。
[0183] 在一个优选实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所不序列（SEQ ID NO: 21)的CH3区，其中285位的Arg (R)已被Gln (Q)取代。
[0184] 在一个优选的实施方案中，第一和/或第二抗体包含具有如图18所示序列（SEQ ID N0:21)的CH3区，其中285位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；且375位的Pro(P)已被 Leu(L)取代。
[0185] 在本发明方法的一个进一步的实施方案中，所述第一抗体在核心铰链区中包 含CPPC并包含IgG4-样CH3区，且其中所述第二抗体在核心铰链区中包含CPPC并包含 IgG4-样 CH3 区。
[0186] 如上文解释的，在一个主要方面中，本发明涉及一种用于产生双特异性抗体的体 外方法，所述方法包括如下步骤：
[0187] a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含IgG4_样CH3区，
[0188] b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述 第二抗体包含IgG4-样CH3区，
[0189] c)在允许核心铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所 述第一和第二抗体，和
[0190] d)获得双特异性抗体。
[0191] 在本发明方法的一个实施方案中，选择步骤c)中的条件，使得核心铰链区之外不 发生显著的二硫桥还原或异构化。
[0192] 在另一个实施方案中，步骤c)中的还原条件是这样的条件：所述条件刺激核心铰 链区的进行二硫键交换的内在活性。
[0193] 在本发明进一步的实施方案中，步骤c)包括还原剂的添加。在进一步的实施方案 中，步骤c)包括添加一种从下组选出的作用剂：谷胱甘肽、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、β -巯 基乙醇和半胱胺（cysteamine)。
[0194] 在本发明的方法的一个实施方案中，所述作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶 液的氧化还原势等于（equal to)或者还原性更高于（more reducing than)在实施例31所 述的条件下由1 μ M谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于在实施例31 所述的条件下由10 μ M谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由50 μ M 谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由0. ImM谷胱甘肽产生的氧化还 原势。
[0195] 在进一步的实施方案中，所述作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液的氧化还 原势
[0196] -等于或者还原性更高于在实施例31所述的条件下由1 μ M谷胱甘肽产生的氧化 还原势，例如等于或者还原性更高于在实施例31所述的条件下由10 μ M谷胱甘肽产生的氧 化还原势，例如等于或者还原性更高于由50 μ M谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或 者还原性更高于由0. ImM谷胱甘肽产生的氧化还原势。且
[0197] -等于或者还原性低于（less reducing than)在实施例31所述的条件下由IM 谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性低于由IOOmM谷胱甘肽产生的氧化还原 势，等于或者还原性低于由15mM谷胱甘肽产生的氧化还原势。
[0198] 在一个实施方案中，其中第一抗体在核心铰链区中具有CPPC序列且/或第二抗体 在核心铰链区中具有CPPC序列，优选的是，在步骤C)中产生的溶液的氧化还原势等于或者 还原性更高于在实施例35所述的条件下由ImM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者 还原性更高于由2mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由4mM谷胱 甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由6mM谷胱甘肽产生的氧化还原势， 例如等于或者还原性更高于由8mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高 于由IOmM谷胱甘肽产生的氧化还原势。
[0199] 在进一步的实施方案中，所述还原剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液的氧化还 原势
[0200] -等于或者还原性更高于在实施例35所述的条件下由ImM谷胱甘肽产生的氧化还 原势，例如等于或者还原性更高于由2mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原 性更高于由4mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由6mM谷胱甘肽 产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由8mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如 等于或者还原性更高于由IOmM谷胱甘肽产生的氧化还原势，且
[0201] -等于或者还原性更低于于由IM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原 性低于由IOOmM谷胱甘肽产生的氧化还原势，等于或者还原性低于由15mM谷胱甘肽产生的 氧化还原势。
[0202] 在本发明方法的一个实施方案中，步骤c)包括将所述抗体在还原型谷胱甘肽的 存在下在20°C或更高的温度下，例如在37°C下，温育至少一个小时，例如至少2个小时，例 如至少5个小时，例如至少10个小时。
[0203] 在本发明方法的进一步的实施方案中，选择步骤c)中的条件，使得用本文所述的 大小排阻色谱进行确定时（其中先于起始材料的抗体洗脱的峰表示聚集物的形成），在所 得的组合物中有少于10 %，例如少于5 %，例如少于2 %，例如少于1 %的抗体分子处于聚集 状态。
[0204] 在本发明的体外方法的一个实施方案中，该方法包括添加具有蛋白质二硫键异构 酶活性的蛋白质，例如roi。在本发明的体外方法的另一个实施方案中，该方法不包括添加 具有蛋白质二硫键异构酶活性的蛋白质，例如PDI。
[0205] 在本发明的体外方法的一个实施方案中，该方法不包括添加活细胞或细胞提取 物。
[0206] 如上文解释的，本发明方法中使用的第一和第二抗体在结合特异性方面有不同， 即结合不同的表位。原则上，任何特异性的组合（any combinations of specificities) 均可用作本发明方法的起始材料。另外，本发明的方法并不限于仅以两种不同的抗体作为 起始材料。因此，本发明的方法还可以用三种或更多种抗体作为起始材料来实施。在这样 的实施方案中，本发明方法的步骤d)中获得的组合物可以含有多种双特异性抗体。
[0207] 在本发明方法的一个实施方案中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白， 例如 erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-l、CD19、CD20、CD4、CD38 或 CXCR5,或者针对 B 细胞 受体信号成分CD79a或CD79b，的结合特异性。在另一个实施方案中，第一抗体具有针对 肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白，例如 erbBI、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD 19、CD20、CD4、CD38 或CXCR5,的结合特异性；而第二抗体具有针对肿瘤细胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、 erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4 或 CXCR5,的结合特异性。
[0208] 在一个进一步的实施方案中，第一抗体具有针对erbBl的结合特异性，而第二抗 体具有针对erbB2的结合特异性。
[0209] 在另一个实施方案中，第一抗体具有针对CD19的结合特异性，而第二抗体具有针 对⑶20的结合特异性。
[0210] 在一个进一步的实施方案中，第一抗体具有针对CD38的结合特异性，而第二抗体 具有针对CD34的结合特异性。
[0211] 在一个更进一步的实施方案中，第一抗体具有针对CD4的结合特异性，而第二抗 体具有针对CXCR5的结合特异性。
[0212] 在本发明方法的另一个实施方案中，第一抗体具有针对病原微生物的结合特异 性。在一个进一步的实施方案中，第一抗体具有针对病原微生物的结合特异性，而第二抗体 具有针对效应细胞蛋白，例如⑶3、⑶25、⑶28、⑶16、⑶89、⑶32或⑶1，的结合特异性。
[0213] 双特异性抗体还可以用于将化疗剂更特异性地靶定到该药剂要作用的细胞。因 此，在本发明方法的进一步实施方案中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白，例如 erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4 或 CXCR5,的结合特异性，而第二抗体 具有针对化疗剂的结合特异性。
[0214] 此外，通过使双特异性抗体包含针对血清蛋白质的结合特异性，可以改变抗体的 血清半衰期。例如，可以通过使双特异性抗体包含针对血清白蛋白的结合特异性而延长血 清半衰期。因此，在本发明方法的一个进一步的实施方案中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或 肿瘤细胞蛋白，例如 erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-I、CD19、CD20、CD4 或 CXCR5,的结合 特异性，而第二抗体具有针对血液蛋白，例如血清白蛋白，的结合特异性。
[0215] 第二结合特异性还可用于将抗体靶定到特定的组织，例如脑或肝脏。因此，在本 发明方法的一个进一步的实施方案中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白，例如 erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4 或 CXCR5,的结合特异性，而第二抗体 具有针对脑蛋白如铁传递蛋白，或肝蛋白的结合特异性。
[0216] 而且，第二结合特异性可用于将凝血因子靶定到特定的期望作用位点。例如，具 有针对肿瘤细胞的第一结合特异性和针对凝血因子的第二结合特异性的双特异性抗体能 够将凝血作用导向肿瘤，从而制止肿瘤生长。因此，在本发明方法的一个进一步实施方案 中，第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白，例如erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、 ⑶19、⑶20、⑶4或CXCR5,的结合特异性，第二抗体具有针对参与凝血作用的蛋白，例如组 织因子，的结合特异性。
[0217] 在本发明进一步的实施方案中，第一和/或第二抗体与从下组选出的化合物相 连：细胞毒剂；放射性同位素；前药或药物，例如紫杉烷；细胞因子；趋化因子和补体，例如 Clq。这些化合物可以使针对靶细胞的杀伤更有效，例如在癌症治疗中。或者，可以将化合 物与所得的双特异性抗体偶联，即在发生了半分子交换之后偶联。
[0218] 在本发明方法的进一步的实施方案中，该方法还包括使步骤c)中获得的化合物 处于非还原或还原性较低的条件下，以便终止进一步的半分子交换。这可以通过本领域已 知的各种方法实现，例如对所得组合物进行透析或者基于大小的色谱，以除去小分子还原 剂。
[0219] 在本发明方法的更进一步的实施方案中，通过进行两个半分子的化学交联使所得 的双特异性抗体稳定化，从而阻止任何进一步的交换的发生，即便该双特异性抗体随后被 用于本会使抗体发生半分子交换的条件，例如体内条件。因此，在一个实施方案中，本发明 的方法包括进一步的步骤：
[0220] a)使铰链区中的半胱氨酸化学交联，例如通过使用含有马来酰亚胺的化合物，例 如双马来酰亚胺己烧（bis-maleimidohexane)，
[0221] b)使半分子上的碳水化合物侧链化学交联，例如通过高碘酸盐（periodate)氧 化，随后使醒基与合适的交联剂如己二酸二酰肼（adipine dihydrazide)反应，
[0222] 或
[0223] c)使CH3区中不对称引入的半胱氨酸交联，例如以Merchant等（36) -文（本文通 过提述纳入该文）中描述的方式，例如使用一种或多种如下的组合（援引SEQ ID N0:19):
[0224] -第一抗体中的D282C与第二抗体中的K275C，
[0225] -第一抗体中的D282S与第二抗体中的K275S，
[0226] -第一抗体中的Y232C与第二抗体中的S237C，
[0227] -第一抗体中的Y232C与第二抗体中的D239C，
[0228] -第一抗体中的Y232C与第二抗体中的E240C，
[0229] -第一抗体中的L234C与第二抗体中的S237C，
[0230] -第一抗体中的T277C与第二抗体中的V280C，
[0231] -第一抗体中的V280C与第二抗体中的K275C，
[0232] 在进一步的方面中，本发明涉及使通过交联方法，例如上述三种交联方法中的任 何一种，获得的或者可以获得的稳定化的双特异性抗体。
[0233] 不论所得的双特异性抗体是否已通过交联被稳定化，本发明的方法，在一些实施 方案中，可以进一步包含纯化双特异性抗体的步骤。含有双特异性抗体的混合物可以用标 准色谱技术加以纯化，例如（但不限于）标准蛋白A色谱，蛋白G，蛋白L，阳离子/阴离子 交换色谱，大小排阻色谱，疏水相互作用色谱，嗜硫（thiophilic)色谱，或使用旨在用于捕 获IgG分子的配体（蛋白A模拟物，Llama Vhh配体等）。或者，可以用标准技术沉淀IgG混 合物，例如盐促沉淀（硫酸铵），添加有机溶剂（DMSO,乙醇），改变pH或非离子聚合物（聚 乙二醇）。在另一种情境下，可以使用能浓集IgG分子的膜用过滤技术处理混合物。为了将 双特异性抗体纯化到完全同质，可能需要将所有这些技术组合使用，因为某些混合物可能 仍然含有非常接近于（next to)双特异性抗体的亲本IgG分子。然后可能需要额外的纯化 步骤以将双特异性抗体与亲本单特异性IgG分子分离开来。这可以通过，例如，先使用针对 第一结合亲和特异性的亲和柱进行结合和洗脱，然后使用针对第二结合特异性的亲和柱进 行结合和洗脱的纯化方法来实现。在一个优选的实施方案中，特别是在没有实施化学交联 的情况下，纯化在可防止进一步半分子交换的条件，例如非还原条件下进行。
[0234] (纯化的）双特异性抗体的数量、质量和纯度可以用常规的生物化学技术加以分 析，这些技术例如吸附测量、HP-SEC、SDS-PAGE、非变性PAGE和RP-HPLC。能够区分双特异性 抗体与亲本IgG分子的技术是特别感兴趣的。这些技术的实例包括（但不限于）IEF、cIEF、 CIEX和质谱（ESI、MALDI)，它们可以基于电荷和/或质量高精度地分离和检测分子。双特异 性抗体的双重结合特异性可以用多种不同的结合测定模式进行估计，例如使用ELISA、RIA、 表面等离子体共振（SPR)、生物膜层干扰测定（Boi-layer Interferometry)技术、DELFIA、 FRET、ECL、Gyros 和 AlfaScreen0
[0235] 在一个实施方案中，半分子交换可以在有利于形成针对两种目的抗原之一的双特 异性抗体的条件下实施。例如，考虑针对抗原X和Y的抗体。如果用过量的针对抗原X的 抗体实施交换，例如5倍过量或10倍过量，那么大多数或者全部针对抗体Y的抗体将变成 双特异性（即识别抗原X和Y)。
[0236] 在这个步骤之后，可以在基质固定的抗原Y和亲和柱色谱上对双特异性抗体进行 纯化。被结合的抗体中高度富集了期望的双特异性抗体。未结合的针对抗原X的抗体可用 于重复上述循环。
[0237] 在需要稳定化以防止体内交换的情况下，可以如上所述地对双特异性抗体进行交 联。在化学交联之后，可以通过用过量的针对抗原Z的抗体进行额外的交换反应，随后用固 定在基质上的抗原Z吸附含有抗Z的抗体（例如通过亲和柱色谱），将未稳定化的抗体从稳 定化的抗体中纯化出来。这样，未结合的组分将含有期望的稳定化双特异性抗体。
[0238] 在本发明方法的一个更进一步的实施方案中，该方法还包括将所得的双特异性抗 体配制供治疗应用的步骤。这包括将治疗有效量的双特异性抗体配制在适于人体使用，特 别是适合于肠胃外给药，例如静脉内注射的水溶液中。
[0239] 在进一步的方面中，本发明涉及一种产生双特异性抗体的体外方法，所述方法包 括如下步骤：
[0240] a)提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含核心铰链区中的 CPPC序列，以及IgG4-样CH3区，
[0241] b)提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述 第二抗体包含核心铰链区中的CPPC序列，以及IgG4-样CH3区，和
[0242] c)在允许核心铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所 述第一和第二抗体，和
[0243] d)获得双特异性抗体。
[0244] 优选地，在步骤c)中已经添加了还原剂，其中该作用剂的浓度使得步骤c)中产 生的溶液的氧化还原势等于或者还原性更高于在实施例35所述的条件下由ImM谷胱甘肽 产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由2mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如 等于或者还原性更高于由4mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由 6mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由SmM谷胱甘肽产生的氧化 还原势，例如等于或者还原性更高于由IOmM谷胱甘肽产生的氧化还原势。
[0245] 在一个进一步的方面中，本发明涉及一种组合物，其包含通过本文所述任何一种 本发明方法获得或可以获得的双特异性抗体。
[0246] 在另一个的主要方面中，本发明涉及一种分离的双特异性抗体，其包含两个 IgG4_ 样 CH3 区。
[0247] 在一个实施方案中，所述抗体在核心铰链区中包含一个或两个CPPC序列。
[0248] 在另一个实施方案中，所述抗体在核心铰链区中包含一个或两个CX1X2C序列，其 中&和X 2可以是任何氨基酸，但X JP X 2不能都是脯氨酸。
[0249] 在一个进一步的实施方案中，所述抗体在核心铰链区包含一个或两个CX3PC或 CPX3C序列，其中&可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
[0250] 在一个更进一步的实施方案中，所述抗体在核心铰链区包含一个或两个CSPC、 CPSC、CRPC 或 CPRC 序列。
[0251] 在所述分离的双特异性抗体的一些实施方案中，第一和/或第二CH3区属于非 IgG4同种型，其中该CH3序列不包含，或经过修饰而不包含，任何这样的氨基酸残基：所述 氨基酸残基可以参与和包含相同CH3区氨基酸序列的其它肽形成二硫键或共价或稳定的 非共价重链间键。
[0252] 在其一个进一步的实施方案中，第一和/或第二CH3区具有如图18中所示的序 列（SEQ ID NO: 19)，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换：238 位的Arg(R)已被Gln(Q)取代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被 Arg(R)取代；302位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；和328位的Pro(P)已被Leu(L)取代。
[0253] 在另一个进一步的实施方案中，所述第一和/或第二CH3区具有如图18中所示的 序列（SEQ ID N0:20)，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换： 234位的Arg (R)已被Gln (Q)取代；276位的Met (M)已被Val (V)取代；288位的Lys (K)已 被Arg (R)取代；298位的Gln (Q)已被Glu (E)取代；和324位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
[0254] 在一个更进一步的实施方案中，所述第一和/或第二CH3区具有如图18中所示的 序列（SEQ ID N0:21)，其中该CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换： 285位的Arg (R)已被Gln (Q)取代；314位的Ser (S)已被Asn (N)取代；322位的Asn (N)已 被Lys (K)取代；327位的Met (M)已被Val (V)取代；339位的Lys (K)已被Arg (R)取代；349 位的Gln(Q)已被Glu(E)取代；352位的Ile(I)已被Val (V)取代；365位的Arg(R)已被 His (H)取代；366位的Phe (F)已被Tyr (Y)取代；375位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
[0255] 在一个更进一步的实施方案中，本发明抗体的第一和/或第二CH3区是IgG4CH3 区。
[0256] 在一个更进一步的方面中，本发明涉及一种组合物，例如包含本发明的双特异性 抗体或者通过如上所述的任何一种本发明的方法获得或者可以获得的双特异性抗体的药 物组合物，其用于作为药物，例如用作治疗癌症或感染性疾病的药物。
[0257] 在一个更进一步的方面中，本发明涉及包含本发明的双特异性抗体或者通过如上 所述的任何一种本发明的方法获得或者可以获得的双特异性抗体的组合物用于制备治疗 癌症或感染性疾病的药剂的用途。
[0258] 本发明的方法还可用于选择特别令人感兴趣的或有效的靶结合特异性组合 (combination of target binding specificities)。例如使用本发明的方法，可以由一系 列具有不同结合特异性的抗体制备一系列或"阵列"（matrix)不同的双特异性抗体。然后 可以测试所得的双特异性抗体系列或阵列的期望的生物学性质，从而选择出最佳的组合。
[0259] 因此，在一个更进一步的方面中，本发明涉及一种用于选择具有期望性质的双特 异性抗体的方法，所述方法包括如下步骤：
[0260] a)提供一系列抗体，其中每种抗体均具有不同的祀点特异性（each antibody has a different target specificity)，并且其中每种抗体均包含IgG4_样CH3区，
[0261] b)将所述系列中的每种抗体与所述系列中的另一种抗体在还原条件下一起进行 温育，从而产生一系列的抗体混合物，其中每种混合物均包含不同的双特异性抗体（each mixture contains a different bispecific antibody),
[0262] c)测定所得系列抗体混合物的给定的期望性质，和
[0263] d)选择具有所述期望性质的双特异性抗体混合物。
[0264] 上述方法中的步骤b)可以按照上文关于步骤c)的描述加以实施。
[0265] 在一个实施方案中，所测试的期望性质是肿瘤细胞杀伤。
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[0306] 进一步通过如下的实施例进行举例说明本发明，这些实施例不应理解为对本发明 的进一步限制。 实施例
[0307] 实施例1 :寡核苷酸引物和PCR扩增
[0308] 寡核苷酸引物由Isogen Bioscience (Maarssen,荷兰）合成并定量。引物在H20 中溶解为IOOpmol/μ 1，并保存于-20°C。下面给出了全部PCR引物和测序引物的汇总。PCR 根据制造商的说明使用PfuTurbo? Hotstart DNA聚合酶（Stratagene, Amsterdam,荷 兰）。每个反应混合物含有200μΜ混合dNTP(Roche Diagnostics，Almere,荷兰），正向和 反向引物各6. 7pmol，IOOng基因组DNA或Ing质粒DNA，和1单位PfoTurbo1? Hotstart DNA聚合酶，溶于总体积20 μ 1的PCR反应缓冲液（与聚合酶一起提供）中。PCR反应使用 TGradient Thermocycler 96(Whatman Biometra，Goettingen,德国），进行32 个循环的程 序：95°C变性 2min、95°C 30sec、60-70°C梯度（或另一特定退火温度）30sec、和 72°C 3min 共30个循环；最后在72°C延伸lOmin。如果合适，将PCR混合物保存于4°C直至进一步的 分析或处理。
[0309] 实施例2:琼脂糖凝胶电泳
[0310] 琼脂糖凝胶电泳根据Sambrook(37)使用50ml凝胶在lx Tris乙酸EDTA缓冲液 中进行。通过在凝胶中掺入溴化乙锭，并在UV光下进行观察来使DNA可视化。使用C⑶相 机和图像分析系统（GeneGnome ;Syngene, via Westburg B. V.，Leusden,荷兰）记录凝胶图 像。
[0311] 实施例3:PCR产物的分析、纯化及酶解
[0312] 使用 MinElute PCR 提纯试剂盒（Qiagen, via Westburg, Leusden,荷兰；产品号 28006)根据制造商的使用说明提纯期望PCR片段。用UV分光光度计定量分离的DNA，通过 琼脂糖凝胶电泳估计品质。
[0313] 或者，使用1% Tris乙酸EDTA琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳来分离PCR或消化 产物（例如当存在多种片段时），。将期望的片段从凝胶中切下，用QIAEX II凝胶提取试剂 盒（Qiagen ;产品编号20051)根据制造商的使用说明进行回收。
[0314] 实施例4:通过UV分光光度计对DNA进行定量
[0315] 用 NanoDrop ND-1000 分光光度计（Isogen Life Science, Maarssen,荷兰）根 据制造商的使用说明测定核酸的光密度。通过分析260nm的光密度（OD) (IOD26tol单位= 50 μ g/ml)来测量DNA的浓度。对于所有样品，使用溶解核酸的缓冲液作为参考。
[0316] 实施例5:限制性酶消化
[0317] 限制酶和补充材料系从 New England Biolabs (Beverly, MA, USA)或 Fermetas (Vilnius,立陶宛）获得，并根据制造商的使用说明来使用。
[0318] 在最终体积为10 μ 1 (反应体积视需要比例放大）的合适缓冲液中用5单位的酶 消化DNA(IOOng)。将消化体系在推荐的温度下温育至少60min。对于需要使用不相容的缓 冲液或不同温度要求的限制酶进行双重消化的片段，顺次进行消化。如果需要，通过琼脂糖 凝胶电泳和凝胶提取对消化产物进行纯化。
[0319] 实施例6: DNA片段的连接
[0320] 用 Quick Ligation Kit (New England Biolabs)根据制造商的使用说明进行 DNA 片段的连接。对于每个连接体系，将载体DNA与大约3倍摩尔过量的插入DNA进行混合。
[0321] 实施例7:大肠杆菌（E. coli)的转化
[0322] 根据制造商的说明使用热激法将质粒DNA(l-5l·! I DNA溶液，通常为2μ 1 DNA连接混合物）转化到One Shot DH5a-TlK* MACH-I TIk感受态大肠杆菌细胞 (Invitrogen，Breda,荷兰；产品编号12297-016)中。接着，将细胞涂布在含有50 μ g/ml氨 苄青霉素的Luria-Bertani (LB)琼脂平板上。平板在37°C温育16-18h，直到细菌菌落变得 明显。
[0323] 实施例8:通过PCR筛选细菌菌落
[0324] 使用HotStarTaq Master Mix试剂盒（Qiagen ;产品编号203445)和合适的正向和 反向引物（附录1)，通过菌落PCR筛选细菌菌落中含有期望序列的载体的存在。用20μ 1吸 液管尖端轻轻碰触所选克隆，并2ml LB中短暂碰触以进行小量培养，然后重新悬浮在PCR 混合物中。PCR使用TGradient Thermocycler 96,使用35个循环的程序：95°C变性15min ; 35个循环的94°C 30sec、55°C 30sec、和72°C 2min ;然后在72°C进行IOmin的最终延伸步 骤。如果合适，将PCR混合物保存于4°C直至通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
[0325] 实施例9:从大肠杆菌培养物分离质粒DNA
[0326] 使用下列的Qiagen产试剂盒（购自Westburg, Leusden,荷兰）根据制造商的说 明从大肠杆菌培养物分离质粒DNA。对于大量质粒制备（50-150ml培养物），使用HiSpeed Plasmid Maxi试剂盒（产品编号12663)或HiSpeed Plasmid Midi试剂盒（产品编号 12643)。对于小量质粒制备（±2ml培养物），使用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒（产品 编号27106)，将DNA洗脱于50 μ 1洗脱缓冲液（与试剂盒一起提供）中。
[0327] 实施例10: DNA测序
[0328] 质粒DNA用本领域已知的标准程序进行测序。使用Vector NTI软件 (Informax，0xford，UK)进行序列分析。
[0329] 实施例11:在HEK-293F细胞中瞬时表达
[0330] 从Invitrogen获得Freestyle? 293-F (-种适于悬浮生长和化学限定FreestyIe 培养基的HEK-293亚克隆，例如HEK-293F)细胞，并用293fectin (Invitrogen)根据制造商 的规程进行转染。
[0331] 实施例12:pTomG4, 一种用于表达可变重链区和人IGG4恒定区的载体，的构建
[0332] 从一名志愿者血液样品中分离基因组DNA，用其作为模板，使用引物IGG4gene2f 和IGG4gene2r (见下表）PCR扩增IgG4重链的完整基因组恒定区，同时引入合适的用于克 隆进入哺乳动物表达载体pEE6.4(Lonza Biologies)的限制位点。对PCR片段进行纯化 并克隆到PEE6. 4中。为此，用HindIII和EcoRI消化PCR产物，随后将限制酶热失活。用 HindIII和EcoRI消化pEE6. 4载体，随后将该限制酶热失活，并用虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase)使载体片段去磷酸化，随后将该磷酸酶热失活。连接IgG4片段和 pEE6. 4HindIII/EcoRI去磷酸化载体，并转化进入感受态MACHI-TIk细胞（Invitrogen)。使 3个克隆在LB中生长，并从小培养物（I. 5mL)分离质粒DNA。限制性消化显示出与将IgG4 片段克隆到PEE6. 4载体中一致的模式。将来自2个克隆的质粒DNA转化进入0册〇-!^大 肠杆菌，分离质粒DNA，并通过分析插入物的序列对构建体进行检查，发现一个克隆与一种 来自Genbank数据库的基因组IgG4克隆相同，只是在内含子中有一些微小差异。这些差异 可能是由于多态性或者Genbank序列的序列错误导致的。将该质粒命名为pTomG4。
[0333] 表1:引物序列
[0334]
【权利要求】
1. 一种用于产生双特异性抗体的体外方法，所述方法包括如下步骤：a) 提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含IgG4-样CH3区，b) 提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述第二 抗体包含IgG4-样CH3区，c) 在允许核心铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下共同温育所述第 一和第二抗体，和d) 获得双特异性抗体。
2. 权利要求1的体外方法，其中所述第一抗体在核心铰链区中包含CPPC序列。
3. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一抗体包含IgG4-样核心铰链区。
4. 权利要求1或3中任一项的体外方法，其中所述第一抗体是在核心铰链区中包含 CX&C序列的抗体，其中&和X 2可以是任何氨基酸，但X :和X 2不能都是脯氨酸。
5. 权利要求4的体外方法，其中所述第一抗体是在核心铰链区中包含CX3PC或CPX3C序 列的抗体，其中乂3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
6. 权利要求5的体外方法，其中所述第一抗体是在核心铰链区中包含CSPC、CPSC、 CRPC、CPRC、CGHC 或 CPHC 序列的抗体。
7. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一抗体包括IgG4CH3区。
8. 权利要求1-6中任一项的体外方法，其中所述第一抗体包含非IgG4同种型的CH3 区，其中该CH3序列不包含或者已被修饰而不包含任何如下所述的氨基酸残基：所述氨基 酸残基可参与和包含相同的CH3区氨基酸序列的其它肽形成二硫键或者共价或稳定非共 价重链间键。
9. 权利要求8的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQ ID NO: 19所示的序列，其中该 CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换：238位的Arg(R)已被Gln(Q)取 代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q) 已被Glu (E)取代；和328位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
10. 权利要求9的体外方法，其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。
11. 权利要求1-6或8中任一项的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQ ID NO: 19所 示的序列，但是其中292位的Lys (K)已被Tyr (W)或Phe (F)取代。
12. 权利要求8的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQ ID NO: 20所示的序列，其中该 CH3已区被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换：234位的Arg(R)已被Gln(Q)取 代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Lys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gln(Q) 已被Glu (E)取代；和324位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
13. 权利要求12的体外方法，其中234位的Arg(R)已被Gin (Q)取代。
14. 权利要求12的体外方法，其中234位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；且324位的 Pro (P)已被 Leu (L)取代。
15. 权利要求12的体外方法，其中发生了全部5种取代。
16. 权利要求8的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQ ID NO: 21所示的序列，其中该 CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换：285位的Arg(R)已被Gln(Q)取 代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys(K)取代；327位的Met(M) 已被Val (V)取代；339位的Lys (K)已被Arg (R)取代；349位的Gin (Q)已被Glu (E)取代； 352位的Ile(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位的Phe(F)已 被Tyr (Y)取代；和375位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
17. 权利要求16的体外方法，其中285位的Arg(R)已被Gin (Q)取代。
18. 权利要求16的体外方法，其中285位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；和375位的 Pro (P)已被 Leu (L)取代。
19. 权利要求16的体外方法，其中发生了全部10种取代。
20. 权利要求1、3-7中任一项的体外方法，其中所述第一抗体是IgG4抗体。
21. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第二抗体在核心铰链区中包含CPPC 序列。
22. 权利要求1-20中任一项的体外方法，其中所述第二抗体包含IgG4-样核心铰链区。
23. 权利要求1-20或22中任一项的体外方法，其中所述第二抗体是在核心铰链区中包 含CX&C序列的抗体，其中&和X 2可以是任何氨基酸，但X :和X 2不能都是脯氨酸。
24. 权利要求23的体外方法，其中所述第二抗体是在核心铰链区中包含CX 3PC或CPX3C 序列的抗体，其中乂3可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
25. 权利要求23的体外方法，其中所述第二抗体是在核心铰链区中包含CSPC、CPSC、 CRPC或CPRC序列的抗体。
26. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第二抗体包含IgG4 CH3区。
27. 权利要求1-25中任一项的体外方法，其中所述第二抗体包含非IgG4同种型的CH3 区，其中该CH3序列不包含或者已被修饰而不包含任何如下所述的氨基酸残基：所述氨基 酸残基可参与和包含相同的CH3区氨基酸序列的其它肽形成二硫键或者共价或稳定非共 价重链间键。
28. 权利要求27的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQ ID N0:19所示的序列，其中该 CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换：238位的Arg(R)已被Gln(Q)取 代；239位的Asp(D)已被Glu(E)取代；292位的Lys(K)已被Arg(R)取代；302位的Gln(Q) 已被Glu (E)取代；和328位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
29. 权利要求28的体外方法，其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。
30. 权利要求21-27中任一项的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQ ID NO: 19所示 的序列，但是其中292位的Lys (K)已被Tyr (W)或Phe (F)取代。
31. 权利要求27的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQ ID N0:20所示的序列，其中该 CH3区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换：234位的Arg(R)已被Gln(Q)取 代；276位的Met(M)已被Val(V)取代；288位的Lys(K)已被Arg(R)取代；298位的Gln(Q) 已被Glu (E)取代；和324位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
32. 权利要求31的体外方法，其中234位的Arg(R)已被Gin (Q)取代。
33. 权利要求31的体外方法，其中234位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；且324位的 Pro (P)已被 Leu (L)取代。
34. 权利要求31的体外方法，其中发生了全部5种取代。
35. 权利要求27的体外方法，其中所述CH3区具有如SEQ ID NO:21所示的序列，其 中该CH3区已被修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换：285位的Arg(R)已被 Gln(Q)取代；314位的Ser(S)已被Asn(N)取代；322位的Asn(N)已被Lys(K)取代；327 位的Met(M)已被Val(V)取代；339位的Lys(K)已被Arg(R)取代；349位的Gln(Q)已被 Glu(E)取代；352位的Ile(I)已被Val(V)取代；365位的Arg(R)已被His(H)取代；366位 的Phe (F)已被Tyr (Y)取代；和375位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
36. 权利要求35的体外方法，其中285位的Arg(R)已被Gin (Q)取代。
37. 权利要求35的体外方法，其中285位的Arg(R)已被Gin (Q)取代；和375位的 Pro (P)已被 Leu (L)取代。
38. 权利要求35的体外方法，其中发生了全部10种取代。
39. 权利要求1-20或22-26中任一项的体外方法，其中所述第二抗体是IgG4抗体。
40. 权利要求1或2的体外方法，其中所述第一抗体在核心铰链区中包含CPPC，并包含 IgG4-样CH3区；且其中所述第二抗体在核心铰链区中包含CPPC，并包含IgG4-样CH3区。
41. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述第一抗体和/或所述第二抗体是人 类抗体。
42. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中对步骤c)中的条件进行选择，使核心铰 链区之外不发生显著的二硫桥还原或异构化。
43. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤c)包括添加还原剂。
44. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤c)包括添加从下组选出的作用剂： 谷胱甘肽、L-半胱氨酸、二硫苏糖醇、0 -巯基乙醇和半胱胺。
45. 权利要求43或44的体外方法，其中所述作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液 的氧化还原势等于或者还原性更高于在实施例31所述的条件下1 y M谷胱甘肽产生的氧化 还原势，例如等于或者还原性更高于由10 U M谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者 还原性更高于由50 y M谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由0. ImM 谷胱甘肽产生的氧化还原势。
46. 权利要求43或44的体外方法，其中所述作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液 的氧化还原势等于或者还原性更高于在实施例35所述的条件下由ImM谷胱甘肽产生的氧 化还原势，例如等于或者还原性更高于由2mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者 还原性更高于由4mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由6mM谷胱 甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由8mM谷胱甘肽产生的氧化还原势， 例如等于或者还原性更高于由10mM谷胱甘肽产生的氧化还原势。
47. 权利要求45或46的体外方法，其中所述作用剂的浓度使得步骤c)中产生的溶液 的氧化还原势等于或者还原性低于于由1M谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还 原性低于由100mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，等于或者还原性低于由15mM谷胱甘肽产生 的氧化还原势。
48. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤c)包括在还原型谷胱甘肽的存在下 在20°C或更高的温度下，例如在37°C下，温育所述抗体至少1小时，例如至少2小时，例如 至少5小时，例如至少10小时。
49. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中在所得的组合物中少于10%，例如少于 5%，例如少于2%，例如少于1 %的抗体分子处于聚集状态。
50. 前述权利要求中任一项的体外方法，还包括使步骤c)中获得的组合物处于非还原 性条件下，以便停止进一步的半分子交换的步骤。
51. 前述权利要求中任一项的体外方法，还包括使双特异性抗体稳定化的步骤，优选地 采用选自下组的方法： a) 铰链区中半胱氨酸的化学交联，b) 半分子上碳水化合物侧链的化学交联，和c) CH3区中不对称地引入的半胱氨酸的交联。
52. 前述权利要求中任一项的体外方法，还包括纯化双特异性抗体的步骤，优选地在非 还原性条件下实施。
53. 前述权利要求中任一项的体外方法，还包括将所得的双特异性抗体配制成用于治 疗应用的药物组合物的步骤。
54. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中第一抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞 蛋白的结合特异性，例如针对 erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD38、CD4 或 CXCR5或针对⑶79a或⑶79b的结合特异性。
55. 权利要求54的体外方法，其中第二抗体具有针对肿瘤细胞或肿瘤细胞蛋白的结合 特异性，例如针对 erbBl、erbB2、erbB3、erbB4、MUC-1、CD19、CD20、CD4 或 CXCR5 的结合特 异性。
56. 权利要求54的体外方法，其中第一抗体具有针对erbBl的结合特异性，且第二抗体 具有针对erbB2的结合特异性。
57. 权利要求54的体外方法，其中第一抗体具有针对CD19的结合特异性，且第二抗体 具有针对CD20的结合特异性。
58. 权利要求54的体外方法，其中第一抗体具有针对CD4的结合特异性，且第二抗体具 有针对CXCR5的结合特异性。
59. 权利要求54的体外方法，其中第一抗体具有针对CD38的结合特异性，且第二抗体 具有针对CD34的结合特异性。
60. 权利要求1-53中任一项的体外方法，其中第一抗体具有针对病原微生物的结合特 异性。
61. 权利要求54或60的体外方法，其中第二抗体具有针对效应细胞蛋白质的结合特异 性，例如针对⑶3、⑶25、⑶28、⑶16、⑶89、⑶32或⑶1的结合特异性。
62. 权利要求54的体外方法，其中第二抗体具有针对化疗剂的结合特异性。
63. 权利要求54的体外方法，其中第二抗体具有针对血液蛋白例如血清白蛋白，或针 对脑蛋白例如铁传递蛋白，或针对肝蛋白的结合特异性。
64. 权利要求54的体外方法，其中第二抗体具有针对参与凝血的蛋白质例如组织因子 的结合特异性。
65. 前述权利要求中任一项的体外方法，其中第一和/或第二抗体连接于从下组选出 的化合物：细胞毒剂；放射性同位素；前体药物或药物，例如紫杉烷；细胞因子；趋化因子和 补体，例如Clq。
66. -种用于产生双特异性抗体的体外方法，所述方法包括如下步骤： a) 提供具有第一结合特异性的第一抗体，其中所述第一抗体包含核心铰链区中的 CPPC序列以及IgG4CH3区，b) 提供具有不同于所述第一结合特异性的第二结合特异性的第二抗体，其中所述第二抗体包含核心铰链区中的CPPC序列以及IgG4CH3区，c) 在允许核心铰链区中的半胱氨酸进行二硫键异构化的还原条件下共同温育所述第 一和第二抗体，和d) 获得双特异性抗体。
67. 权利要求66的体外方法，其中在步骤c)中已添加还原剂，其中该还原剂的浓度使 得步骤c)中产生的溶液的氧化还原势等于或者还原性更高于在实施例35所述的条件下由 ImM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由2mM谷胱甘肽产生的氧化 还原势，例如等于或者还原性更高于由4m M谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还 原性更高于由6mM谷胱甘肽产生的氧化还原势，例如例如等于或者还原性更高于由8mM谷 胱甘肽产生的氧化还原势，例如等于或者还原性更高于由10mM谷胱甘肽产生的氧化还原 势。
68. -种分离的双特异性抗体，其是通过前述任一项权利要求的方法获得的，或者可以 通过前述任一项权利要求的方法获得。
69. -种分离的双特异性抗体，其包括两个IgG4-样CH3区。
70. 权利要求69的双特异性抗体，其中该抗体在核心铰链区中包含一个或两个CPPC序 列。
71. 权利要求69的双特异性抗体，其中该抗体在核心铰链区中包含一个或两个CX J2C 序列，其中&和X 2可以是任何氨基酸，但X :和X 2不能都是脯氨酸。
72. 权利要求69的双特异性抗体，其中该抗体在核心铰链区中包含一个或两个CX 3PC 或CPX3C序列，其中&可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。
73. 权利要求69的双特异性抗体，其中该抗体在核心铰链区中包含一个或两个CSPC、 CPSC、CRPC 或 CPRC 序列。
74. 权利要求69-73中任一项的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区是非IgG4 同种型的，其中该CH3序列不包含或者已被修饰而不包含任何如下所述的氨基酸残基：所 述氨基酸残基可参与和包含相同的CH3区氨基酸序列的其它肽形成二硫键或者共价或稳 定非共价重链间键。
75. 权利要求74的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区具有如SEQ ID NO: 19 所示的序列，其中该CH3区已被修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换：238位的 Arg(R)已被 Gln(Q)取代；239 位的 Asp(D)已被 Glu(E)取代；292 位的 Lys(K)已被 Arg(R) 取代；302位的Gin (Q)已被Glu (E)取代；和328位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
76. 权利要求75的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区具有如SEQ ID NO: 19所 示的序列，但是其中292位的Lys(K)已被Arg(R)取代。
77. 权利要求74的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区具有如SEQ ID NO: 19所 示的序列，但是其中292位的Lys (K)已被Tyr (W)或Phe (F)取代。
78. 权利要求74的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区具有如SEQ ID NO:20 所示的序列，其中该^^区已被修饰从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换：234位的 Arg(R)已被 Gln(Q)取代；276 位的 Met(M)已被 Val(V)取代；288 位的 Lys(K)已被 Arg(R) 取代；298位的Gin (Q)已被Glu (E)取代；和324位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
79. 权利要求74的双特异性抗体，其中234位的Arg(R)已被Gin (Q)取代。
80. 权利要求74的双特异性抗体，其中234位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；且324位 的Pro (P)已被Leu (L)取代。
81. 权利要求74的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区具有如SEQ ID NO:21 所示的序列，其中该CH3区已被修饰，从而发生了一种或多种如下的氨基酸替换：285位的 八找(1〇已被6111((>))取代；314位的561'(5)已被4811〇'〇取代 ；322位的4811〇'〇已被1^(1() 取代；327位的Met (M)已被Val (V)取代；339位的Lys (K)已被Arg (R)取代；349位的 Gln(Q)已被 Glu(E)取代；352 位的 Ile(I)已被 Val(V)取代；365 位的 Arg(R)已被 His(H) 取代；366位的Phe (F)已被Tyr (Y)取代；且375位的Pro (P)已被Leu (L)取代。
82. 权利要求81的双特异性抗体，其中285位的Arg(R)已被Gin (Q)取代。
83. 权利要求81的双特异性抗体，其中285位的Arg(R)已被Gin(Q)取代；且375位 的Pro (P)已被Leu (L)取代。
84. 权利要求69-73中任一项的双特异性抗体，其中第一和/或第二CH3区是IgG4CH3 区。
85. 权利要求68-84中任一项的双特异性抗体，其中核心铰链区和CH3区外部的序列属 于选自下组的同种型：IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。
86. -种药物组合物，其包括权利要求69-85中任一项的双特异性抗体。
87. 权利要求86的组合物，其用作药物。
88. 权利要求86的组合物，其用作用于治疗癌症的药物。
89. 通过权利要求1-67中任一项的方法获得的或者可以通过权利要求1-67中任一项 的方法获得的双特异性抗体或者权利要求68-85中任一项的双特异性抗体在制备用于治 疗癌症的药物中的用途。
90. -种用于选择具有期望性质的双特异性抗体的方法，所述方法包括如下步骤： a) 提供一系列抗体，其中每种抗体具有不同的靶标特异性，并且其中每种抗体包含 IgG4-样 CH3 区，b) 在还原条件下将所述系列中的每种抗体与所述系列中的另一种抗体进行温育，从而 产生一系列的抗体混合物，其中每种混合物包含不同的双特异性抗体，c) 测定所得的一系列抗体混合物的给定的期望性质，和d) 选择具有所述期望性质的双特异性抗体混合物。
91. 权利要求90的方法，其中步骤b)具有权利要求2-67中对步骤c)所进一步限定的 一种或多种性质。
92. 权利要求90或91的方法，其中所述期望性质是肿瘤细胞杀伤。
【文档编号】A61K39/395GK104497143SQ201410696516
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2008年3月28日 优先权日:2007年3月29日
【发明者】贾尼.舒尔曼, 汤姆.文克, 简.V.D.温克尔, 阿兰.F.拉布里金, 罗布.阿伯斯, 马里金.V.D.N.科尔夫肖滕, 保罗.帕伦 申请人:根马布股份公司