用于弓形虫感染预防的核苷酸序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于弓形虫感染预防的核苷酸序列及其应用。
【背景技术】
[0002] 刚地弓形虫（Toxoplasmagondii)是一种全球分布的顶复门原虫 (Apicomplexa)，能够入侵包括人类在内的几乎所有的有核温血动物。据报道，世界上有三 分之一的人群感染弓形虫，大多数人呈隐形感染，但免疫力低下或免疫缺陷（HIV携带者， 器官移植者等）病人感染弓形虫却可引起严重的后果。弓形虫急性暴发流行时还可给畜牧 业造成严重的经济损失。目前仍未有治疗弓形虫病的理想药物，因此研制安全有效的抗弓 形虫疫苗在弓形虫病的防治中显得尤为重要。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了用于弓形虫感染预防的核苷酸序 列及其应用，该核苷酸序列能够用于制备弓形虫感染预防的疫苗。
[0004] 本发明提供用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下1)-6)之一的核 苷酸序列：
[0005] 1)序列表中SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列；
[0006] 2)序列表中SEQIDNo. 1中所示的核苷酸序列和IL15的核苷酸序列；
[0007] 3)序列表中SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQIDNo. 2中所示 的核苷酸序列，和序列表中SEQIDNo. 3中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQIDNo. 4中 所示的核苷酸序列，和序列表中SEQIDNo. 5中所示的核苷酸序列；
[0008] 4)序列表中SEQIDNo. 2中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQIDNo. 3中所示 的核苷酸序列，和序列表中SEQIDNo. 4中所示的核苷酸序列，和序列表中SEQIDNo. 5中 所示的核苷酸序列；
[0009] 5)与1)-4)任一所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；
[0010] 6)对上述1)-4)任一所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修 饰的核苷酸序列。
[0011] 本发明的第二个目的是提供重组载体，其包括权利要求1所述的核苷酸序列。
[0012] 优选地，所述载体为PVAX1载体。
[0013] 本发明的第三个目的是提供重组质粒，其包括权利要求1所述核苷酸序列。
[0014] 本发明的第四个目的是提供重组蛋白，其氨基酸序列由权利要求4所述的重组质 粒编码。
[0015] 本发明的第五个目的是提供一种疫苗，其包括权利要求1所述的核苷酸序列。
[0016] 优选地，所述疫苗还包括医学上可接受的载体。
[0017] 本发明的第六个目的是提供上述核苷酸序列、重组载体、重组质粒、重组蛋白、疫 苗在制备用于弓形虫感染预防的药物中的应用。
[0018] 本申请人研宄发现：弓形虫Profilin蛋白是弓形虫入侵宿主细胞过程中的关键 蛋白之一，Profilin蛋白是肌动蛋白动力的调制器，能促进肌动蛋白的聚集，影响弓形虫 的滑行运动，是调节弓形虫动力的关键蛋白。此外它还能被Toll样受体ll(TLRll)识别， 是TLR11的强效激动剂，而TLR11在白介素12(IL-12)的分泌过程中起着重要作用。本 发明中将弓形虫Profilin基因制备成弓形虫核酸疫苗pVAX-profilin，并与弓形虫疫苗 pVAX-ropl6、pVAX-ropl8、pVAX-MIC6、pVAX-CDPK3 及pVAX-IL15 联合应用进行抗弓形虫感 染免疫效果评估。结果显示该疫苗以及联合疫苗均能有效抑制弓形虫脑包囊的产生，取得 了较好的免疫效果。
【具体实施方式】
[0019] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0020] 实施例1
[0021] ( 一）弓形虫RH株pVAX-profilin的制备
[0022] 1.从液氮中取出弓形虫RH虫株，37 °C水浴解冻，腹腔注射昆明小鼠，连续3次传代 后，分别收集感染RH虫株小鼠的腹水于1. 5mL灭菌离心管中，室温6000rpm离心10min，弃 去上清液，置于_80°C冰箱保存沉淀用于提取RNA。按照E.Z.N.A.?TotalRNAKitI(购自 Omega公司）的操作说明提取重组总RNA。
[0023] 2.Profilin基因的扩增：
[0024] 2.1引物设计
[0025] 参照弓形虫prof i 1 in基因序列，设计了扩增弓形虫prof i 1 in基因的引物序列，包 括：
[0026]上游：5,-CGGGGTACCATGTCCGACTGGGACCCTGTTGTCAAGG-3'，
[0027]下游：5'-CCGGAATTCTTAGTACCCAGACTGGTGAAGATACTCG-3'，
[0028] 其中划线部分分别为KpnI和EcoRI酶切位点。
[0029] 2. 2PCR扩增
[0030] 以弓形虫基因组RNA为模板，按照PHmeScript'K)〇neSt印RT-PCR试剂盒（购自 大连宝生物公司）操作说明进行RT-PCR，反应体系为：RNA模板1yL，PrimeScriptIStep EnzymeMixluL，2XoneStepBuffer12.5yL，上、下游引物各 0.5yL，RNasefree ddH209.5yL。RT-PCR反应条件：50°C反转录 30min;94°C预变性 2min;94°C变性lmin， 65. 5°C退火45s，72°C延伸50s，共进行30个循环；最后72°C延伸10min。
[0031] 3.纯化产物的连接及序列测定：将回收纯化后的profilin产物与pMD18按照 pMD? 18-T Vector简易操作步骤说明进行连接，4°C连接过夜或16°C连接8h，连接产物命 名为PMD-profilin。阳性菌株送上海生工生物工程有限公司测序。测序结果显示，扩增的profilin的核苷酸序列参见序列表SEQIDNo. 1。
[0032] 4.质粒小量提取：按天根生化科技（北京）有限公司TIANprepMiniPlasmidKit 的使用说明书进行提取。
[0033] 5?目的片段回收及载体连接：将pVAXI质粒及PMD-profilin重组质粒用KpnI 和EcoRI分别进行双酶切，并进行切胶回收纯化，将profi1in基因片段定向亚克隆到pVAX 载体中，4°C连接过夜。连接产物转化到大肠杆菌DH5a中，将鉴定为阳性的菌株命名为 pVAX-profilin〇
[0034] (二）口￥六乂-1'(^164￥六乂-1'(^184￥六乂-]\〇064￥六乂-〇^1(3及口￥六乂-比15重组质粒的 构建
[0035] 1、PVAX-IL15重组质粒为本实验室保存，取出备用，该重组质粒是参照中国专利 CN103083660A中的方法制备得到的。
[0036] 2、pVAX_ropl6重组质粒的构建：取出复苏的虫体，按照DNA提取试剂盒（购自天 根生化科技有限公司）的操作说明提取虫体总DNA备用。参照弓形虫R0P16基因序列，设 计扩增弓形虫R0P16基因的引物序列，包括：
[0037]上游：5 ' -GAATTCATGAAAGTGACCACGAAAGGGC-3 '，
[0038]下游：5' -TCTAGACTACATCCGATGTGAAGAAAGTTCG-3'，
[0039] 其