专利名称：一株葡糖酸醋酸杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株葡糖酸醋酸杆菌及其应用，特别是涉及一株葡糖酸醋酸杆菌及利用该菌株生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法。
背景技术：
红茶菌(kombucha)，又名红茶菇、茶霉菌、海宝，是以含糖的茶叶浸出液通过微生物发酵制成的一种民间传统酸性饮料。红茶菌是多菌种的发酵产品，菌种主要是酵母菌、醋酸菌和乳酸菌。经研究，红茶菌具有防病治病、延年益寿的保健作用，如它具有增强机体免疫力、长寿、减少皱纹、防癌、抗癌、减肥、润滑肠道、增强心脑肝肾的功能、降血压、安眠、帮助消化、化结石、软化血管等功效；所涉及的能够预防和治疗的疾病至少有二三十种，如它可以治疗和预防癌症、由病毒和细菌引起的各种疾病(如感冒)、便秘、痔疮、风湿性关节炎、胃炎、因胃酸分泌不足引起的消化功能障碍、食欲减退、头痛、神经失调、失眠、慢性疲劳综合症、结石(包括肾结石、胆结石、尿道结石)、高血压及其并发症、糖尿病等。
在胃的酸性pH(2-4.7)下，部分D-葡萄糖二酸及其相关衍生物可慢慢转变成D-葡萄糖二酸1，4内酯。D-葡萄糖二酸1，4内酯是红茶菌中一种很重要的功能因子(Michael R.Roussin，Analyses of KombuchaFermentsReport on Growers，http//persweb.direct.ca/chaugen/kombucha-research-mroussin2toc.htmL)。经研究，D-葡萄糖二酸1，4内酯可大大减少有害物质对肝素、透明质酸、硫酸粘多糖以及葡萄糖醛酸的破坏能力，利于机体更有效地排出毒素，从而起到防癌抗癌、缓解因关节炎、痛风、气喘及相关组织功能下降引起的不适等作用。
D-葡萄糖二酸1，4内酯对葡萄糖苷酸酶具有抑制作用。Kim等人在对结肠癌患者的研究中发现，癌症是由一些酶(如β-葡萄糖苷酸酶)进入肠道而诱发的。肠道中的β-葡萄糖苷酸酶可将致癌物前体转化为致癌物，因它可水解葡萄糖醛酸以及内源和外源毒素、胆红素、苯并芘等的结合体—葡萄糖苷酸。
此外，在Gupta和Singh的研究实验中发现，D-葡萄糖二酸1，4内酯的作用浓度和作用底物不同，结果也不同。如0.0017mM的D-葡萄糖二酸1，4内酯就能显著抑制人的精液和血浆中β-葡萄糖苷酸酶(Gupta-GS，Singh-GP.Isolation andcharacterization of the major form of beta-glucuronidase from human seminaland plasma.Biochem-Biophys-Acta，1983，748(3)398-404)。Kim等人研究发现，0.03-0.15mg/mL的D-葡萄糖二酸1，4内酯就能显著抑制正常人和结肠癌患者肠道中以及粪便中葡萄糖苷酸酶的活性，从而解释出红茶菌具有解毒、抗癌作用的原因(Kim-DH，Jin-YH，Jung-EA et al.Purification and characterization ofbeta-glucuronidase from Escherichia coli HGU-3，a human intestinal bacterium.Biol-Pharm-bull，1995，18(9)1184-1188)。Zenser-TV等人在对人体中的和大肠杆菌中的β-葡萄糖苷酸酶对联苯胺和4-氨基双苯的葡萄糖苷酸的水解作用的研究中发现，0.5mM的D-葡萄糖二酸1，4内酯就可完全抑制水解作用(Zenser-TV，Lakshmi-VM，Davis-BB. Human and Escherichia coli beta-glucuronidasehydrolysis of glucuronide conjugates of benzidine and 4-aminobiphenyl，andtheir hydroxy metabolites.Drug-Metab-Dispos，1999，27(9)1064-1067)。上述研究结果表明，D-葡萄糖二酸1，4内酯在较低浓度时就可起到很好的解毒、抗癌作用。
红茶菌含有D-葡萄糖二酸1，4内酯，但是，由于红茶菌中含有膜醋菌，发酵生产时在液体表面会生成一层细菌纤维素膜，因此目前红茶菌的生产以家庭小规模液体静止培养为主，还未形成大规模工业化生产，而且其中生成D-葡萄糖二酸1，4内酯的具体菌株还不清楚。
1996年，YAMADA基于16SrRNA部分序列的不同将葡糖酸醋酸杆菌亚属(Gluconacetobacter)提升到葡糖酸醋酸杆菌属(Yamada，Y.，Hoshino，K.andIshikawa，T.The phylogeny of acetic acid bacteria based on the partialsequences of 16S ribosomal RNAthe elevation of the subgenusGluconoacetobacter to the generic level.Biosci.Biotechnol.Biochem，1997，611244-1251)。
发明内容
本发明的目的是提供一株新的葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)。
本发明所提供的葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)名称为Jlab A4，已于2004年05月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 1157。
该菌株具有产生D-葡萄糖二酸1，4内酯的能力；该菌株的细胞呈杆状，革兰氏阴性；运动；好氧；最适生长温度30℃；不能产生氧化酶；不能氧化乙酸或乳酸生成CO2和H2O；可以α-D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、甘油、D-果糖、甲酸、山梨糖醇、阿糖醇、甘露醇、丙酮酸甲酯、D，L-乳酸或赤藓糖醇为唯一碳源；DNA中G+C mol％含量为59.5％；其16SrDNA具有序列表中序列1的多核苷酸序列，以其16SrDNA全序列为基础的系统发育树如图1所示(标尺为1％的碱基差异)。
本发明的另一个目的是提供一种生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法。
本发明所提供的生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法，是在糖茶水培养基中培养葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157得到D-葡萄糖二酸1，4内酯。
所述糖茶水培养基包括碳源，茶叶浸出液和水，pH 4-7；所述碳源选自下述化合物中的至少一种葡萄糖，果糖，葡萄糖酸，果葡糖浆，山梨糖醇，阿糖醇和甘露醇；所述碳源的终浓度为5-25g/100ml，所述茶叶浸出液中的固形物的终浓度为0.5-2.0波美度(°Bx)。
所述碳源的终浓度优选为5g/100ml。所述碳源优选为葡萄糖。
所述茶叶浸出液可按如下方法制备将茶叶经90-100℃的水连续浸泡2-3次，每次10-15min，除去茶渣，得到浸出液。
所述茶叶可为不发酵茶，半发酵茶，全发酵茶和后发酵茶中的一种或任意组合，也可为由上述茶加工而来的后加工茶，固形物浓度为0.5-2.0波美度。所述水可为蒸馏水、自来水或井水等一般可饮用的水。
所述葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的接种量无特别限制，一般为105-107个细胞/mL培养基。
所述葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的培养条件为20-35℃培养5-12天。其中，所述培养温度优选为25-30℃。
所述葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157可以120-200rpm的转速振荡培养5-8天，也可静止培养8-12天。
由葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157发酵上述糖茶水培养基得到的发酵制品也属于本发明的保护范围。
所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品；所述发酵制品可采用颗粒、胶囊、片剂等固体外形或是糊状、胶状、液体等流体外形。
本发明的葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157具有较高的D-葡萄糖二酸1，4内酯的生产能力，且其发酵工艺简单、稳定、成本低廉，产量高(3-5mg/mL)；在D-葡萄糖二酸1，4内酯、D-葡萄糖二酸1，4内酯保健食品的生产中具有广阔的工业应用和市场前景。
图1为以16SrDNA全序列为基础的CGMCC № 1157的系统发育树状2为D-葡萄糖二酸1，4内酯标准品的气相色谱3为D-葡萄糖二酸1，4内酯标准品气相色谱图中2#峰的质谱4为Gluconacetobacter sp.Jlab A4菌株发酵样品的气相色谱5为Gluconacetobacter sp.Jlab A4菌株发酵样品气相色谱图中3#峰的质谱图具体实施方式
实施例1、葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)CGMCC № 1157的筛选醋酸杆菌固体培养基葡萄糖100g，酵母浸出物10g，碳酸钙20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH6.8，121℃灭菌15min。
糖茶水培养基5g/100ml葡萄糖，固形物终浓度为0.5波美度茶叶浸出液，pH4.9。
葡糖酸醋酸杆菌Jlab A4(Gluconacetobacter sp.)的筛选步骤如下一、初步筛选1、将已活化的红茶菌混合菌种(在北京民间采样)振荡混匀后，取10mL菌液及一小块菌膜放入带玻璃珠的90mL无菌水中，充分振荡混匀；吸取5mL至45mL无菌水中，混匀后依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，分别吸取10-4、10-5和10-6三个稀释度的菌液各0.1mL涂布于醋酸杆菌固体培养基中，每个稀释度平行涂三个板，在30℃培养，观察生长情况，镜检选取不同菌株的单菌落，分别接种于糖茶水培养基中进行发酵培养，然后按下述步骤2进行D-葡萄糖二酸1，4内酯的检测。
2、样品中D-葡萄糖二酸1，4内酯的检测1)仪器设备(1)Shimadzu GCMS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪(2)色谱柱DB-WAX 50m×0.32mm×0.25um极性柱(3)TDL-5-A型台式离心机上海安亭科学仪器厂2)气相色谱-质谱分析条件(1)气相色谱条件进样口温度(250℃)；载气(高纯度氦气)，线速度(40cm/s)；柱温(初始50℃，以后每分钟升12℃，至220℃后保持8分钟)(2)质谱条件EI离子源，离子源温度为200℃；接口温度与进样口温度相同；电子能量70eV；质量范围(45-500amu)
3)待测样品处理及标样配制(1)待测样品处理将经菌株发酵得到的红茶菌样品3000rpm离心15min后，准确吸取1mL上清液至50mL小三角瓶中，置于真空干燥器中90℃真空干燥至恒重，取出后向三角瓶中加入4mL甲醇将瓶内物质完全溶解后，再次3000rpm离心15min，取上清液用于测定。
(2)标样配制准确称取D-葡萄糖二酸1，4内酯100.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL，使浓度为10000mg/L，分别从中吸取5.0mL、2.0mL、0.5mL、0.1mL，分别定容至10mL，配制成浓度分别为5000mg/L、2000mg/L、500mg/L和100mg/L的D-葡萄糖二酸1，4内酯标准溶液。
4)检测结果先比较样品与D-葡萄糖二酸1，4内酯标准品的气相色谱图，其中标准品的保留时间为11.033min(图2)，若样品的保留时间约为11.033min时也出峰，则进一步比较标准品色谱图中保留时间为11.033min的峰的质谱图(图3)与样品色谱图中保留时间约为11.033min的峰的质谱图，若两者相同，则可以确定该样品中存在D-葡萄糖二酸1，4内酯。通过对发酵液中D-葡萄糖二酸1，4内酯的检测，表明分离得到的酵母菌和乳酸菌都不具有产生D-葡萄糖二酸1，4内酯的能力，只有分离得到的醋酸菌能产生D-葡萄糖二酸1，4内酯。但是由于醋酸菌仍然是菌株的复合体，因此确定其中产生D-葡萄糖二酸1，4内酯的菌株是非常必要的。
二、二次筛选将经初筛的醋酸菌的多个菌株分别用糖茶水培养基发酵，然后按步骤一的方法测定不同菌株产生D-葡萄糖二酸1，4内酯的能力，选出其中产量最高的菌株。检测结果表明D-葡萄糖二酸1，4内酯产量较高的菌株是Jlab A1、Jlab A2、Jlab A3、Jlab A4、Jlab A5、Jlab A6、Jlab A7、Jlab A8、Jlab A9和Jlab A10，且Jlab A4菌株D-葡萄糖二酸1，4内酯的产量最高，该菌株的检测结果如图4和图5所示。
对筛选出的功能因子-D-葡萄糖二酸1，4内酯产量最高的菌株Jlab A4的表型特征和核酸特征(G+C mol％和16SrDNA全序列分析)进行系统地鉴定，结果表明该菌株的基因组DNA中G+C mol％含量为59.5％，其中16SrDNA具有序列表中序列1的多核苷酸序列；采用MicroStation自动微生物鉴定仪(Biolog公司)及GN2微孔鉴定板对其进行唯一碳源的测定，所用95种碳源如表1所示，结果表明该菌株可以α-D-葡萄糖、D-葡萄糖酸、甘油、D-果糖、甲酸、山梨糖醇、阿糖醇、甘露醇、丙酮酸甲酯、D，L-乳酸或赤藓糖醇为唯一碳源；该葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobactersp.)Jlab A4已于2004年05月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC № 1157。
表1.GN2微孔鉴定板
实施例2、葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的发酵生产包括以下步骤1、葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157种子液的培养醋酸杆菌液体培养基葡萄糖100g，酵母浸出物10g，碳酸钙20g，蒸馏水1000ml，pH6.8，121℃灭菌15min。
用接种环从斜面挑取1环该菌种接于10mL醋酸杆菌液体培养基中，在30℃振荡培养24h，然后按20％(体积比)的比例将其接种于糖茶水培养基中连续进行两次扩大培养，在30℃振荡培养24h。
2、发酵糖茶水培养基固形物浓度为0.5波美度的云南滇红茶叶浸出液，5g/100ml葡萄糖，pH4.9。
将步骤1的种子液按10％(体积比)的比例接种于糖茶水培养基(pH4.9)(250mL三角瓶装150mL培养基)中，在25℃静止培养8天，发酵结束后测定发酵液中D-葡萄糖二酸1，4内酯的含量为3.00mg/mL。
实施例3、葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的发酵生产包括以下步骤1、葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157种子液的培养同实施例2。
2、发酵将步骤1的种子液按10％(体积比)的比例接种于糖茶水培养基(除pH4.0外，其它同实施例2)(250mL三角瓶装150mL培养基)中，在25℃、160rpm振荡培养6天，发酵结束后测定发酵液中D-葡萄糖二酸1，4内酯的含量为3.46mg/mL。
实施例4、葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的发酵生产包括以下步骤1、葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157种子液的培养同实施例2。
2、发酵将步骤1的种子液按10％(体积比)的比例接种于糖茶水培养基(除pH 4.0外，其它同实施例2)(250mL三角瓶装50mL培养基)中，在25℃、160rpm振荡培养6天，发酵结束后测定发酵液中D-葡萄糖二酸1，4内酯的含量为4.29mg/mL。
实施例5、葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的发酵生产包括以下步骤1、葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157种子液的培养同实施例2。
2、发酵将步骤1的种子液按10％(体积比)的比例接种于糖茶水培养基(除pH4.9外，其它同实施例2)(250mL三角瓶装150mL培养基)中，在25℃、160rpm振荡培养6天，发酵结束后测定发酵液中D-葡萄糖二酸1，4内酯的含量为3.20mg/mL。
序列表<160>1<210>1<211>1383<212>DNA<213>葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter)<400>1tgcttaacac atgcaagtcg cacgaacctt tcggggttag tggcggacgg gtgagtaacg 60cgtagggatc tgtccatggg tgggggataa ctttgggaaa ctgaagctaa taccgcatga 120cacctgaggg tcaaaggcgc aagtcgcctg tggaggaacc tgcgttcgat tagctagttg 180gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgatgatc gatagctggt ctgagaggat gatcagccac 240actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa 300tgggcgcaag cctgatccag caatgccgcg tgtgtgaaga aggttttcgg attgtaaagc 360actttcagcg gggacgatga tgacggtacc cgcagaagaa gccccggcta acttcgtgcc 420agcagccgcg gtaatacgaa gggggcaagc gttgctcgga atgactgggc gtaaagggcg 480cgtaggcggt tttaacagtc agatgtgaaa ttcctgggct taacctgggg gctgcatttg 540atacgttgag actagagtgt gagagagggt tgtggaattc ccagtgtaga ggtgaaattc 600gtagatattg ggaagaacac cggtggcgaa ggcggcaacc tggctcatta ctgacgctga 660ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga 720tgtgtgctgg atgttgggtg actttgtcat tcagtgtcgt agttaacgcg ataagcacac 780cgcctgggga gtacggccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 840cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccaggg cttgacatgc 900ggaggccgtg tccagagatg ggcatttctc gcaagagacc tccagcacag gtgctgcatg 960gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg1020cctttagttg ccatcacgtt tgggtgggca ctctagagga actgccggtg acaagccgga1080ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttatgt cctgggctac acacgtgcta1140caatggcggt gacagtggga agccaggtag cgataccgag ccgatctcta aaagccgtct1200cagttcggat tgcactctgc aactcgagtg catgaaggtg gaatcgctag taatcgcgga1260tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg1320agttggtttg accttaagcc ggtgagcgaa ccgcaaggac gcagccgacc acggtcgggt1380cag 138权利要求
1.葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157。
2.一种生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法，是在糖茶水培养基中培养葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157得到D-葡萄糖二酸1，4内酯。
3.根据权利要求2所述的生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法，其特征在于所述糖茶水培养基包括碳源，茶叶浸出液和水，pH 4-7；所述碳源选自下述化合物中的至少一种葡萄糖，果糖，葡萄糖酸，果葡糖浆，山梨糖醇，阿糖醇和甘露醇；所述碳源的终浓度为5-25g/100ml，所述茶叶浸出液中的固形物的终浓度为0.5-2.0波美度。
4.根据权利要求3所述的生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法，其特征在于所述碳源的终浓度为5g/100ml；所述碳源为葡萄糖。
5.根据权利要求3或4所述的生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法，其特征在于所述茶叶为不发酵茶，半发酵茶，全发酵茶和后发酵茶中的一种或任意组合或为由上述茶加工而来的再加工茶。
6.根据权利要求3或4所述的生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法，其特征在于所述葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的接种量为105-107个细胞/mL培养基。
7.根据权利要求3或4所述的生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法，其特征在于所述葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157的培养条件为20-35℃培养5-12天。
8.根据权利要求7所述的生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法，其特征在于所述培养温度为25-30℃。
9.根据权利要求7所述的生产D-葡萄糖二酸1，4内酯的方法，其特征在于所述葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157以120-200rpm的转速振荡培养5-8天或静止培养8-12天。
10.由权利要求2-9中任一所述方法得到的发酵制品。
全文摘要
本发明公开了一株葡糖酸醋酸杆菌及其应用。其目的是提供一株新的葡糖酸醋酸杆菌及利用该菌株生产D－葡萄糖二酸1，4内酯的方法。该菌株为葡糖酸醋酸杆菌(Gluco nacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157。用该菌株生产D－葡萄糖二酸1，4内酯的方法，是在糖茶水培养基中培养葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157得到D－葡萄糖二酸1，4内酯。本发明的葡糖酸醋酸杆菌(Gluco nacetobacter sp.)Jlab A4 CGMCC № 1157具有较高的D－葡萄糖二酸1，4内酯的生产能力，且其发酵工艺简单、稳定、成本低廉，产量高(3－5mg/mL)。
文档编号C12N1/20GK1614007SQ200410091488
公开日2005年5月11日 申请日期2004年11月25日 优先权日2004年11月25日
发明者籍保平, 田文礼, 李博, 吴薇, 杨志伟, 盖宝川, 张泓, 周峰 申请人:中国农业大学