专利名称：细胞培养与产品回收的工艺方法及其一体化系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于动物工程细胞产品大规模回收的工艺设备，尤指一种细胞培养与产品回收的工艺方法及其一体化系统。
背景技术：
正如一些科学家预言的，21世纪是生物科学世纪，生命科学与其他学科结合正以前所未有的速度飞速发展。随着生物技术的发展，越来越多的基因重组产品的产业化，已经产生并将继续产生巨大的社会效益和可观的经济效益。生物工程下游技术是生物技术产业化的关键技术，它包括生物工程产品的回收、产品纯化、产品的生产制备和产品质量控制等等。以往的产品传统回收工艺，都是将细胞培养液或是细胞匀浆除去固形成分浓缩后上色谱柱或直接上柱，将产品吸附到色谱柱上，然后洗脱下来，再用高效色谱方法进行精纯化。这对于小规模生产制备是可行的，但不能满足哺乳动物工程细胞大规模连续灌流培养——每天生产几百升、几千升细胞培养上清的大规模生产。
为了减少哺乳动物工程细胞产品的生产步骤，降低生产成本，欧美少数发达国家从20世纪80年代末就开始研究哺乳动物工程细胞的大规模培养和产品回收的一体化工艺。英国伯明瀚大学研究了一套小鼠杂交瘤细胞连续培养与单克隆抗体回收的一体化装置，美国专家也报告了一个生物工程装置，能将工程细胞的大量培养与重组蛋白的纯化一次性完成。他们都是将特定单克隆抗体的抗原用化学方法耦联到吸附介质上，制成抗体亲和流化床色谱注，将亲和柱直接连接到杂交瘤细胞连续灌流培养罐(生物反应器)的出口端，细胞培养上清经过滤网，流经流化床亲和色谱柱，单克隆抗体吸附到色谱柱上，废液从色谱柱的出口端流到废液桶里，然后定期将亲和色谱柱切换下来进行洗脱，收集的单克隆抗体再用高效色谱法进行精纯化。但是，这种生产工艺只适合于回收单克隆抗体获特异抗原等产品，而不适用于其它大多数蛋白质或其它生物大分子的回收，因为大多数蛋白质、核酸采用离子交换色谱柱进行回收更为方便，细胞培养上清在上色谱柱之前，必须调整pH值才能上柱，否则产品不能结合到色谱柱上，也就无法实现细胞培养工艺与产品回收工艺的一体化。另外，抗体亲和色谱柱不便于消毒，在使用过程中抗体会逐渐脱落污染产品，同时要满足大规模生产需要制备大量亲和抗体又需要投入一些人力和设备。
发明内容
本发明的目的是提供一种细胞培养与产品回收的工艺方法，本发明的另一目的是提供一种细胞培养与产品回收的一体化系统，其可适用于离子交换色谱法回收蛋白质或其它生物大分子产品，实现工程细胞连续灌流培养与产品回收的一体化及大规模生产。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案一种细胞培养与产品回收的工艺方法，其方法步骤如下1)将工程细胞依次在方瓶、搅拌瓶、转瓶中培养，待工程细胞密度达到1×105～1×106细胞/ml后转入小B布朗生物反应器中培养，待细胞密度达到5×105～5×106细胞/ml后再转入大B布朗生物反应器培养；2)将在线洗脱阳离子(streamline SP)扩张床色谱柱用平衡缓冲液平衡并扩张到50～70厘米；3)将经过消毒灭菌的细胞培养与产品回收的一体化系统与上述大B布朗生物反应器连接，当工程细胞培养液流入储液罐并达到1/2～2/3体积时，将pH调控仪和加酸碱蠕动泵的电源打开并将pH值设定在5～6之间，打开色谱柱进液蠕动泵电源开关并将流速调至50～100ml/分钟，上柱；4)达到色谱柱允许的容量后切换在线洗脱阳离子(streamliane SP)扩张床色谱柱，并将柱上端与紫外检测器连接，下端连接一个蠕动泵，进行目标蛋白的洗脱，得到重组人尿激酶原粗产品；5)用磷酸盐缓冲液平衡聚苯烯酰胺(Sephacryl S-200HR)凝胶色谱柱一个柱体积，将粗产品上柱，用同种缓冲液继续淋洗，收集蛋白主峰洗脱组分。
所述的步骤4)中目标蛋白的洗脱切换吸附有目标蛋白的色谱柱，将其下端连接一个蠕动泵，上端与紫外检测器连接，用平衡缓冲液将残留的细胞培养液冲洗干净，然后将柱床压缩至原来的体积，再用洗脱缓冲液(0.01mol/L磷酸盐缓冲液，含1mol/L NaCl，pH 7.0)洗脱目标蛋白质，收集洗脱蛋白峰流出液，得到重组人尿激酶原粗产品。
所述的洗脱缓冲液由磷酸盐缓冲液及氯化钠液组合配置而成，其配比为0.01mol/L磷酸盐缓冲液、0.1mol/L氯化钠，pH值为5～6。
一种细胞培养与产品回收的一体化系统，包括接进液管的细胞培养罐，细胞培养罐通过排液管连至储液罐内，再依次通过排液管连至色谱柱及废液罐，在细胞培养罐与储液罐、储液罐与色谱柱间设有蠕动泵，其还设一受控于pH自动调控装置的加酸、加碱的蠕动泵，加碱蠕动泵入口端外接碱液，加酸蠕动泵入口端外接酸液，两台蠕动泵的出口端均接入储液罐内；所述的pH自动调控装置的pH复合电极浸入储液罐内的培养上清液中。
所述的pH自动调控装置由酸度计与适时控制的单片机实时控制系统连接构成。所述的pH自动调控装置由酸度计与编制相应控制程序的单片机实时控制系统连接构成。
在储液灌里安装一个搅拌器。
本发明的优点是(1)本装置适用于大多数动物工程细胞产品的回收；(2)与细胞培养和分别回收产品相比，本发明减少了部分分离设备和人力，可降低生产成本。
图1为本发明系统构成示意2为本发明pH自动调控装置构成原理框图具体实施方式
如图1所示，本发明细胞培养与产品回收的一体化系统，包括接进液管1的细胞培养罐2，细胞培养罐通过排液管连至储液罐3内，再依次通过排液管连至色谱柱4及废液罐5，在细胞培养罐与储液罐、储液罐与色谱柱间设有蠕动泵6，另设受控于一pH自动调控装置的加酸、加碱的蠕动泵7、8，加碱蠕动泵8入口端外接碱液，加酸蠕动泵7入口端外接酸液，两台蠕动泵的出口端均接入储液罐内；所述的pH自动调控装置9的pH复合电极浸入储液罐内的培养上清液面上方。
所述的色谱柱可采用在线洗脱(Streamline)阳离子交换扩张床色谱柱。
参见图2，所述的pH自动调控装置9是把DpH87酸度计(军事医学科学院产品)与8031单片机实时控制系统相连。
所述的8031单片机实时控制系统包括一个中央处理器8031CPU、2764EPROM(系统程序储存器)、2817A EEPROM(电檫储存器，永久保存编程文件数据)、ADC0809(8位8路模数转换芯片，用于pH玻璃电极信号和温度信号的数字化转换)；一片可编程键盘显示接口器件-8279(用于按键和显示人机对话操作)；另外还有两路双向可控硅无触点开关电路(采用光隔离控制模块)，用于控制两台蠕动泵加酸或加碱。酸度计的pH电极及一温度传感器分别经放大器接单片机实时控制系统的模数转换芯片输入端；单片机实时控制系统的两控制输出端分别经两路双向可控硅无触点开关电路控制两台加酸、加碱的蠕动泵。
本装置适用于大多数动物工程细胞产品的回收，且可用于动物工程细胞产品的大规模回收制备。
以下列具体实施例说明使用本发明细胞培养与产品回收的一体化系统装置制备工程细胞连续灌流培养与重组人尿激酶原(rhpro-UK)回收的过程实例1(1)工程细胞培养和回收目标蛋白将CHO工程细胞复苏依次在方瓶、搅拌瓶、转瓶中培养，待工程细胞密度达到1×106细胞/ml后转入B.BRAUN 5升生物反应器中培养，待细胞密度达到5×106细胞/ml再转入B.BRAUN 30升生物反应器培养，然后将经过消毒灭菌的一体化装置按图1与B.BRAUN 30升生物反应器连接，色谱柱事先用平衡缓冲液平衡并扩张起来。当细胞培养液流入储液罐并达到2/3体积时，将pH调控仪和加酸碱蠕动泵的电源打开并将pH值设定在5～6之间，然后打开在线洗脱阳离子(streamliane SP)扩张床色谱柱上样，蠕动泵电源开关并将流速调至40～50ml/分钟(白天上柱，夜晚停止)，每隔3～4天换一个色谱柱。切换5次，共计上样279.5升。
(2)目标蛋白的洗脱吸附有目标蛋白的色谱柱切换下来后，柱下端连接一个蠕动泵，上端与紫外检测器连接(波长280nm)，用平衡缓冲液(0.01mol/L磷酸盐缓冲液，含0.1mol/L NaCl，pH 5～6)将残留的细胞培养液冲洗干净，然后将柱床压缩至原来的体积，再用洗脱缓冲液(0.01mol/L磷酸盐缓冲液，含1mol/L NaCl，pH 7.0)洗脱目标蛋白质，收集洗脱蛋白峰流出液，得到rhpro-UK粗产品(阳离子色谱回收液)。
(3)目标蛋白的精纯化用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(含0.2mol/L NaCl，pH7.0)平衡Sephacryl S-200HR凝胶色谱柱大约一个柱体积，将粗产品上柱，用同种缓冲液继续淋洗，收集蛋白主峰洗脱组分(凝胶色谱回收液)，纯度达到99.98％(HPLC分析)，回收率72.2％，结果列于表1。
表1 一体化装置用于工程细胞连续灌流培养与rhpro-UK回收的结果
*按流出废液计算实例2(1)工程细胞培养和回收目标蛋白将CHO工程细胞复苏依次在方瓶、搅拌瓶、转瓶中培养，待工程细胞密度达到5×105细胞/ml后转入B.BRAUN 5升生物反应器中培养，待细胞密度达到1×106细胞/ml再转入B.BRAUN 30升生物反应器培养，然后将经过消毒灭菌的一体化装置按图1与B.BRAUN 30升生物反应器连接，色谱柱事先用平衡缓冲液平衡并扩张起来。当细胞培养液流入储液罐并达到1/2体积时，将pH调控仪和加酸碱蠕动泵的电源打开并将pH值设定在5～6之间，然后打开在线洗脱阳离子(streamliane SP)扩张床色谱柱进液蠕动泵电源开关并将流速调至40～50ml/分钟(白天上柱，夜晚停止)，每隔3～4天换一个色谱柱。切换8次，共上样410升。
(2)目标蛋白的洗脱及(3)目标蛋白的精纯化同实施例1，纯度达到99.97％(HPLC分析)，回收率94.93％，结果列于表2。
表2 一体化装置用于工程细胞连续灌流培养与重组人尿及酶原回收的结果
*按流出废液计算
权利要求
1.一种细胞培养与产品回收的工艺方法，其特征在于方法步骤如下1)将工程细胞依次在方瓶、搅拌瓶、转瓶中培养，待工程细胞密度达到1×105～1×106细胞/ml后转入小B布朗生物反应器中培养，待细胞密度达到5×105～5×106细胞/ml后再转入大B布朗生物反应器培养2)将在线洗脱阳离子(streamline SP)扩张床色谱柱用平衡缓冲液平衡并扩张到50～70厘米；3)将经过消毒灭菌的细胞培养与产品回收的一体化系统与上述大B布朗生物反应器连接，当工程细胞培养液流入储液罐并达到1/2～2/3体积时，将pH调控仪和加酸碱蠕动泵的电源打开并将pH值设定在5～6之间，打开色谱柱进液蠕动泵电源开关并将流速调至50～100ml/分钟，上柱；4)达到色谱柱允许的容量后切换在线洗脱阳离子(streamliane SP)扩张床色谱柱，并将柱上端与紫外检测器连接，下端连接一个蠕动泵，进行目标蛋白的洗脱，得到重组人尿激酶原粗产品；5)用磷酸盐缓冲液平衡聚苯烯酰胺(Sephacryl S-200HR)凝胶色谱柱一个柱体积，将粗产品上柱，用同种缓冲液继续淋洗，收集蛋白主峰洗脱组分。
2.根据权利要求1所述的细胞培养与产品回收的工艺方法，其特征在于所述的步骤4)中目标蛋白的洗脱切换吸附有目标蛋白的色谱柱，将其下端连接一个蠕动泵，上端与紫外检测器连接，用平衡缓冲液将残留的细胞培养液冲洗干净，然后将柱床压缩至原来的体积，再用洗脱缓冲液(0.01mol/L磷酸盐缓冲液，含1mol/L NaCl，pH 7.0)洗脱目标蛋白质，收集洗脱蛋白峰流出液，得到重组人尿激酶原粗产品。
3.根据权利要求2所述的细胞培养与产品回收的工艺方法，其特征在于所述的洗脱缓冲液由磷酸盐缓冲液及氯化钠液组合配置而成，其配比为0.01mol/L磷酸盐缓冲液、0.1mol/L氯化钠，pH值为5～6。
4.一种细胞培养与产品回收的一体化系统，包括接进液管的细胞培养罐，细胞培养罐通过排液管连至储液罐内，再依次通过排液管连至色谱柱及废液罐，在细胞培养罐与储液罐、储液罐与色谱柱间设有蠕动泵，其特征在于设受控于一pH自动调控装置的加酸、加碱的蠕动泵，加碱蠕动泵入口端外接碱液，加酸蠕动泵入口端外接酸液，两台蠕动泵的出口端均接入储液罐内；所述的pH自动调控装置的pH复合电极浸入储液罐内的培养上清液中。
5.根据权利要求4所述的细胞培养与产品回收的一体化系统，其特征在于所述的pH自动调控装置由酸度计与编制相应控制程序的单片机实时控制系统连接构成。
6.根据权利要求5所述的细胞培养与产品回收的一体化系统，其特征在于所述的单片机实时控制系统包括一中央处理器CPU，一系统程序储存器EPROM，一永久保存编程文件数据的电檫储存器EEPROM，一用于pH玻璃电极信号和温度信号的数字化转换的模数转换芯片，一片可编程键盘显示接口器件；酸度计的pH电极及一温度传感器分别经放大器接单片机实时控制系统的模数转换芯片输入端；单片机实时控制系统的两控制输出端分别经两路双向可控硅无触点开关电路控制两台加酸、加碱的蠕动泵。
7.根据权利要求5所述的细胞培养与产品回收的一体化系统，其特征在于所述的酸度计采用DPH87酸度计。
8.根据权利要求4所述的细胞培养与产品回收的一体化系统，其特征在于所述的储液灌里安装一个搅拌器。
全文摘要
一种细胞培养与产品回收的工艺方法及其一体化系统，该系统包括细胞培养罐，再通过排液管连至储液罐内，依次经排液管连至色谱柱及废液罐，在培养罐与储液罐、储液罐与色谱柱间设蠕动泵，另设受控于一pH调控仪的加酸、加碱的蠕动泵，加酸、加碱蠕动泵入口端分别外接酸、碱液，两泵的出口均接入储液罐内；pH调控仪的pH复合电极浸入储液罐内的培养上清液面中。该工艺方法是将工程细胞培养后平衡并扩张；入储液罐达到预定体积时，打开pH调控仪和加酸、碱蠕动泵、色谱柱进液蠕动泵电源开关，上柱；达到色谱柱允许的容量后切换在线洗脱阳离子扩张床色谱柱，进行目标蛋白的洗脱，得到粗产品；将粗产品上柱，用缓冲液继续淋洗，收集蛋白主峰洗脱组分。
文档编号C12N5/08GK1778900SQ20041009116
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月22日 优先权日2004年11月22日
发明者张正光, 陈昭烈, 武生明, 胡显文, 胥照平, 肖成祖 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所